Tìm hiểu quy trình phát hiện vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP HCM       KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ VI SINH Sinh viên thực MSSV: 0811110055 : Phạm Thị Bích Ngọc Lớp: 08CSH1 TP Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu sử dụng khóa luận trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Nội dung khóa luận có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải sách, tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu khóa luận Sinh viên thực Phạm Thị Bích Ngọc SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc  i Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1  1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Vai trị thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản Việt Nam giới .3 2.1.1 Vai trò thủy hải sản đời sống người 2.1.2 Tình hình chất lượng thủy hải sản Việt Nam giới .4 2.2 Giới thiệu Vibrio spp 2.2.1 Lịch sử phát Vibrio spp .7 2.2.2 Phân loại Vibrio spp phân bố .9 2.2.2.1 Phân loại Vibrio spp 2.2.2.2 Phân bố .10 2.2.3 Đặc điểm hình thái Vibrio spp 10 2.2.3.1 Đặc điểm chung 10 2.2.3.2 Đặc điểm loài 11 2.2.4 Cấu trúc Vibrio spp 14 2.2.5 Yếu tố độc lực 15 2.2.6 Cơ chế gây bệnh 18 2.2.7 Triệu chứng gây bệnh 21 2.2.7.1 Trên người .21 2.2.7.2 Trên động vật .23 2.2.8 Tình hình nhiễm Vibrio spp thực phẩm thủy hải sản đông lạnh Việt Nam giới 24 2.2.8.1 Tình hình nhiễm Vibrio spp thực phẩm thủy hải sản đông lạnh Việt Nam .24 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc ii Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh 2.2.8.2 Tình hình nhiễm Vibrio spp thực phẩm thủy hải sản đông lạnh giới .24 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 26 3.1 Phương pháp truyền thống 26 3.1.1 Phương pháp định tính 26 3.1.1.1 Nguyên tắc 26 3.1.1.2 Thiết bị dụng cụ 26 3.1.1.3 Môi trường hóa chất 26 3.1.1.4 Quy trình phân tích 28 3.1.1.5 Thuyết minh quy trình .29 3.2 Phương pháp đại 42 3.2.1 Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) 42 3.2.1.1 ELISA gián tiếp (indirect ELISA) 43 3.2.1.2 Sandwich ELISA 44 3.2.1.3 ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) 45 3.2.2 Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) .46 3.2.2.1 Nguyên tắc 47 3.2.2.2 Các giai đoạn phản ứng PCR 47 3.2.3 Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) 51 3.2.4 Kỹ thuật DNA microarray 52 3.2.4.1 Vật liệu phương pháp 53 3.2.4.2 Các bước thực 54 3.2.5 Kỹ thuật RAPD 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 PHỤ LỤC 61 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iii Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADH: Antidiuretic hormone APW :Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water cDNA: Complementary Acid Deoxyribo Nucleic DNA: Acid Deoxyribo Nucleic ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays EU: Liên minh Châu Âu FDA: Food and Drug Administration HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points HLG :Canh Hugh Leifson Glucose KCN:Khu công nghiệp KI:Thạch Kligler Iron KIA: : Klingler Iron Agar KL: Khuẩn lạc KNXK: Kiêm ngạch xuất LDC: Linguistic Data Consortium NAFIQAVED: Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng NST: Nhiễm sắc thể NTTS: Nuôi trồng thủy sản OPNG: o-nitrophenyl-D-galactoside ORF: Open reading frame PCA: Polymerase Chain Reaction TCBS :Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose TSA: Thạch Tryptone Soya TSI: Triple Sugar Iron agar WHO: Tổ chức Y tế Thế giới SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iv Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kim ngạch xuất thủy sản Việt Nam qua thời kỳ Bảng 2.2: Xuất thủy sản Việt Nam vào thị trường EU Bảng 2.3: So sánh khả gây bệnh nhóm vi khuẩn tả 19 Bảng 2.4: Các loài Vibrio bị cho gây bệnh người 20 Bảng 3.1 Các đặc điểm sinh hóa Vibrio cholerea Vibrio parahaemolyticus 31 Bảng 3.2 Phân biệt V cholerae O1 V cholerae non - O1 41 Bảng 3.3 Phân biệt kiểu huyết chủng V.choleraeO1 41 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc v Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Vibrio harvey Hình 2.2: V.parahaemolyticus 12 Hình 2.3: V.cholerae 13 Hình 4: V vulnificus 13 Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae 19 Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh Vibrio bên thể người 21 Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả 22 Hình 2.8: Đi tơm sú bị mịn cụt nhiễm vi khuẩn Vibrio…………………… 23 Hình 2.9: Lớp vỏ kitin tơm mềm có màu xanh 23 Hình 3.1: Phân lập Vibrio CHROMagar 29 Hình 3.2: Phân lập Vibrio mơi trường MacConkey 30 Hình 3.3: Khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio spp mơi trường TCBS…………… 30 Hình 3.4: Kết thử nghiệm TSI/ KIA 32 Hình 3.5: Vibrio cholerae 33 Hình 3.6: Phát vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate 35 Hình 3.7: Phát vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate 35 Hình 3.8: Kết thử nghiệm carbohydrate 36 Hình 3.9: Kết thử nghiệm decarboxylase/dehydrolase 37 Hình 3.10:Kết thử nghiệm Urea 38 Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG…………………………………………… 38 Hình 3.12: Hình thử nghiệm ONPG 39 Hình 3.13: ELISA gián tiếp 44 Hình 3.14: Các bước Sandwich ELISA 45 Hình 3.15: ELISA cạnh tranh 46 Hình 3.16: Các giai đoạn phản ứng PCR 48 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc vi Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thực phẩm nguồn cung cấp lượng, chất dinh dưỡng cần thiết để người sống phát triển Thế thực phẩm nguồn truyền bệnh nguy hiểm, không bảo đảm vệ sinh an toàn Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) vấn đề xã hội nhiều người quan tâm, lẽ VSATTP tác động trực tiếp đến sức khỏe chất lượng sống người ảnh hưởng đến chất lượng phát triển xã hội nòi giống Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có 400 bệnh lây truyền qua thực phẩm khơng an tồn VSATTP đặt lên hàng đầu nghị trình nhiều hội nghị y tế sức khỏe cộng đồng toàn cầu, tình hình gần khơng cải thiện bao nhiêu, giới liên tiếp xảy thiên tai nguồn nước ngày Khi người dân khơng có đủ miếng ăn việc kiểm tra chất lượng mà họ ăn trở thành điều xa vời Tiến sĩ Margaret Chan, Tổng Giám đốc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cho biết tháng Liên hiệp quốc nhận khoảng 200 báo cáo từ 193 quốc gia trường hợp thực phẩm bị nhiễm độc Chất lượng VSATTP đáng lo ngại, nhiều phương tiện thông tin đại chúng phản ánh Việc sử dụng không an tồn phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất chăn ni trồng trọt nơng nghiệp, thủy hải sản cịn phổ biến Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, chủ yếu người bị ngộ độc hấp thu phải thực phẩm độc hại, ví dụ ăn thức ăn bị ôi thiu, thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, không đạt yêu cầu bảo quản khơng tốt Khi đó, loại vi sinh vật (vi khuẩn, virus), nấm mốc ký sinh vật có điều kiện hồnh hành Vi sinh vật yếu tố gây ô nhiễm, vệ sinh an tồn thực phẩm có tới gần 50% trường hợp bị ngộ độc thực phẩm vi sinh vật Trong nhóm vi sinh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc  Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh vật nguy hiểm vi khuẩn chủng Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Vibrio spp, E Coli Listeria đáng sợ Một tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đáng lo ngại ngộ độc nhóm vi khuẩn tả Vibrio spp gây thực phẩm thủy hải sản đông lạnh (tôm, cá, mực…) Chúng nhiễm vào thực phẩm thủy hải sản lúc xem nguồn gốc gây ngộ độc nghiêm trọng giới Vibrio spp gây bệnh dịch tả người, độc tố vi khuẩn gây tiêu chảy nặng nước Bệnh tả vi khuẩn gây có khả bùng phát thành đại dịch thời gian ngắn phạm vi rộng Dịch tả công vào nước Anh vào năm 1848 – 1848 làm 70.000 người chết, đại dịch năm 1854 cướp 1/8 dân số thành phố London Dịch tả vào Peru vào năm 1991, lan truyền sang Ecuador, Colombia, Mexico Nicaragua kết 12.000 người chết Nếu hiểu biết kịp thời ngăn ngừa nguồn lây nhiễm để bảo vệ cộng đồng xung quanh Xuất phát từ thực trạng trên, chấp nhận Khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, chúng tơi xin tiến hành thực khóa luận “Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh” 1.2 Mục đích Nghiên cứu, sâu tìm hiểu vi khuẩn Vibrio spp đưa số phương pháp xác định vi khuẩn Vibrio spp 1.3 Mục tiêu đề tài • Khảo sát cấu trúc Vibrio spp • Khảo sát phân bố Vibrio spp • Tình hình nhiễm Vibrio spp sản phẩm thủy sản giới Việt Nam • Một số phương pháp xác định Vibrio spp SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Vai trò thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản Việt Nam giới 2.1.1 Vai trò thủy hải sản đời sống người Trong năm qua, ngành thủy sản khẳng định ngành kinh tế mũi nhọn có đóng góp quan trọng cho phát triển kinh tế - xã hội nước nhà Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định bền vững Thực phẩm thuỷ hải sản giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia góp phần xố đói giảm nghèo Thực phẩm thuỷ hải sản đánh giá nguồn cung cấp đạm động vật cho người dân Việt Nam Năm 2001, mức tiêu thụ trung bình mặt hàng thuỷ sản người dân Việt Nam 19,4 kg, cao mức tiêu thụ trung bình sản phẩm thịt heo (17,1 kg/người) thịt gia cầm (3,9 kg/người) Số lao động ngành thuỷ sản tăng liên tục từ 3,12 triệu người (năm 1996) lên khoảng 3,8 triệu người năm 2001 (kể lao động thời vụ), vậy, năm tăng thêm 100 nghìn người Xuất thực phẩm thủy hải sản góp phần giúp quốc gia khác bù đắp lượng thiếu hụt lương thực, thực phẩm Kim ngạch xuất toàn ngành nông nghiệp Việt Nam năm 2008 16,237 tỷ USD (Nông sản: 8,42 tỷ; Thủy sản: 4,502 tỷ; Lâm sản: 2,996 tỷ) Trong mặt hàng xuất Việt Nam thủy sản ln đứng vị trí cao Trong số nước có kim ngạch xuất thủy sản lớn Việt Nam nước có tốc độ tăng nhanh Tỷ lệ tăng trưởng trung bình thời kỳ 1992 - 2003 20,4%, mức tăng bình quân năm đạt 9,97% Đến năm 2003, Việt Nam đứng thứ số nước xuất thủy sản lớn giới Năm 1992 xuất thủy sản đạt 308 triệu USD, tới năm 2003 2,2 tỷ USD; năm 2005 vượt mức 2,5 tỷ USD dự tính đến năm 2006 kim ngạch xuất thủy sản đạt 2,8 tỷ USD SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh Multiplex PCR      Thiết lập phản ứng Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC ) PCR phức Giai đoạn 94 94 + V.parahaemolyticus 55 + V.vulnificus 65 +V cholera 60 Primer mở rộng 72 Giai đoạn 3 72 Giai đoạn Biến tính Primer Số chu kỳ :20Ỉ 35 3.2.4 Kỹ thuật DNA microarray Kỹ thuật DNA microarray kỹ thuật lai đoạn cDNA mạch đơn ngắn đánh dấu huỳnh quang , với tập hợp đoạn oligonucleotid biết trình tự gắn vị trí xác định GeneChip để kiểm tra phát trình tự nucleotide (1 gene) Kỹ thuật DNA microray dựa sở đoạn DNA mạch đơn cần nghiên cứu bắt cặp với mẫu dị có trình tự tương đồng theo nguyên lý Chargaff (A liên kết với T, G liên kết với C) tạo nên phân tử lai Dựa vào kỹ thuật phát SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 52 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh huỳnh quang, với máy quét scanner chuyên dụng xác định vị trí phân tử lai 3.2.4.1 Vật liệu phương pháp Các chủng sử dụng phương pháp : V.cholerae 154 serovar 0:1 Inaba Tox (ATCC 14100), V.vulnificus M06-24 (0), V.prahaemolyticus F113 –A, V.parahaemolyticus nhóm huyết (serotype) 03:K6 BCA 98-03372 Sử dụng mơi trường MCPC agar (Modified cellobiose – polymyxin-colistin) TCBS agar (thiosulfate-citrate – bile-sucrose) dùng để thu nhận khuẩn lạc lồi Vibrio • V.cholera ni mơi trường Luria-Bertani agar 37oC • V vulnificus ni mơi trường marine agar 37oC • V.parahaemolyticus ni mơi trường nutrient agar có bổ sung % NaCl 37oC Gene AND xác định: gene AND lấy từ 1ml khuẩn lạc đem ly tâm 9000xg, sau loại bỏ tế bào 550ml dung dịch TE (10mM Tris-Cl, 1mM EDTA [pH8]) Sau ủ, thêm vào 100ml NaCl 5M với 80 ml cetyltrimethylammonium bromide (ACTAB)–NaCl để tạo phức với polysaccharides Các mẫu dò đối tượng gene sử dụng : • V.vulnificus : vvh viuB • V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8 • V.cholerae : ompU, toxR, tcpl • Vibrio cổ điển : hlyA Hỗn hợp PCR phức sau hợp thành biotin – CTP, phản ứng kết thúc cho 5ml dung dịch 0.2M EDTA phản ứng hỗn hợp làm biến tính 95oC phút Chuẩn bị DNA array: pha lỗng đầu dị oligonucleotide đệm Spotting (0.1 M NaH2PO4, 0.2 NaCl, SDS 0.01 %) Mười hai DNA array độc tạo đốm giống SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 53 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh chép mảng Mỗi mảng gồm oligonucleotide chuyên biệt ( khoảng 25 mer ) liên kết với biotin 3.2.4.2 Các bước thực • Thu thập mẫu, phá vỡ màng tế bào tách RNA thơng tin • Phiên mã ngược: thực mã ngược với mồi oligo, enzyme phiên mã ngược dNTP loài tạo nên phân tử cDNA tương ứng với mRNA • Phiên mã in-vitro tạo mạch RNA đánh dấu huỳnh quang: sử dụng T7 RNA polymerase, biotin – CTP, từ mạch đơn cDNA tạo nên khoảng 50 - 100 cRNA – Biotin • Cắt đoạn: đun cRNA – Biotin 98oC phút dung dịch đệm hybridization (4x SSC [1x SSC gồm 15mM NaCl cộng với 0.15 mM sodium citrate] [pH 7.0 ], 5x Denhardt’s soludition [0.1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1 % bovine serum albumin]), cắt thành đoạn cRNA – biotin khoảng 35-200 ribonucleotide • Lai: đoạn cRNA – biotin chuyển lên Genechip chứa mẫu dò cDNA mạch đơn biết trình tự thực phản ứng lai • Nhuộm: rửa genechip để loại bỏ cRNA đánh dấu huỳnh quang khơng lai, sau nhuộm phân tử lai strepavidin-phycoerythrin • Phân tích: GeneChip nhuộm đưa vào thiết bị scanner chuyên dụng quét dự liệu phân tích kết 3.2.5 Kỹ thuật RAPD RAPD kỹ thuật phát tính đa dạng ADN nhân ngẫu nhiên dựa nguyên lý kỹ thuật PCR Khác với PCR thông thường cần phải biết thơng tin trình tự ADN đoạn gen cần nhân để thiết kế đoạn mồi, kỹ thuật RAPD cần lượng nhỏ ADN có nguồn gốc genom đủ Các đoạn mồi tổng hợp dạng decamer, tức oligonucleotit dài 10 nucleotit theo trình tự định Đoạn mồi bắt cặp với ADN khuôn nhiệt độ không cao (khoảng 36oC) có nhiều đoạn ADN khác nhân SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 54 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh Chu trình nhiệt để phát tính đa hình ADN nhân ngẫu nhiên: 95oC – phút, 95oC – phút, 36oC – phút, 72oC – phút, 45 chu kỳ (từ bước đến bước 4), 720C – phút, kết thúc 4oC Mồi sử dụng cho phản ứng RAPD ký hiệu RAPD1 có trình tự sau: RAPD1: 5’- GGTGCGGGAA-3’ (Mồi RAPD1 sàng lọc tổng số mồi cho kết đa hình gen cao nhất) Thành phần tham gia phản ứng RAPD gồm: Nước khử ion vô trùng (18,2 μl), Đệm cho Tag-polymerase (2,5μl), dNTP (2 μl), Mồi RAPD (1μl), Tag-polymerase (0,3 μl), ADN khuôn (ADN tổng số chủng V cholerae – μl) Tổng thể tích cho phản ứng 25 μl Điện di ADN gel agaroza Các đoạn ADN có khối lượng điện tích khác tách di chuyển từ cực âm sang cực dương máy điện di điện trường có điện cường độ thích hợp Hố chất điện di: agaroza 1-1,5% (phụ thuộc vào kích thước phân tử ADN); dung dịch đệm TAE 50X (60,5g Tris base; 14,3ml axit axetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8.0), 10mg/ml bromit ethidium (ethidium bromide -EtBr), đệm tra mẫu 10X (Loading buffer: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3% glyxerol 100% dẫn nước đến ml) Quy trình điện di sau: • Chuẩn bị gel agaroza: Cho 1g agaroza (đối với điện di ADN tổng số sản phẩm PCR) 1,5g (đối với điện di sản phẩm RAPD) vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun cho agaroza tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-600C, đổ dung dịch agaroza vào khay gel điện di có cài sẵn lược Sau 30-60 phút, gel đông cứng, gỡ lược ra, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2mm • Mẫu ADN trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 5:1 có tác dụng tạo mầu để mẫu lắng xuống dưới, tra mẫu vào giếng nhỏ gel, chạy điện di điện ổn định 100V thị ADN chuẩn để xác định trọng lượng phân tử, quan sát di chuyển màu để ngừng trình điện di SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 55 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh • Bản gel lấy nhẹ khỏi khuôn, ngâm khoảng 10 phút dung dịch TAE 1X có EtBr (2mg/ml) máy lắc nhẹ, sau rửa nước, quan sát ánh sáng tử ngoại 254nm máy soi ADN chụp ảnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 56 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình làm khóa luận chúng tơi nhận Vibrio spp loài vi khuẩn nguy hiểm cho người động vật, nhóm vi khuẩn lây nhiễm tất giai đoạn phát triển động vật thủy sản, tất giai đoạn chế biến thực phẩm thủy hải sản gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành thủy hải sản giới Việt Nam, ảnh hưởng đến kinh tế quốc dân Vi khuẩn nguy hiểm đặc biệt độc tố đường ruột Nó gây vụ nhiễm khuẩn đường ruột coi siêu kháng nguyên nguy hiểm bắt đầu triệu chứng sốc độc hại Tóm lại, giới có nhiều loại vi khuẩn nguy hiểm khơng Vibrio spp mà S.aureus, Clostridium botulinum, E.coli, Salmonella Đây vi khuẩn nguy hiểm đến sức khỏe người Việc tìm hiểu nghiên cứu chúng cần thiết để đề biện pháp phịng ngừa thích hợp có lẽ ý thức người biện pháp phòng ngừa hiệu Có phương pháp thơng dụng để xác định vi khuẩn Vibrio spp phương pháp nuôi cấy môi trường đặc trưng, phương pháp ELISA dựa theo nguyên tắc bắt dính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, phương pháp PCR dựa vào việc phát đoạn DNA đặc hiệu vi khuẩn Vibrio sp đưa đến biện pháp phịng ngừa, điều trị thích hợp 4.2 Kiến nghị Trên sở biết mối nguy hại Vibrio spp gây hải sản, mong nhà chức trách cần tiến hành biện pháp kiểm tra nghiêm khắc người làm ăn lấy lợi ích kinh tế đặt lên hàng đầu sử dụng thực phẩm không tươi ngon, không đảm bảo chất lượng kinh doanh hải sản cho người tiêu dùng, nhà chức trách nên thường xuyên kiểm tra sở kinh doanh, mặt hàng hải sản để tiến hành ngăn chặn kịp thời hành vi không qui định SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 57 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn Vibrio spp khác để tổng hợp, đưa phương pháp xác định xác biện pháp phịng ngừa thích hợp cho bệnh động vật thủy sản Nghiên cứu phát triển ứng dụng chế phẩm vi sinh vào lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao chất luợng sản phẩm thủy sản, bảo đảm an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày cao khắt khe xã hội Quá trình kiểm tra chất lượng cần tiến hành thường xuyên tất công đoạn sản xuất cuối cùng, kể giai đoạn phân phối bảo quản Các giai đoạn thủ tục kiểm tra bao gồm : - Nhận diện chuẩn mực chất lượng - Thiết lập tiêu chuẩn chất lượng cho chuẩn mực - So sánh kết với tiêu chuẩn - Đánh giá phân tích sai biệt quan sát thấy - Đề biện pháp sữa chữa Bên cạnh đó, chúng tơi mong người tiêu dùng thật cảnh giác trước lựa chọn loại thực phẩm nói chung hải sản nói riêng Các nhà khoa học cần có thêm nhiều nghiên cứu thong tin rộng rãi phương tiện thông tin đại chúng để người dân có kiến thức nhằm giảm thiếu vụ ngộ độc thực phẩm SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 58 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Bùi Quang Tề, (1996) Bệnh tơm cá giải pháp phịng trị.Tạp chí thuỷ sản số 4/1996 Đỗ thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004) Bệnh học thủy sản NXB Nơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Trần Linh Thước, (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục PGS.TS Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS Bùi Minh Đức, GS.TS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật thực phẩm – kỹ thuật kiễm tra tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm Tài liệu tiếng Anh Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete, (2004) The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana Ghent University, Belgium Tài liệu web http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Sinh_h%E1%BB%8Dc_ph%C3%A2n _t%E1%BB%AD http://www.mekongfish.net.vn/modules/news/article.php?storyid=68 http://www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/thuysanweb/modules/news/article php?storyid=236 http://www.vietlinh.com.vn/kithuat/ca/fishdisease.htm http://kiemnghiemthucpham.blogspot.com/2011/01/28-tcn2002004-vibriocholerae-trong-san.html SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 59 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh http://www.vccimekong.com.vn/VCCICT/folderupload/Bai%20trinh%20bay %20cua%20ong%20To%20Viet%20Chau%20%20Bo%20Nong%20Nghiep%20va%20PTNT.pdf http://www.fishviet.net/fishviet/index.php?page=news&content=11&article=3 http://www.impeqn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=110 1&ID=3669 http://duocphamvn.com/baiviet/6161-28-TCN200-2004-Vibrio-choleraetrong-san-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-tinh.thuoc 10 http://diephv.wordpress.com/2011/05/28/kh%E1%BA%A3o-sats%E1%BB%B1-da-hinh-gen-c%E1%BB%A7a-cac-ch%E1%BB%A7ngvibrio-cholerae-b%E1%BA%B1ng-k%E1%BB%B9-thu%E1%BA%ADt-rapd/ 11 http://www.tut.edu.vn/images/stories/tapchikhoahocungdung/tckhud13/4445.pdf 12 Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC53186/ 13 Http://www.fda.gov/Food/SciencePresearch/LaboratoryMethyods/Bacteriologi cal-AnalyticalManualBAM/UCM070830 14 Http://www.people.uwec.edu 15 Http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiemdinhtenvk02.htm 16 Http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/ 17 Http://www.genome.gov/10000533 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 60 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh PHỤ LỤC Một số mơi trường phương pháp truyền thống nuôi cấy phân lập Vibrio spp ™ Canh thang bromcresol • Pepton : 10,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Cao thịt bị : 3,00 g • Tím bromcresol : 0,04 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,0 0,2 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan thành phần trên, chỉnh pH cho môi trường sau pha đạt yêu cầu rót 2,5 ml vào ống nghiệm Hấp nhiệt độ 1210C 10 phút Pha loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton D-mannoza) nước cất lọc vô trùng Thêm 0,278 0,002 ml dung dịch vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường Môi trường cuối có nồng độ carbohydrat 5% ™ Canh thang muối trypton: có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 10 % NaCl (ký hiệu là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 T1N10) Hồ tan 10 g trypton lít nước cất Sau đó, thêm : 10, 30, 60, 80 100 g NaCl để canh thang trypton có giải nồng độ NaCl Sau đó, khuấy đều, chỉnh pH cho môi trường sau hấp có pH = 7,2 (ở nhiệt độ 250C) Tiến hành rót ml mơi trường vào ống nghiệm Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút Chú thích: ống mơi trường phải nút chặt trình bảo quản để tránh bốc nước làm thay đổi nồng độ muối ™ Canh thang urê • urê : 20,00 g • Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) : 9,50 g • Dikali hydro phosphat (K2HPO4) : 9,10 g SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 61 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh • Cao nấm men : 0,10 g • Ðỏ phenol : 0,01 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 0,1 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan thành phần Không hấp khử trùng, lọc vô trùng màng lọc có đường kính lỗ 0,45 ml Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào ống nghiệm đĩa petri sấy vô trùng ™ Dầu khống vơ trùng • Rót khoảng 20 - 50 ml dầu khống vào bình có nắp xốy Hấp dầu nhiệt độ 121 0C 30 phút ™ Dung dịch nước muối sinh lý Hoà tan 8,5 g NaCl lít nước cất Hấp khử trùng nhiệt độ 1210C 15 phút để nguội ™ Hugh - Leifson Glucoza • Pepton : 2,00 g • Cao nấm men : 0,50 g • Natri clorua (NaCl) : 30,00 g • Dextroza : 10,00 g • Tím bromcresol : 0,015 g • Thạch : 3,00 g • Nước cất : ,00 lít pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun nóng để hồ tan hồn toàn thành phần chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút ™ Môi trường phân lập: thạch Thiosunfat Citrat Bile - muối Sacaroza (TCBS thạch) • Pepton: 10,00 g • Cao nấm men: 5,00 g • Natri xitrat: 10,00 g • Natri thiosunfat (Na2S2O3): 10,00 g SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 62 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh • Mật bị: 5,00 g • Sacaroza: 20,00 g • Natri clorua (NaCl): 10,00 g • Sắt (III) xitrat (FeC6H5O7): 1,00 g • Natri cholate: 3,00 g • Xanh bromthymol: 0,04 g • Xanh thymol: 0,04 g • Thạch: 15,00 g • Nước cất vơ trùng: 1,00 lít pH = 8,6 (ở nhiệt độ 25oC) • Đun sơi để hịa tan hồn tồn thành phần làm nguội tới nhiệt độ khoảng 50oC Rót 15 – 20 ml vào đĩa petri vô trùng Trước sử dụng phải làm khô đĩa môi trường cách để qua đêm nhiệt độ phòng đặt đãi tủ ấm nhiệt độ khoảng 39oC – 45oC (Không hấp khử trùng môi trường) ™ Mơi trường thử decarboxylaza (Mơi trường bản) • Pepton : 5,00 g • Cao nấm men : 3,00 g • Glucoza : 1,00 g • Tím bromcresol : 0,02 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,5 (ở nhiệt độ 250C) • Tuỳ theo loại mơi trường cần pha, thêm g loại axitamin: Llysin L-arginin L-ornithin vào môi trường Sau đó, rót ml mơi trường vào ống nghiệm, nới lỏng nắp Hấp nhiệt độ 1210C 10 phút Các ống phải nút chặt bảo quản sau cấy ™ Nước pepton kiềm: Ancalin peptone water (APW) • Pepton: 10,00g • Natri clorua (NaCl): 10,00g • Nước cất: 1,00 lít, pH=8.5 (ở nhiệt độ 25oC) SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 63 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh • Hịa tan thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu chia vào bình chứa thích hợp Hấp nhiệt độ 121oC 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình , để tránh bay nước pH bị thay đổi ™ Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar –TSI • Pepton: 15,00 g • Proteose pepton : 5,00 g • Cao thịt bị : 3,00 g • Cao nấm men : 3,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Lactoza : 10,00 g • Sacaroza : 10,00 g • Glucoza : 1,00 g • Sắt (II) sunphat (FeSO4) : 0,20 g • Natri thiosunphat (Na2S2O3) : 0,30 g • Ðỏ phenol : 0,024 g • Thạch : 12,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan thành phần, chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút Trước môi trường đông, đặt ống nằm nghiêng cho phần thạch đứng cao khoảng - cm phần thạch nghiêng khoảng - cm ™ Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar – KIA • Polypepton pepton : 20,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Lactoza : 20,00 g • Dextroza : 1,00 g • Sắt ammoni xitrat : 0,50 g • Natri thiosulphat (Na2S2O3) : 0,50 g SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 64 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh • Phenon đỏ : 0,025 g • Thạch : 15,00 g • Nước cất : 1,00 lit pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan thành phần, chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút Trước môi trường đông, đặt ống nằm nghiêng cho phần thạch đứng cao khoảng - cm phần thạch nghiêng khoảng cm ™ Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl • Trypton : 10,00 g • Natri clorua (NaCl) : 20,00 g • Thạch : 20,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun sơi để hoà tan thành phần Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút Sau đó, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 - 500C rót đĩa ống nghiệm ™ O/F Glucoza • Trypton : 2,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Dikali hydro phosphat (K2HPO4) : 0,30 g • Xanh bromthymol : 0,03 g • Thạch : 2,00 g • Glucoza : 10,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun sơi để hồ tan thành phần rót ml mơi trường vào ống nghiệm Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút ™ Thuốc thử ONPG • Dung dịch đệm: + Natri dihydro phosphat ngậm phân tử nước (NaH2PO4.H2O) : 6,90g + Nước cất : 45,00 ml SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 65 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh + Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml + Hoà tan NaH2PO4.H2O nước cất Thêm dung dịch NaOH 30% chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 250C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml Bảo quản dung dịch nhiệt độ - 80C • Dung dịch ONPG: + ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg + Nước cất 370C : 15,00 ml + Dung dịch đệm : 5,00 ml + Hoà tan ONPG nước cất nhiệt độ 370C Thêm dung dịch đệm vào lắc Bảo quản nhiệt độ - 80C Trước sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 370C + Chú thích: sử dụng đĩa ONPG sản xuất sẵn thay cho dung dịch ONPG + Các đĩa 10 mg 150 mg O/129 Vibriostat + Cắt giấy lọc thành mảnh tròn đường kính khoảng - mm đặt vào đĩa petri, hấp khử trùng + Chuẩn bị đĩa 150 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 diisopropyl - pteridin photphat (O/129) nước cất vô trùng theo tỷ lệ 15,0 mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch vào đĩa + Chuẩn bị đĩa 10 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 diisopropyl - pteridine phosphat (O/129) nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1,0mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch vào đĩa Sấy khô đĩa, bảo quản tủ lạnh, tránh ánh sáng ™ Thuốc thử Oxidaza • Hồ tan 1,0 g N,N, N', N'-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng Ðựng dung dịch lọ sẫm màu bọc lọ giấy bạc Bảo quản dung dịch nhiệt độ - 80C, sử dụng vòng ngày SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 66 .. .Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp ? ?Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh? ?? công trình nghiên... ii Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh 2.2.8.2 Tình hình nhiễm Vibrio spp thực phẩm thủy hải sản đông lạnh giới .24 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY... thụ thức ăn nhiễm Vibrio spp SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 25 Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đông lạnh CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 3.1 Phương pháp