Quy trình phát hiện listeria monocytogenes trong thủy hải sản đông lạnh

LỜI MỞ ðẦU Listeria monocytogenes năm gần ñây lên tác nhân gây bệnh từ thực phẩm quan trọng ðây loại trực khuẩn Gram dương ngắn, nhỏ, khơng sinh bào tử, thường có kiểu chuyển động xoay trịn quanh trục thân thành đợt đặc trưng tiêu giọt treo Chúng phát triển mơi trường ni cấy đơn giản vùng pH Trên môi trường thạch rắn, khuẩn lạc chúng trông giọt sương suốt, nhuốm màu lam nhạt nhìn qua anh sang phản chiếu góc 450 Về mặt sinh hóa Listeria monocytogenes dễ bị nhầm với vi sinh vật Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix Kurthia Một số thử nghiệm sinh hóa áp dụng để phân biệt Listeria monocytogenes với loài Listeria khác Listeria innocua, Listeria welshimeri Listerisamurrayi Xác ñịnh kiểu huyết cách ñịnh danh quan trọng ñối với vi sinh vật Listeria thuộc loại ưa lạnh, phát tirển nhiệt ñộ thấp ñến 2,50C cao ñến 440C Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh trần nơi có điều kiện thuận lợi cho Listeria phát triển tích tụ Liều lượng gây bệnh Listeria monocytogenes chưa ñược biết Bệnh đường tiêu hóa với triệu chứng tiêu chảy, sốt nhẹ Trường hợp nặng, chủng gây bệnh sinh sản đại thực bào gây nhiễm trùng máu Vi khuẩn tác ñộng lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt xâm nhập vào bào thai bệnh mẹ gây sẩy thai, ñẻ non nhiễm trùng thai nhi Listeria monocytogenes ñã ñược phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác thịt, cá, rau, sữa cà bề mặt nước Cần lưu ý kiểm tra diện vi sinh vật cơng đoạn q trình chế biến thực phẩm, từ môi trường, nguyên liệu, ñiều kiện sản xuất, vận chuyển ñến sản phẩm cuối Nấu chín thực phẩm biện pháp hữu hiệu ñể giảm nguy nhiễm bệnh CHƯƠNG I: MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề - ðất nước ta có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển ngành nuôi trồng thủy hải sản Bờ biển Việt Nam dài rộng, lại nằm vùng giao dịng nước có khí hậu nhiệt đới nên trữ lượng hải sản dồi có giá trị kinh tế cao Vì vậy, ngành đánh bắt ni trồng thủy hải sản nước ta không ngừng phát triển, khơng đáp ứng mhu cầu nước mà cịn xuất thị trường nước ngồi như: Trung Quốc, ðài Loan, Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Anh… Chất lượng vệ sinh thực phẩm ñang mối quan tâm hàng ñầu xuất thực phẩm sang quốc gia khác, ñặc biệt ñối với mặt hàng thủy hải sản đơng lạnh - Tuy nhiên, việc xuất thủy hải sản nước ta ñang gặp nhiều khó khăn nhửng vấn đề việc nhiễm tác nhân gây bệnh, gây ñộc như: dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh… Listeria monocytogenes tác nhân gây bệnh gây ngộ ñộc sản phẩm thủy hải sản đơng lạnh - Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, vi khuẩn Listeria monocytogenes gây bệnh Losteriosis Ca ñầu tiên bệnh Listeriosis ñã ñược nói ñến cách ñây 70 năm, phải ñợi ñến năm 1980, vi khuẩn Listeria monocytogenes thức xác nhận tác nhân gây ngộ ñộc từ thực phẩm Listeria monocytogenes hình thành nên triệu chứng như; sốt, khó chịu, ñau lưng Nếu ñộc tố ñủ mạnh, chúng gây ngộ độc thực phẩm cấp tính khoảng 12 giờ, với triệu chứng như: nôn mửa, tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu… - Với ý nghĩa khoa học thực tiễn vậy, định thực đề tài: “quy trình phát Listeria thủy sản đơng lạnh” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes thủy sản tìm hiểu phương pháp xác ñịnh Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản ñông lạnh CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu thủy hải sản tình hình nhiễm khuẩn thủy hải sản Việt Nam giới 2.1.1 Giới thiệu chung thủy hải sản - Hải sản ñộng vật thực vật biển ñươc phục vụ thực phẩm thức ăn người Hải sản bao gồm ñộng vật biển như; cá động vất có vỏ khác ( bao gồm ñộng vật thân mềm ñộng vật giáp xác.) - Việc thu hoạch thủy hải sản tự nhiên ñược gọi ñánh bắt cá Ngành ñánh bắt cá ni trồng thủy hải sản biết đến là: nuôi biển, nuôi trồng thủy sản, trường hợp cá ni cá Hải sản thường đươc phân biệt với thịt Mặc dù, có số tính chất động vật loại trừ số chế ñộ ăn chay Hải sản nguồn quan trọng việc bổ sung nguồn protein nhiều phần ăn giới, ñặc biệt vùng ven biển - Hiện có 32000 lồi cá sử dụng làm nguồn thực phẩm cho người Ví dụ như: cá đối, cá chép, cá da trơn, cá chim lớn, cá trích, cá thu, cá mè, cá cơm… số loài khác - Thủy hải sản đơng lạnh thủy hải sản ñược sơ chế, chế biến theo quy trình nghiêm ngặt vệ sinh an tồn thực phẩm Quy trình sơ chế, chế biến ñưa sản phẩm theo phương pháp IQF đưa sản phẩm đơng lạnh với chất lượng tốt Ngay từ khâu nguyên liệu ñược tuyển chọn kỹ lượng với chất lượng ñảm bảo sau sản xuất dây truyền vơ trùng tuyệt đối đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm, từ đưa sản phẩm an tồn Trước sản phẩm đến tay người tiêu dùng, chúng ñược kiểm tra quan y tế ñược cấp giấy phép vệ sinh an tồn thực phẩm Chính vậy, thực phẩm đơng lạnh sản phẩm có chất lượng vệ sinh an tồn thực phẩm cao 2.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn thủy hải sản Việt Nam - Trong mùa hè liên tiếp, Viện dinh dưỡng quốc gia ñã thực ñề tài nghiên cứu: “Thực trạng ô nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh chế biến ñịa bàn Hà Nội” Kết kiểm tra vi sinh vật phịng thí nghiệm 300 mẫu thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh chế biến sẵn (ñược lấy ngẫu nhiên) từ số chợ siêu thị quận thành Hà Nội cho thấy 82 mẫu khơng đạt tiêu chuẩn vệ sinh an tồn thực phẩm Trong có 36 mẩu cá đơng lạnh, 29 mẫu tôm, cua sơ chế, mẫu tép mẫu nem chả giị… - ðặt biệt có tới gần 30% mẫu khơng đạt nhiễm số loại vi sinh vật vượt giới hạn cho phép Trong dó có 49 mẫu khơng đạt tiêu chuẩn Coliforms ( chiếm 16.3%), 34 mẫu khơng đạt E.coli (11%), 28 mẫu khơng đạt C.perfrigens (9.3%) mẫu khơng ñạt Vibrio parahaemolyticus(2.3%) Trong 28 mẫu nhiễm C.perfrigens chủ yếu là: mẫu mắm tơm, mắm tép… gây ngộ ñộc lúc Nguy hại hải sản đơng lạnh có vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ñươc xác nhận nguyên nhân gây nhiều vụ ngộ ñộc thức ăn cá biển hải sản Bệnh hầu hết xãy vào mùa hè ñối với người ăn gỏi cá thực phẩm chưa chín, gây ngộ độc, gây đau bụng, nơn, sốt, đặc biệt gây tiêu chảy 2.1.3 Tình hình nhiễm khuẩn thủy hải sản giới - Ngộ ñộc tiêu chảy ñược phát vào năm 1976 từ trai nhiễm ñộc Nhật Bản - Ngộ ñộc Venerupin ñầu tiên bùng phát ăn hào nghêu có vùng biển nước Nhật vào thời điểm đặt biệt năm, chất ñộc tạo bở nhiều sinh vật sinh sản mau lẹ, nhiều cuối mùa đơng, đơi xuất khơi nước Bồ ðào Nha Cơn bệnh làm hư gan, chết khoảng 1/3 nạn nhân - Cuối năm 1987, ngộ dộc trí nhớ để ý phát triển nhiều phía ðông Canada thủ phạm chất acid domoic, chất ñộc neurotoxinmanh phát sinh từ tảo diatom Nitzschia punens nước lạnh.Nạn nhân bị trí nhớ thời gian ngắn, số ca dẫn ñến tử vong - Ăn phải tảo ñỏ gây ngộ ñộc nguy hiểm, vào năm 1991 đảo Guam có 13 trường hợp ngộ ñộc ăn phải tảo ñỏ Polycavemosa tsudai, có số bị chết - Năm 2004 có 53 cảnh báo vượt q giới hạn sulphit tơm Trong mặt hàng tơm chín chiếm 31 cảnh báo, mặt hàng có quy định sulphit nghiêm ngặt (khơng q 50 miligram/kg tơm) Quy định có nghĩa là: mặc dù, nhà chế biến thực phẩm tuân thủ nghiêm tiêu chuẩn tơm ngun liệu, sau nấu chín tơm cơng ty vi phạm giới hạn tiêu chuẩn (do giới hạn quy định tơm chín thấp nhiều) - Năm ngối, có 41 trường hợp bị Rasff cảnh báo lây nhiễm loại vi khuẩn Listeria monocytogenes Trong đó, cá hồi xơng khói ðan Mạch bị cảnh báo 19 lần cá hồi ðức bị 10 lần - Cũng theo hệ thống cảnh báo Rasff, năm ngối có 39 cảnh báo xuất Histamin thủy sản Trong đó, cá ngừ chiếm 31 cảnh báo hầu hết mặt hàng ướp lạnh, sau nhập đóng túi chân không Hà Lan Nước bị cảnh báo nhiều Inđơnêxia - Các tra Italia ñã phát cảnh báo 41 lần việc lây nhiễm ký sinh trùng (Anisakis), chủ yếu cá thu tươi xuất xứ từ Nauy, ðan Mạch, cá vây chân từ Anh - Cảnh báo dư lượng Cactimi thủy hải sản chiếm 43 lần, nửa so với số lượng cảnh báo hồi năm 2003 (103) lần, chủ yếu liên quan ñến sản phẩm cá kiếm nhuyễn thể chân ñầu Số lần cảnh báo lây nhiễm thủy ngân cá kiếm năm 2004 30 lần, tăng nhẹ so với năm 2004 2.2 Giới thiệu vi khuẩn Listeria monocytogenes 2.2.1 Lịch sử phát Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes - Chi Listeria ñược ñặt theo tên nhà ngoại khoa người Anh, Joseph Lister Năm 1918, loại vi khuẩn tương tự Erysipelothrix rhusiopathiae ñược phân lập từ dịch não tủy quân nhân người Pháp Chủng vi khuẩn ñược lưu giữ viện Pasteur Paris, phải nhiều năm sau đó, vi khuẩn ñược mệnh danh Listeria monocytogenes - Năm 1924, Murray cộng sự, trình nghiên cứu dịch bệnh động vật thí nghiệm, phân lập ñược chủng vi khuẩn từ hạch Lympho động vật bị bệnh Sau , lấy vi khuẩn tiêm cho khỏe mạnh thấy chúng, có tượng tăng bạch cầu đơn nhân, tương tự bệnh quân nhân người Pháp nói Vì vậy, ơng đặt tên cho là: Bacillus monocytogenes Ba năm sau, Nam Phi, Piie ñó ñang nghiên cứu mang Yersinia peptis chuột ñã phân lập ñược vi khuẩn từ gan chuột ơng đặt tên Listeria hepatolytica Trực khuẩn phân biệt với Bacillus monocytogenes chủng vi khuẩn lưu giữ viện Pasteur Paris Chính vậy, pirie ñã ñề xuất tên chung cho chủng Listeria monocytogenes - Năm 1929, Nyfeldt phân lập ñược Listeria monocytogenes từ máu bệnh nhân bị sốt kèm theo viêm hạch ông tin tác nhân gây bệnh tăng bạch cầu ñơn nhân nhiễm trùng Tất nhiên, nhiều tác giả khác khơng đồng ý với lập luận Nifeldt Nhiều năm sau đó, cơng bố kinh điển bệnh nhiễm Listeria (Listeriosis) người, kể trẻ sơ sinh người lớn, cho thấy chứng giống y văn có nhũng tranh luận rằng, khả truyền bệnh từ ñộng vật sang người - Năm 1950, nghiên cứu đầu tiên, thực mang tính hệ thống nhiễm Listeria người ñã thực Tuy nhiên, phải thêm ba thập kỷ nữa, sau hàng loạt báo cáo dịch cơng bố thấy, nghiên cứu Listeria monocytogenes từ chỗ tương ñối bế tắc ñã trở nên sáng sủa Từ tới nay, chủ ñề ñã thu hút ñược quan tâm nghiên cứu nhiều chun ngành, khơng tầm quan trọng Listeria monocytogenes với sức khỏe cộng ñồng, mà cịn vì, vi khuẩn trở thành mẫu hình nghiên cứu thực nghiệm cho tượng ký sinh nội bào không bắt buộc 2.2.2 Phân loại Hình 2.2 Vi khuẩn Listeria monocytogenes - Lồi khuẩn giống Listeria vi khuẩn hình que Gram dương, ngắn, chúng kỵ khí, dương tính với catalase, âm tính với oxidase, di động 20250C khơng di động 370C - Phân loại học Listeria.spp giới vi sinh vật sau: Thuộc giới: Bacteria Ngành : Fitmicutes Lớp: Bacilli 10 xanh cây, có tâm màu đen Mơi trường xung quanh chuyển sang màu xanh đen c/ Khẳng định Listeria monocytogenes thử nghiệm sinh hóa − Thử khả tan huyết Chọn khuẩn lạc ñiển hình mơi trường thạch Oxford, dùng que cấy vịng,cấy truyền sang môi trường thạch máu, ủ 370C, 24-48 Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc Listeria monocytogenes ñược bao quanh vòng tán huyết hẹp tượng dung huyết dạng β vòng tan huyết rõ Trước tiền hành thử nghiệm khẳng ñịnh, cấy chuyền khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn Listeria monocytogenes sang môi trường lỏng không chọn lọc, ủ 250C, 20 - Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc: Các vi sinh vật kỵ khí hiếu khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử có cytochrome có enzyme catalase (trừ Streptococcus.spp) Enzyme catalase có vai trị bảo vệ tế bào khỏi tổn thương dẫn xuất ñộc tính cao oxy phân tử tế bào vi sinh vật Các vi sinh vật có khả biến dưỡng lượng theo phương thức với oxy chất nhận ñiện tử cuối chuỗi truyền ñiện tử tạo H2O2 Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H20 O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao tế bào Sự thủy phân hydrogen peroxide giài phóng O2 ghi nhận qua sủi bọt khí Chủng làm đối chứng thử nghiệm Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis 38 Hình 3.1 thử nghiệm Catalase Phương pháp tiến hành: Hóa chất dùng ñể tiến hành thử nghiệm là: Hydrogen Peroxide 30%, dung dịch ñệm Photphate pH 7.0 − Thử lame Dùng que cấy thẳng cấy lấy sinh khối từ khuẩn lạc ñặt trêm lame, nhỏ giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trêm lame, nhỏ giọt H2O2 0.5% ñậy lại lamelle Nếu dương tính xuất bọt khí bị giữ lại lame lamelle − Thử nghiệm ñĩa Petri Nhỏ trực tiếp 1ml H202 30% lên sinh khối chủng bề mặt thạch Nếu dương tính xuất sủi bọt quanh sinh khối − Thử nghiệm Oxidase Nguyên tắc: Xác ñịnh diện hệ enzyme oxidase vi sinh vật Enzyme quan trọng cytochrome oxidase chuỗi truyền ñiện tử hơ hấp hiếu khí với O2 chất nhận điện tử cuối , diện 39 lịai hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Họat tính cytochrome oxidase ñược phát nhờ thuốc thử p- phenylenediamine Trong điều kiện có diện cytochrome C khử tế bào, thuốc thử bị oxy hóa thành hợp chất indophenol có màu xanh dương Chủng dùng làm ñối chứng (+) Pseudomonas aerugnosa, (-) Acinetobacter lwoffi Phuơng pháp tiến hành Cách 1: cấy sinh khối chủng lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ nhiệt độ thích hợp 24-48 Nhúng mành giấy lọc vào dung dịch 1% teramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride oxalate Dùng que cấy vịng thu lấy sinh khối, dàn lên vị trí có thuốc thử giấy lọc Nếu khơng xuất màu xanh phản ứng âm tính Cách 2: Cấy sinh khối chủng lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ nhiệt độ thích hợp 24-48 Nhỏ lên sinh khối vào giọt lọai thuốc thử pha 1% p-aminodimethyaniline oxalate 1% α-napthol ethanol Nếu khơng xuất màu xanh phản ứng âm tính − Thử nghiệm tính di động Nguyên tắc Vi sinh vật họat ñộng di chuyển ñược nhờ tiêm mao Khả di động dùng ñể phân biệt vi sinh vật, khả ñược quan sát nhờ tăng trưởng di ñộng vi sinh vật vào bên thạch mềm Chủng dùng ñể làm ñối chứng là: Serratia marcescens, Acinetobacter lwoffi 40 Phuơng pháp tiến hành Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0.5% agar Mơi trường đun tan chảy, phân phối thành dung tích 5ml vào ống nghiệm vô trùng, hấp khử trùng 1200C 15 phút Các ống mơi trường làm nguội trạng thái ñứng bảo quản 4-100C Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng sau ủ nhiệt độ thích hợp Chủng cấy cách ñâm sâu ñầu que cấy xuyên vào mơi trường ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm Các ống mơi trường ủ 370C 24/48 Thực song song với việc ủ điều kiện tương tự ống mơi trường khơng ñược cấy vi sinh vật dùng làm ống ñối chứng Ống đối chứng khơng có vi sinh vật tăng trưởng, môi trường Nếu sử dụng môi trường thạch mềm mà ống nghiệm có Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes mọc lan khỏi đường cấy theo hình dù làm đục mơi trường xung quanh − Khả biến dưỡng ñường Nguyên tắc Xác ñịnh khả sử dụng nguồn carbon ñịnh vi sinh vật ñể tăng trưởng Phương pháp tiến hành Ủ ống canh trùng thử khả lên men ñường 370C ngày Kết (+) (màu vàng) thường quan sát vịng 24-48 Listeria monocytogenes lên men rhamnose khơng có khả lên men xylose Thử nghiệm CAMP 41 Nguyên tắc Phản ứng CAMP phả ứng phối hợp nhân tố protein tiết lồi Streptococcus nhóm B với nhân tố β-hemolysin tiết chủng Streptococcus aureus gây tượng làm tan hồng cầu cừu bị mơi trường thạch màu Nhân tố CAMP có vai trị tăng cường hoạt tính photpholipase C xúc tác thuỷ phân thành phần chủ yếu màng hồng cầu cừu bò β-hemolysin Photpholipase C thuỷ phân lecithin màng tạo thành diglyceride, photphatidyl choline ceramide Ceramide diglyceride kết tụ với giọt ñặc Nhân tố CAMP tác dụng lên khối tụ tạo khoảng trống màng ngồi giúp cho photpholipase C có điều kiện tiếp xúc thuỷ phân sphigomelin màng làm hồng cầu dễ vỡ Trong thử nghiệm CAMP người ta tiến hành cấy chủng kiểm nghiệm với chủng Staphylococcus tạo nhiều β-lysin lên môi trường thạch máu ñược bổ sung máu cừu hay bò Nếu chủng kiểm nghiệm CAMP xuất đường tan huyết vùng lân cận chung ñường cấy chủng kiểm nghiệm Saccharomyces aureus Phương pháp tiến hành Trên ñĩa thạch dung ñể thử CAMP, cấy Saccharomyces aureus thành ñường cấy mỏng, tương tự cấy Rhodocus equi ñể tạo thành ñường cấy song song cách 4cm Cấy chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes giữa, gần không chạm vào ñường cấy song song Staphylococcus aureus Rhodococus equi Có thể cấy nhiều dịng vi khuẩn nghi ngờ Listeria monocytogenes làm chủng kiểm nghiệm ñể kiểm tra 42 ñĩa Cấy chủng ñối chứng Listeria monocytogenes chủng Listeria innocua thành hình vng góc khơng chạm vào Ủ đĩa 370C 20-36 Phản ứng dương tính xuất vùng cộng hưởng tan huyết ranh giới chủng kiểm nghiệm với Staphylococcus aureus chủng thử nghiệm với Rhodococus equi Phản ứng CAMP dương tính với Rhodococus equi tạo vùng tan huyết rộng (5-10mm) có hình dạng đầu mũi tên Phản ứng dương tính với Staphylococcus aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp ( khoảng mm) có dạng hình trịn Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP dương với S.aureus âm với Rhodococus equi Ngược lại, Listeria innocua có phản ứng CAMP âm với hai loài Staphylococcus aureus Rhodococus equi 3.2 Phương pháp ñại 3.2.1 Phương pháp ELISA 3.2.1.1 Nguyên tắc - Nguyên tắc phương pháp miễn dịch phản ứng tế bào(kháng nguyên) vớimột kháng thể ñặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịh nhận biết thơng qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên kháng thể cách sử dụng kháng thể ñã ñược ñánh dấu cách nhuộm hùynh quang, đồng vị phóng xạ, hay enzyme - Phương pháp ELISA phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enyme Nguyên tắc kỹ thuật Elisa sử dụng kháng thể đơn dịng hay cịn gọi kháng thể sơ cấp phủ bên ngòai giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ phép thu giữ cách sử dụng kháng thể thứ có gắn enzyme phát tín hiệu Khi cho vào hỗn hợp phản ứng chất ñặc hiệu enzyme, 43 phản ứng xãy làm ñổi màu sản phẩm làm đổi màu phản ứng.Vì phát ñược diện kháng nguyên 3.2.1.2 Quy trình thực phân tích Chuẩn bị mẫu ( tăng sinh lần 30- 350C/24h, tăng sinh lần 300C/22-24h Cho mẫu vào giếng ñể 30 phút, 35-370C Thêm phức hợp kháng thể enzyme Thêm chất, dể khỏang 10 phút 20-250C ðọc kết Sơ đồ 3.2 Quy trình phát Listeria monocytogenes Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu Tăng sinh lần đầu : Thêm 25g mẫu vào 225ml dung dịch 3M Listeria Broth (LB), trộn ñều, ủ 36=5-370C/24h 44 Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml dung dịch tăng sinh lần vào 9.9ml canh FRASER ủ 300C/22-24h Cách tiến hành phân tích phản ứng ELISA Chuẩn bị: Xử lý nhiệt Chuyển 1ml mẫu từ canh Fraser vào 50µl dung dịch phụ trợ mẫu vào ống ñã ñược dán nhãn, ngâm 15 phút nước sơi, để nguội Mở hộpp Listeria VIA để nhiệt độ phịng Mở bao tháo giếng ñặt chân ñế Cách tiến hành: Bước 1: ♦ Cấy mẫu mẫu ñối chứng, ghi lại vị trí cấy mẫu dung pipep hút 200µlmẫu dịch đối chứng vào giếng rữa ñổ bỏ nước giếng lần Bước 2: ♦ Thêm 200µl chất kết hợp vào giếng, đậy giếng, ủ 35-370C/30 phút ♦ Rửa: ñổ hết dung dịch giếng rữa ñổ bỏ nước giếng rữa giếng Bước 3: ♦ Thêm 200µl chất vào giếng, ủ 20-250C/15 phút Them 20µl dung dịch kết thúc giúp ổn định màu vào giếng ( cần) Bước 4: ðọc kết ♦ ðọc mắt thường nhờ bảng so màu sử dụng máy đọc ♦ Nếu mẫu có màu xanh đến xanh dương đậm mẫu dương tính 3.2.2 Phương pháp lai phân tử 45 3.2.2.1.Nguyên tắc - Phương pháp sử dụng mẫu dị để phát v sinh vật thực phẩm ñược dựa phát ñọan gene ñặc trưng vi sinh vật Cơ sở vịec mẫu dị q trình lai phân tử - Cơ sở việc sử dụng mẫu dị phương pháp lai phân tử Qúa trình bao gồm tách rời hai mạch đơi chuỗi xoắn kép DNA tái bắt cặp trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ trở lại bình thường Sự lai phân tử xãy đoạnmồi có trình tự nucleotide bổ sung với vúng trình tự DNA mục tiêu gặp chuyển ñộng nhiệt nhiệt độ mơi trường thấp Tm vài độ Qúa trình lai phân tử chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nồng ñộ DNA mơi trường, nhiệt độ thời gianphản ứng, kích thước trình tự lai lực ion mơi trường 3.2.2.2 Cách làm - Hệ thống sử dụng que với mẫu dị để phát Listeria Mẫu dị đọan Oligomer DNA đánh dấu hóa chất phát quang Quy trình chia làm bước: Phát vỡ tế bào thu nhận rRNA Mẫu dò DNA có oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) mẫu dị phát chứa fluorescenin isothiocynate (F) ñầu 5’ 3’của phân tử ñược ñặt vào phản ứng Que thử ñược bao bọc polydeoxythydien (dT) ñể gắn kết ñược với oligo dA mẫu dị Que thử đặt vào ống ño chứa mẫu dò phát ñược ñánh dấu enzyme 46 Sau rữa, lọai bỏ phần enzyme thừa , que thử ñược ñặt vào ống ño chứa chất tạo màu Sau ủ ñể màu, màu ñược phát bước sóng 450nm 3.2.3.Phương pháp PCR 3.2.3.1 Nguyên tắc - Phương pháp PCR phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa khn mơt trình tự DNA ban đầu, khuyếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ họat động enzymepolymerase mơt cặp mồi ñặc hiệu cho ñọan DNA - Toàn trình lặp lặp lại 25-30 chu kỳ để mẫu DNA biến thành ha2ng tỷ vòng 3-4 3.2.3.2 Cách làm Cách xác ñịnh Listeria monocytogenes kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F LM-R - Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes - Chuẩn bị thí nghiệm Trình tự gen hlyA cơng bố ngân hàng gen Phần mềm BLAST dung để xác định trình tự gen ñích hlyA Listeria monocytogenes Cặp mồi LM-F LM-R Hóa chất sử dụng để tách chiết DNA tổng số Phương pháp tiến hành thí nghiệm cho phản ứng PCR Dựa trình tự gen hlyA chủng Listeria monocytogennes cơng bố ngân hàng gen, cặp mồi LM-F LM-R ñược thiết kế bao gồm 20bp/mồi cho sản phẩm PCR 468bp 47 - Xác định tính đặc hiệu mồi Tính đặc hiệu mồi khảo sát cách kiểm tra khả bắt cặp mồi thiết kế với khuôn DNA vi khuẩn Listeria moocytogenes vi khuẩn Listeria mococytogenes phản ứng PCR - Phản ứng PCR DNA khuôn từ Listeria monocytogenes ñược thu nhận cho phản ứng PCR cách tách làm DNA với chloroform sử lý nhiệt tế bào 1000C 10 phút Tối ưu hóa điều kiện PCR nồng độ MG2+ (1 5-4.0 mM), nồng ñộ mồi (0.1-0.5pmol/mồi) nồng ñộ dNTPs (100250Mm/mỗi loại) Phản ứng PCR ñược thực với thể tích hổn hợp 25ml vói chu trình nhiệt gồm 940C/3 phút,( 940C/ phút, 600C/1 phút , 720C/ phút)×30 trình, 720C/ phút 40C/5 phút ðánh giá kết gel agarose 1% với 3ml sản phẩm - Xác định độ nhạy phương pháp Mơi trường ni cấy qua đêm vi khuẩn Listeria monocytogenes tr6n mơi trường LEB định lượng, pha lỗng với mật độ thích hợp Ly tâm thu sinh khối 1ml canh trường hòa tan 100ml TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR 3ml dịch tế bào ñã qua sử lý nhiệt ñược sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR ðánh giá kết nhờ ñiện di gel agarose 1% với 3ml sản phẩm - Bộ gen DNA Bộ gen DNA Listeria monocytogenes ñược tách làm dung khuôn cho phản ứng PCR khuyết ñại ñoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LM-F LM-R Kết phản ứng PCR với khn DNA tinh cho thấy dãy DNA có kích thước nằm khoảng kích thước sản phẩm 48 PCR thiết kế sẵn Với mục đích thu nhận DNA mẫu cho phản ứng PCR cách ñơn giản hơn, huyền phù Listeria monocytogenes ñược sử lý nhiệt 1000C 10 phút ñể phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vịng / phút × 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khn cho phản ứng PCR - Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR Nồng ñộ Mg2+: phản ứng PCR ñược thực nồng ñộ cuối Mg2+ từ 1.5mM-4.0Mm Nồng ñộ mồi: PCR ñược thực nồng ñộ mồi khác từ 0.105 pmol Dịch tế bào ñược xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn phương pháp ñếm khuẩn lạc Pha lỗng dịch vi khuẩn với nồng độ khác nhau, xử lý nhiệt dịch huyền phù vi khuẩn, ml dịch sinh khối vi khuẩn sau sử lý nhiệt dung làm khuôn cho phản ứng PCR cho thấy phản ứng PCR cho kết dương tính với mẫu có mật độ tế bào × 102/ phản ứng tương ứng với mật độ tế bào × 104 CFU/ml - Ưu ñiểm phương pháp PCR Thời gian cho kết nhanh Có thể phát vi sinh vật khó ni cấy Việc ni tăng sinh đơn giản hop7n đơi khơng cần thiết Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm dễ tồn trữ so với trường hợp huyết học Không cần dụng cụ nuôi cấy môi trường phân tích phức tạp, thực trường Ít tốn nhân sự, tự động hóa để làm giảm chi phí phân tích phát vi khuẩn gây bệnh thực phẩm 49 - Nhược ñiểm phương pháp PCR Sự ức chế hoạt tính Tag DNA polymerase thành phần mẫu vật mẫu thực phẩm thường có thành phần phức tạp Tuy nhiên, việc chiết tách tính chế DNA từ thực phẩm hay mơi trường trước thực phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ hợp chất ức chế Mật ñộ vi sinh vật gây bệnh diện mẫu thực phẩm thường thấp nên đa số trường hợp cần có bước nuối cấy làm giàu để có mật độ để phát PCR Phương pháp không phân biệt ñược tế bào sống với tế bào chết Do , dẫn đến trường hợp dương tính giả DNA từ tế bào chết ngược lại, phương pháp cho phép phát bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào ñã chết vi sinh gây bệnh, gây ngộ ñộc thực phẩm 50 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Tóm lại, vi khuẩn Listeria monocytogenes loài vi khuẩn gây ngơ độc thực phẩm nguy hiểm cho người ăn phải thực phẩm bị lây nhiễm - ðặc biệt, gây nguy hiểm phụ nữ mang thai, người lớn tuổi, có hệ thống miễn dịch suy giảm trẻ sơ sinh mắc phải vi khuẩn Listeria monocytogenes nguy hiểm đến tính mạng - Trên giới nay, vấn ñề vi khuẩn vấn đề vơ quan tâm Mặc dù, khơng xãy nhiều dịch bệnh Việt Nam Nhưng tình hình lây nhiễm Listeria moncytogenes ñã xuất Việt Nam giới với mức ñộ ngày tăng cao - Trên giới nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu vi khuẩn Listeia monocytogenes nước Châu âu vấn ñề vi khuẩn Listeria gây nhiễm vào thực phẩm ñang ñược quan tâm kiểm soát kỹ phương pháp ñại - Nhưng Việt Nam vấn ñề nguy hiểm chưa ñươc quan tâm ñúng mức chưa ó phương pháp phịng chống cách ñúng mức 4.2 Kiến nghị - Từ nguy hiểm nên có cách phịng chống lây nhiễm vi khuẩn Listeia monocytogenes - Nên kiểm tra nghiêm ngặt thực phẩm tiêu dùng mức ñộ vi khuẩn thực phẩm, ñặc biệt ñối với vi khuẩn Listeria monocytogenes 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm – Trần Linh Thước [2] Vi khuẩn y học – PGS- Ts Lê Văn Phùng [3] Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm – Kiều Hữu Ảnh [4] Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thủy sản – nhà xuất nông nghiệp [5] Aerobic and Facultative Gram-Positive Bacilli 52 ... tài: ? ?quy trình phát Listeria thủy sản đơng lạnh? ?? 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes thủy sản tìm hiểu phương pháp xác ñịnh Listeria monocytogenes sản phẩm... monocytogenes sản phẩm thủy sản ñông lạnh CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu thủy hải sản tình hình nhiễm khuẩn thủy hải sản Việt Nam giới 2.1.1 Giới thiệu chung thủy hải sản - Hải sản ñộng vật thực... Bộ: Bacillales Họ: Listeriaceae Giống: Listeria - Hiện có lồi Listeria cơng nhận: Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Listeria wells Listeria seeligeri Listeria grayi (loài