XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN ĐÃ CẢI TIẾN TỪ PHƯƠNG PHÁP ISO 11290 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***************** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN ĐÃ CẢI TIẾN TỪ PHƯƠNG PHÁP ISO 11290 - Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004 - 2008 Lớp: DH04SH Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HOA Tháng 9/2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN ĐÃ CẢI TIẾN TỪ PHƯƠNG PHÁP ISO 11290 - Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS NGUYỄN TIẾN DŨNG NGUYỄN THỊ HOA CN CAO QUỐC LIÊM Tháng 9/2008 LỜI CẢM ƠN Con xin bày tỏ lòng biết ơn đến ba mẹ, anh, em gia đình, người ln ln bên cạnh giúp đỡ lúc khó khăn Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô tận tâm dạy dỗ, truyền đạt tri thức khoa học kinh nghiệm quý báu cho em suốt trình rèn luyện học tập trường Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn đến thầy Nguyễn Tiến Dũng tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu khoa học Em xin gửi đến anh Liêm, chị Uyên, anh Lẫm, chị Tiên lời cảm ơn chân thành Em xin cám ơn anh chị làm việc Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ em thời gian thực khóa luận Cám ơn bạn làm phòng I5 bạn lớp DH04SH giúp đỡ thời gian thực khóa luận Một lần em xin chân thành cảm ơn tất TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2008 Sinh viên Nguyễn Thị Hoa iii TÓM TẮT NGUYỄN THỊ HOA, Tháng 9/2008.” XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN ĐÃ CẢI TIẾN TỪ PHƯƠNG PHÁP ISO 11290 - 1” Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Tiến Dũng, CN Cao Quốc Liêm Đề tài thực từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008 phịng thí nghiệm Vi Sinh thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh phịng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Cơng nghệ sinh học Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Đề tài gồm thí nghiệm sau:  Xác định giới hạn phát hai phương pháp tham chiếu (ISO 11290 - 1) thay (ALOA)  Dựa quy trình có sẵn hai phương pháp tiến hành thí nghiệm xác định thông số kỹ thuật phương pháp thay (ALOA) Kết đạt sau: Giới hạn phát phương pháp ISO 11290 CFU/g, phương pháp ALOA 10 CFU/g Các thông số kỹ thuật thu phương pháp ALOA:  Độ chọn lọc 100 %  Độ xác sơ bộ: 91,7 %, độ xác sau khẳng định: 83,3 %  Độ nhạy xấp xỉ 87,5 %  Độ đặc hiệu: 100 % Kết đạt cho thấy khác biệt phân tích Listeria monocytogenes thực phẩm thủy sản phương pháp ISO 11290 - phương pháp ALOA iv SUMMARY NGUYEN THI HOA, August 2008 “ VALIDATION OF ALTERNATIVE METHOD FOR DETECTION OF Listeria monocytogenes IN SEAFOOD WAS IMPROVED FROM ISO 11290 – 1” Guide teacher: Nguyen Tien Dung, Cao Quoc Liem The thesis has been conducted in laboratory from April to August 2008 at Microbial Laboratory, Biotechnology Department, Nong Lam University and Biochemical Laboratory, Reseach Institute for Biological and Enviromental Technology, Nong Lam University, Ho Chi Minh city This thesis was based method ISO 11290 - and ALOA to determine limit of detection and technical parameters of ALOA method The results show that:  Limit of detection: ISO method is 5CFU/g and ALOA method is 10CFU/g  Selectivity: 100 % Inclusion: + Detection of Listeria monocytogenes from a wide range of strains: ISO method is 100 % and ALOA method is 100 % + Detection of non Listeria monocytogenes from a wide range of strains non Listeria monocytogenes: ISO method and ALOA method: %  Accuracy screening test: 91,7 %, accuracy confirmation test: 83,3 %  Sensitivity approximately 87,5 %  Specificity: 100 % v MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích-ý nghĩa 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Ý nghĩa 1.3 Nội dung .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Giới thiệu vi khuẩn Listeria monocytogenes 2.1.1 Lịch sử phát vi khuẩn Listeria monocytogenes 2.1.2 Các tác nhân gây độc Listeria monocytogenes 2.1.2.1 Hemolysin .4 2.1.2.2 Phospholipase 2.1.2.3 ActA 2.1.3 Đặc điểm hình thái sinh lí 2.1.4 Đặc điểm huyết học 2.1.5 Đặc điểm sinh hóa .6 2.1.6 Phân loại Listeria spp 2.1.7 Cấu trúc gen 2.1.8 Đặc điểm gây bệnh 2.1.9 Cơ chế gây bệnh Listeria monocytogenes 2.1.9.1 Quá trình xâm nhiễm Listeria monocytogenes 2.1.9.2 Sự phát tán nội bào gian bào Listeria monocytogenes 11 2.1.10 Biện pháp an toàn 13 vi 2.2 Tình hình gây bệnh yêu cầu an tồn Listeria monocytogenes 13 2.2.1 Tình hình gây bệnh 13 2.2.2 Các yêu cầu an toàn Listeria monocytogenes thực phẩm 14 2.3 Phương pháp phát Listeria monocytogenes 17 2.3.1 Phương pháp truyền thống 17 2.3.2 Phương pháp PCR 18 2.3.3 Chẩn đoán huyết học .18 2.3.3.1 Dựa kháng nguyên roi H .18 2.3.3.2 Dựa kháng nguyên thân O 19 2.3.4 Phương pháp sử dụng mẫu dò (probe) 20 2.4 Xác nhận hiệu lực phương pháp .21 2.4.1 Sơ lược xác nhận hiệu lực phương pháp 21 2.4.1.1 Định nghĩa 21 2.4.1.2 Các bước xác nhận hiệu lực 21 2.4.2 Các thông số kỹ thuật xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi sinh vật 22 2.4.3 Ý nghĩa việc xác nhận hiệu lực phương pháp 22 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Thời gian địa điểm thực .24 3.2 Đối tượng nghiên cứu .24 3.3 Vật liệu .24 3.3.1 Dụng cụ thiết bị 24 3.3.2 Môi trường thuốc thử 24 3.3.3 Nguyên vật liệu 25 3.3.3.1 Chủng 25 3.3.3.2 Các mẫu thực phẩm dùng thí nghiệm 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1 Thu bảo quản mẫu 26 3.4.2 Phương pháp đồng mẫu 26 3.4.3 Phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật 26 3.4.4 Phương pháp ISO 11290 - dùng để phát Listeria monocytogenes – phương pháp tham chiếu 27 vii 3.4.5 Phương pháp ALOA dùng để phát Listeria monocytogenes - phương pháp thay 27 3.4.6 Xác định giới hạn phát phương pháp ISO ALOA 36 3.4.7 Xác định thông số kỹ thuật 38 3.4.7.1 Độ chọn lọc 38 3.4.7.2 Độ xác .39 3.4.7.3 Độ nhạy .40 3.4.7.4 Độ đặc hiệu 40 Chương 4: KẾT QUẢ 41 4.1 Xác định giới hạn phát phương pháp ISO ALOA 41 4.2 Độ chọn lọc .42 4.2.1 Phát Listeria monocytogenes dãy số lượng L monocytogenes đem thử nghiệm 42 4.2.2 Phát vi sinh vật Listeria monocytogenes dãy số lượng vi sinh vật Listeria monocytogenes đem thử nghiệm 44 4.3 Xác định thông số kỹ thuật phương pháp 44 4.3.1 Độ xác 48 4.3.2 Độ nhạy 48 4.3.3 Độ đặc hiệu 48 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận .51 5.2 Đề nghị .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ALOA Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti BHI Brain Heart Broth CAMP Christie – Atkins – Munch – Petersen CFU Conoly forming unit ctv cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic acid ISO International Standardization Organization kDa Kilo Dalton PCR Polymerase Chain Reaction PE Poly Ethylen PP Phương pháp rRNA Ribosome Ribonucleic acid SPW Saline Peptone Water TSA Tryptic Soy Agar ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Khả tồn Listeria monocytogenes môi trường Bảng 2.2 Thành phần kháng nguyên O H ứng với kiểu huyết Listeria Bảng 2.3 Biểu sinh hóa Listeria spp Bảng 2.4 Sự bùng phát bệnh Listeriosis quốc gia giới 13 Bảng 2.5 Ước tính hiệp hội sức khỏe quốc gia Hoa kì đến năm 2010 tỉ lệ mắc phải bệnh lây nhiễm qua thực phẩm/100.000 người 14 Bảng 2.6 Giới hạn Listeria monocytogenes thực phẩm theo tiêu chuẩn Bộ y tế tháng 12/2007 14 Bảng 2.7 Chỉ tiêu Listeria monocytogenes định kiểm tra với lô hàng thủy sản theo Bộ Nông nghiệp vá Phát triển nông thôn tháng 8/2008 15 Bảng 3.1 Biểu sinh hóa Listeria monocytogenes 31 Bảng 3.2 So sánh kết thử sơ (screening test) 39 Bảng 3.3 So sánh kết sau khẳng định (confirmation test) .40 Bảng 4.1 Kết xác định giới hạn phát phương pháp ISO ALOA .41 Bảng 4.2 Kết phát Listeria monocytogenes dãy số lượng Listeria monocytogenes đem thí nghiệm 43 Bảng 4.3 Kết phát vi sinh vật Listeria monocytogenes dãy số lượng vi sinh vật Listeria monocytogenes đem thử nghiệm 44 Bảng 4.4 Kết thử sơ dòng Listeria monocytogenes 45 Bảng 4.5 Kết sau khẳng định dòng Listeria monocytogenes 46 Bảng 4.6 Kết thử sơ dòng Listeria monocytogenes .47 Bảng 4.7 Kết sau khẳng định dòng Listeria monocytogenes 48 x ... thế, với đề tài “ Xác nhận hiệu lực phương pháp phát Listeria monocytogenes thực phẩm thủy sản cải tiến từ phương pháp ISO 11 290 - 1? ??, tiến hành xác nhận hiệu lực sơ cấp cho phương pháp sử dụng môi... NGHIỆP XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN ĐÃ CẢI TIẾN TỪ PHƯƠNG PHÁP ISO 11 290 - Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS NGUYỄN TIẾN DŨNG... Tháng 9/2008.” XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Listeria monocytogenes TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN ĐÃ CẢI TIẾN TỪ PHƯƠNG PHÁP ISO 11 290 - 1? ?? Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Tiến Dũng, CN Cao