THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG

Để góp phần làm đồng bộ các quy trình phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương pháp phương pháp PCR, áp dụng qui trình này trên một số loại thực phẩm nhằm đánh giá... 3.1.Phương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KI ỀU THỊ DIỄM TRANG

PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN

Với lòng kính trọng và biết ơn chân thành, tôi xin cảm ơn:

Nhân đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Đồng

AOAC: Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa học phân tích nhà nước)

Da: Dalton (đơn vị khối lượng protein) DNA: Deoxyribonucleic acid (AND)

DNA)

kb:Kilo base (1.000 base)

kDa: Kilo Dalton (1.000 da)

Mb: Mega base (1.000.000 base)

NĐTP: ngộ độc thực phẩm

TAE: Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Taq: Thermus aquaticus TE: Tris-EDTA

TRH: Thermostable Related hemolysin (hemolysin liên quan đến TDH)

V parahaemolyticus: Vibrio parahaemolyticus

ĐẶT VẤN ĐỀ

đề của phong trào này ương năm 2005 là "Sản xuất, kinh doanh và sử dụng thực phẩm

độc thực phẩm (NĐTP) tại các bếp ăn tập thể, nhà hàng, khách sạn đã xảy ra; số vụ

người dân chưa cao NĐTP không những gây tổn thất rất lổn về kinh tế mà còn có khả năng ảnh hưởng nghiêm trọng cho sức khỏe trước mắt và lâu dài

NĐTP không chỉ là vấn đề đáng lo ngại ở các nước nghèo kém phát ừiển, các nước đang phát triển mà ở cả những nước phát triển Theo Tổ chức Y tế thế giới

(Canada) [13]

parahaemolyticus), Salmonella spp, Shigella spp được xem là mối đe dọa, gánh nặng

ưa mặn, xuất hiện nhiều trong các loài thủy hải sản ở vùng nước ấm ven bờ biển Nước ta có hệ thống sông rạch chằng chịt và bờ biển dài 3.260 km, có nguồn lợi thủy

động nên làm ứ động hàng hóa, ngăn cản lưu thông, tăng chi phí sản xuất Vì vậy,

vật gây bệnh trong thực phẩm là một nhu cầu rất bức thiết

thao tác đơn giản, khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp nuôi cấy

và được áp dụng thử nghiệm trên thế giới Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh

Staphylococuss aureus, Shigella spp., Salmonella spp., E coli Clostridium perfringens, C botulinum, Vibrio cholerae bằng phương pháp PCR Để góp phần làm đồng bộ các quy trình phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương pháp

phương pháp PCR, áp dụng qui trình này trên một số loại thực phẩm nhằm đánh giá

PH ẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Ng ộ độc thực phẩm

1.1.1.Ng ộ độc thực phẩm do vi sinh vật và đặc điểm

dư lượng thuốc trừ sâu, phân hóa học, từ phụ gia không đạt chất lượng hoặc bị cấm sử

kí sinh trùng Nguy cơ bị NĐTP do vi sinh vật thường cao hơn 100.000 lần so với ngộ độc bằng hóa chất [14] Độc tố vi sinh vật được chia thành hai loại: ngoại độc tố và

khuẩn phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và tính mẫn cảm của mỗi người Các vi

trưởng và gây bệnh Con người khác nhau về tuổi tác, tình trạng dinh dưỡng, sức

thường sau một vài ngày

trong vòng 30 phút đến 2 giờ, đôi khi 8 giờ, sau khi ăn [14]

đến việc vi phạm các qui định về vệ sinh trong chế biến, bảo quản, phân phối và sử

định và kết thúc nhanh sau khi chấm dứt tiêu thụ loại thức ăn đó Ngoài ra bệnh có qui

1.1.2.Th ực trạng NĐTP trên thế giới và Việt Nam

tăng của các bệnh do thực phẩm Theo WHO, hàng năm có tới 30% dân số ở các nước

phát triển bị bệnh do thực phẩm Con số này ở các nước đang phát triển thì cao hơn

Người ta đã xác định ít nhất 16 loài vi khuẩn, 4 loài virus, 4 loài đơn bào và 13 loài

đang phát triển [12]

Staphylococcus aureus Ở úc mỗi năm có khoảng 4,2 triệu ca NĐTP cấp tính, trung

NĐTP tại Việt Nam những năm gần đây của Bộ Y tế được trình bày trong Bảng 1

Trên thực tế, chắc chắn số vụ NĐTP, số người bị ngộ độc và tử vong cao hơn rất

1.1.3.M ột số vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp

Bacillus cereus là trực khuẩn tạo nội bào tử phân bố rộng rãi trong tự nhiên, hiện

Clostridium botulium là vi khuẩn kị khí thường gặp trong đất, phân động vật,

kinh trung ương và hành tủy, rối loạn lời nói, mất tiếng, liệt dạ dày, táo bón Triệu

C peryringens là vi khuẩn kị khí gây 5% các vụ NĐTP Đồ hộp, thức ăn nấu chín là môi trường thích hợp cho vi sinh vật này phát triển vì sự nấu chín làm giảm lượng ôxi Triệu chứng của bệnh là đau bụng, tiêu chảy, không sốt và ít khi ói mửa

Campylobacter là vi khuẩn vi hiếu khí, gây đau bụng hoặc co rút, buồn nôn, tiêu

Campylobacter có thể do các loại thực phẩm như sữa tươi, nước chưa khử trùng hoặc đun sôi, thịt gia cầm nấu chưa chín

E coli là vi khuẩn gram (-) hiện diện rộng rãi trong môi trường Một số chủng có

Listeria monocytogenes có thể hiện diện trong thịt, cá, rau, sữa và nước bề mặt

đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi [19]

đó bệnh nhân tự hồi phục

máu

đến 4 giờ Triệu chứng bệnh đặc hiệu là tiết nước bọt nhiều, nôn mửa, tiêu chảy, quặn đau cả bụng, nhức đầu, không sốt Tuy triệu chứng dữ dội nhưng ít khi gây nguy hiểm

Vibrio cholerae là loài vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, gây dịch tả Dịch bệnh

Vibrio parahaemolyticus thường gặp ở nhuyễn thể và giáp xác trong nước biển

lẫn nước ngọt Các triệu chứng bệnh là đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn, ớn lạnh, đau đầu xuất hiện 12 giờ sau khi ăn những loại thực phẩm (đặc biệt là hải sản) chứa một lượng lớn vi khuẩn sống

Yersinia enterocolitica có thể hiện diện trong nhiều loại thức ăn khác nhau, đặc

độc tố vi nấm

trong nước hay trong thực phẩm Virut nhiễm vào thực phẩm trong quá trình chế biến,

được biết đến từ năm 1950 Dịch cúm ở Hồng Kông (1998 - 1999) là do thịt gà có

người Các virut đường ruột như Echo, Coxsackie, Poliovirus sống kí sinh ở đường tiêu hóa nhưng có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan khác nhau như hệ thần kinh (viêm não, màng não), viêm cơ tim, cơ Rhotavirus được lây lan bằng đường tiêu hóa gây

Á như Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Lào, Campuchia và ở các nước khác như Mỹ, Canada đã đối diện với đại dịch cúm gia cầm do Avian influenzae virus A týp

đe dọa tính mạng cho người dân Việt Nam cũng như các nước Đông Nam Á [1]

Aspergillus flavus, A parasiticus được tạo ra trong đậu phông, bắp, hạt hướng dương

Thực phẩm chứa nhiều chất dinh dưỡng nên là môi trường thuận lợi cho vi sinh

Shigella và V parahaemolyticus hiện được xem là mối đe dọa, gánh nặng bệnh tật cho

người mắc do sử dụng thực phẩm không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm [17]

1 2.Đặc điểm sinh học và bệnh học của Vibrio parahaemolyticus

1 2.1.Đặc điểm hình thái và tăng trưởng

Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gram (-), không sinh bào tử, có dạng hình

độc, đôi khi có dạng s hoặc dạng xoắn ốc Loài này di chuyển bởi một hoặc vài tiêm

Đây là loài vi khuẩn ưa mặn, sinh trưởng ở nồng độ NaCl từ 0,5 - 10% Nồng độ

trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 43°c, tối ưu là 37°c Ở điều kiện thuận lợi, thời gian thế hệ của

sinh trưởng được ở pH từ 4,8 - li Đặc biệt sự sinh trưởng bị ức chế khi có sự hiện diện

Trong môi trường lỏng TSB (Tryptic Soy Broth) 2% NaCl, vi khuẩn mọc nhanh,

môi trường chỉ trong 4 giờ Trên môi trường chọn lọc rắn TCBS (Thiosulfate Ciữate

đường kính khoảng 3-4 mm, tâm có màu đậm hơn, không làm axit hóa môi trường

bên dưới khuẩn lạc, đây là đặc điểm để phân biệt với khuẩn lạc của V cholerae [10]

V parahaemolyticus hiện diện phổ biến trong nước biển và có thể tồn tại trong

parahaemolyticus

1 2.2.Đặc điểm sinh hóa và miễn dịch

V parahaemolyticus có phản ứng Oxidase (+), phát triển được trong canh

Arginine Dihydrolase (ADH) (-), Lysine Decarboxylase (LDC) (+), có khả năng khử nitrate thành nitrite nhưtig không lên men được đường sucrose, sử dụng được một số

tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng được ương các môi trường có 3%, 6% muối; ở các nồng độ 8%, 10% muôi sự tăng ứưởng yếu hoặc không

rõ

(Kanagawa phenomenon) Đây là phản ứng làm tan huyết trên môi trường thạch máu

độc tố hemolysin bền nhiệt tdh (Thermostable direct hemolysin) [4] Hầu hết các các

được độc tố TRH (Thermostable direct hemolysin-related hemolysin)

O, kháng nguyên K và kháng nguyên H

12 nhóm

- Kháng nguyên H là kháng nguyên tiêm mao, không quan trọng như hai loại kháng nguyên trên

Vào năm 2001, từ số liệu điều tra tổng quát về những trường hợp nhiễm vi

[20]

1 2.3.Đặc điểm bệnh học

1.2.3.1.B ệnh và cơ chế gây bệnh

như đau thắt vùng bụng, buồn nôn, nôn, sốt và ớn lạnh Thường những triệu chứng

đôi khi dài hơn, trung bình khoảng 2,5 ngày Có thể sử dụng một số kháng sinh thích

V parahaemolyticus kháng được axit cao trong dạ dày để xuống ruột non là nhờ

[25]

Vượt qua rào cản pH ở dạ dày, vi khuẩn di chuyển xuống ruột non Tại đây các

độc tố tả cholerae ở V cholerae Độc tố TDH và TRH được tạo thành từ 6 tiểu đơn vị

đơn vị A có vai trò hoạt hóa adenyl cyclase làm tăng tổng hợp AMP vòng (cAMP) cAMP tác động lên niêm mạc ruột làm tăng tiết lon cr vào trong lòng ruột Hậu quả là NaCl được tích lũy cao ở bên trong lòng ruột nên nước bị kéo vào trong lòng ruột một

cách thụ động, gây nên tiêu chảy Tiêu chảy làm mất đi một lượng lớn nước cùng với lon K+ và bicarbonate [1]

1 2.3.2.Gen mã hóa độc tố

TDH và TRH được mã hóa bởi hai gen gây bệnh tương ứng là tdh (Thermostable direct hemolysin gene) và trh (Thermostable direct hemolysin -related hemolysin

tương đồng trình tự đến 69%

loài V parahaemolyticus

parahaemolyticus Trọng lượng phân tử của TDH trưởng thành là 18.496 Da và của

1 2.3.3.Tình hình NĐTP do V parahaemolyticus

Ở Châu Á, V parahaemolyticus là nguyên nhân phổ biến nhất cho thức ăn bị

Nhật Bản, nơi có sở thích ăn cá sống Ở Nhật Bản, các vụ NĐTP do V

parahaemolyticus có xu hướng tăng: 102 vụ xuất hiện năm 1996, 160 vụ năm 1997 và

ở Đài Loan, trong những năm 1986 - 1995, có 197 ca NĐTP là do V

parahaemolyticus và hơn 200 ca được báo cáo vào năm 1997

Ở Mỹ các trường hợp nhiêm V parahaemolyticus gan chặt với việc sử dụng hàu

do thói quen ăn hàu sống sau khi thu hoạch [21]

Ở Pháp, các vụ nhiễm V parahaemolyticus cũng được báo cáo Năm 1997, 44

người bị tiêu chảy sau khi dùng tôm nhập từ Châu Á Trong số 5 mẫu được xét

Ở Việt Nam tại tỉnh Khánh Hòa từ tháng 1-1997 đến tháng 11-1999 xảy ra các trường hợp tiêu chảy: 31 trường hợp/1000 trẻ em dưới 6 tuổi, 61/1000 người từ 6 đến

tương ứng là 15%, 18%, 9% số ca nhập viện là 42% đối với trẻ em và 28% đối với người trưởng thành, không có trường hợp tử vong [24] Bảng 3 ghi lại một số vụ

NĐTP do V parahaemolyticus ở một số nước khác

1.2.3.4.An toàn v ề V parahaemolyticus trong thực phẩm

Độc tố của V parahaemolyticus không bền với nhiệt, do đó chỉ cần nấu chín

1 3.Phương pháp phát hiện V parahaemolyticus trong thực phẩm

1 3.1.Phương pháp nuôi cấy truyền thống

Phương pháp nuôi cấy truyền thống đã được xây dựng và phát triển từ những năm 80 của thế kỷ XIX dựa trên cơ sở những công trình nghiên cứu của Pasteur và

nhưng do có quá trình lịch sử phát triển và ứng dụng lâu dài nên phương pháp này được các cơ quan có thẩm quyền công nhận ở cấp quốc gia cũng như quốc tế Do vậy,

phương pháp thay thế khác

Phương pháp nuôi cấy dùng để phát hiện V parahaemolyticus được dựa trên các

đặc điểm về sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy chọn lọc và các đặc

điểm sinh hóa Quy trình dùng để phát hiện V parahaemolyticus trong thực phẩm

được thực hiện qua các bước sau:

đồng thời ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật khác

trường phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa như: Lysine Decarboxylase (LDC), Nitrophenyl- D-Galactopyranoside (ONPG), oxidase, lactose, Arginine Dihydrolase

parahaemolyticus được thử nghiệm ngừng kết với các huyết thanh O và K [10]

1 3.2.Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp truyền thống, nhiều phương

immunosorbent assay) được quan tâm nhiều do có tính đơn giản và hiệu quả cao

(microplate) để giữ lại tế bào vi khuẩn trong mẫu thông qua sự gắn giữa kháng thể và

bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym như alkaline phosphatase

phát sáng Cường độ màu xuất hiện trong đĩa tỉ lệ với kháng nguyên liên kết Do đó

này có độ đặc hiệu không cao do có hiện tượng ngưng kết chéo giữa kháng nguyên không đặc hiệu và kháng thể Vì vậy phương pháp này chỉ được sử dụng như một

để phát hiện V parahaemolyticus dựa trên các protein TDH và TRH

1 3.3.Phương pháp lai phân tử (Hybridization)

Phương pháp lai phân tử là phương pháp sử dụng mẫu dò (probe) để phát hiện vi

[10]

đã thực hiện thành công phương pháp lai phân tử để xác định V parahaemolyticus

93% Năm 2000 Angelo DePaola cùng đồng sự đã thực hiện thành công việc phát hiện

V parahaemolyt ỉcus bằng phương pháp lai phân tử dựa vào gen gây độc tdh và trh

mimicus và V cholerae non 01 [6] Ngoài ra phương pháp lai phân tử không thể phát

1 3.4.Phương pháp PCR

1.3.4.1.Nguyên t ắc

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để

lượng) số lượng lớn bản sao của khuôn nhờ hoạt động của enzym polymerase và một

minh vào năm 1985 Phương pháp này được ứng dụng nhanh chóng và có ý nghĩa

đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mạch khuôn thường là một trình tự

đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân bản thành số lượng lớn bản sao đến mức

đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên

biệt Các mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense

cao hơn Tm của phân tử, thường là 94 - 95°c trong vòng 30 - 60 giây ở bước này hai

dưới sự có mặt của hai mồi và bốn loại dNTP

đến 72°c là nhiệt độ tối ưu của DNA polymerase chịu nhiệt được sử dụng cho phản ứng Thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

1.3.4.2.Các y ếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

ứng PCR cho kết quả tốt nhất khi DNA khuôn thật tinh sạch Phản ứng PCR cũng phụ

chiết tách từ vi khuẩn ở suối nước nóng Thermus aquaticus Enzyme này được viết tắt

năng xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối phản ứng

đặc hiệu của phản ứng PCR Việc thiết kế và chọn mồi phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:

+ Đoạn nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR tối

200|aM đối với mỗi dNTP) Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuyếch đại không

động của Taq DNA polymerase bị ức chế Nồng độ tối ưu của lon này không tuân

sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu Sau đó hiệu quả khuếch đại

được tổng hợp so với mồi số chu kỳ của phản ứng PCR còn phụ thuộc vào số lượng

đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu (tăng sinh) để có được mật độ đủ để

1.3.4.4.M ột số nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện V parahaemolyticus trong th ực phẩm

Asim cùng đồng sự đã thực hiện phản ứng multiplex với 3 gen tdh, trh, và tlh để

trong mẫu thủy sản Chi - Ying Lee (2003) sử dụng phương pháp PCR phát hiện V

parahaemolyticus trên th ủy hải sản với gen mục tiêu là gen tlh Năm 2003, Nguyễn

parahaemolyticus [9] Năm 2004, Trương Lê Na và cộng sự ở Trường Đại học Khoa

Theo đánh giá thực tế, so với các phương pháp khác để phát hiện V

parahaemolyticus trong thực phẩm cho đến nay PCR là phương pháp cho hiệu quả

Đặc biệt phương pháp PCR dựa trên gen tlh là gen chỉ thị chuyên biệt của loài V

parahaemolyticus có ưu điểm là nhanh và đặc hiệu hơn Tuy nhiên để phương pháp PCR được chấp nhận, phổ biến rộng rãi và được coi như là một phương pháp chính

V parahaemolyticus, góp phần đưa phương pháp này ứng dụng vào thực tế

1.4.Xác nhận hiệu lực phương pháp sinh học

1 4.1.Định nghĩa các khái niệm

phương pháp cải tiến từ những phương pháp tiêu chuẩn mà khi tiến hành sẽ cho kết

tượng mẫu

công nhận ở cấp quốc gia hay quốc tế (Ví dụ: NMKL, ISO, CEN, AOAC và các tiêu

Để trở thành một phương pháp tiêu chuẩn, phương pháp thay thế phải qua hai bước xác nhận hiệu lực: xác nhận hiệu lực sơ cấp và xác nhận hiệu lực thứ cấp Kết

ban hành phương pháp để xem xét, đánh giá Nếu được chấp nhận, phương pháp thay

lý

1 4.2.Các bước xác nhận hiệu lực

đề xuất phương pháp mới tiến hành nhằm đưa ra các thông số kỹ thuật của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp mới này có nhiều ưu điểm hơn phương pháp

Cơ quan chủ trì việc xác nhận hiệu lực thứ cấp có thể là cơ quan có thẩm quyền trong

và đo lường Đây là giai đoạn cuối cùng để đưa ra kết luận về hiệu lực áp dụng của phương pháp

1.4.3.Các thông s ố kỹ thuật trong xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi sinh v ật

xác định thông qua tỉ lệ cho kết quả dương tính hay âm tính đối với các mẫu có kết

- Dương tính giả (false positive): là kết quả dương tính theo phương pháp thay

được tính là số mẫu dương tính giả trong tổng số mẫu âm tính

trong khi phương pháp tham chiếu cho kết quả dương tính Tỉ lệ âm tính giả được tính

dương tính phải trên 50% Việc xác nhận hiệu lực phải chứng minh được rằng phương

NorđVal (Đan Mạch), giới hạn này được khảo sát ở các cấp độ là: 0,1 - 10, 10 - 100 tế

ổn định xác định các khoảng giới hạn cho phép của các thành phần tham gia vào qui

giữa các kết quả từ những lần khảo sát độc lập trên một mẫu xác định, trong cùng một điều kiện thực hiện như: qui trình, thiết bị, người thực hiện, tại cùng một thời điểm

1 4.4.Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực

đáng tin cậy và đã được sử dụng từ trước đến nay Việc đánh giá này giúp cho chúng

đó và giúp nó hoàn thiện hơn, đáng tin cậy hơn, góp phần cho việc đưa phương pháp

đó áp dụng rộng rãi trong thực tế

được quan tâm như hiện nay, thì việc lựa chọn phương pháp nào để phân tích, đánh

để hoàn thiện phương pháp, giúp phương pháp được chấp nhận, phổ biến rộng rãi, tạo

PH ẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.V ật liệu

2.1.1.Thi ết bị và dụng cụ

- Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen-Mikro22R)

- Môi trường:

+ Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts) 2% NaCl dùng để phân lập

V parahaemolyticus

+ Môi trường pepton kiềm 2% NaCl (pH: 8,5 ± 2) dùng để tăng sinh mẫu

dùng để thử khả năng chịu mặn của V parahaemolyticus

+ Môi trường Lactose Agar 1% NaCl dùng cho thử nghiệm ONPG

2.1.3.V ật liệu thí nghiệm

trong tháng 8 năm 2004 (chợ Tân Phú, cầu vượt Trạm 2 quận Thủ Đức -TP Hồ Chí

Đông, siêu thị An Đông Plaza) Các loại mẫu được chia thành 5 nhóm: nhóm thịt,

Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh và các chủng V parahaemolyticus tự phân lập từ

làm đối chứng âm (Bacillus cereus, Clostridium botulinum, C perfingens, Escherichia

coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Shigeila spp., Staphylococcus

aureus, Vibrio cholerae)

2.2.Phương pháp

2.2.1.Thu và x ử lý mẫu

vô trùng như sau: dùng cồn 70° sát trùng các dụng cụ xử lý mẫu như kéo, nhíp, miệng

Trước khi phân tích, mẫu được rã đông trong điều kiện vô trùng khoảng 30 - 45 phút Đối với những mẫu dùng để phân lập chủng thì cần phải phân tích ngay sau khi lấy

2 2.2.Đồng nhất mẫu và tăng sinh

Cho 225ml môi trường pepton kiềm 2% NaCl vào túi PE vô trùng có chứa 25g

ủ ở 37°c trong 18-20 giờ Dịch tăng sinh này dùng để phân lập chủng hoặc kiểm tra

2 2.3.Xác định mẫu âm tính

V parahaemolyticus tạo mẫu gây nhiễm Kiểm tra ít nhất 3 mẫu ngẫu nhiên trong một

parahaemolyticus Nếu một trong 3 mẫu đó có một mẫu dương tính thì lô mẫu đó là dương tính Dùng que cấy đầu tròn lấy một ít dịch tăng sinh ria lên môi trường TCBS

parahaemolyticus thì mẫu này được cho là âm tính đối với vi khuẩn này và được dùng

để gây nhiễm

2 2.4.Phương pháp pha loãng vi sinh vật

xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Bước pha loãng này nhằm

chính xác hơn Tiến hành pha loãng dịch tăng sinh như sau:

pipetman và đầu týp vô trùng hút Ì mi dịch tế bào vi khuẩn cho vào 1 ống nghiệm

2 2.5.Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp này được thực hiện với mục đích xác định mật độ tế bào V

parahaemolyticus để gây nhiễm vào mẫu thực tế với số lượng đã định hoặc thực hiện

như sau: chuyển vô trùng 0,1 mi dịch vi khuẩn ở các bậc pha loãng đã chọn lên bề mặt đĩa môi trường PCA Dùng thanh gạt (que trải) thủy tinh đã được khử trùng trải đều

37°c Đếm khuẩn lạc sau 24 giờ Thực hiện trải đĩa ở 3 bậc pha loãng liên tiếp sao cho

mật độ vi khuẩn được ước đoán trong khoảng 25 - 250 tế bào/đĩa Mỗi độ pha loãng được trải trên 2 đĩa khác nhau

lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250 Đếm tất cả các khuẩn lạc có trên mỗi đĩa

2 2.6.Phương pháp gây nhiễm vi khuẩn lên mẫu thực phẩm

Cho 225ml môi trường pepton kiềm 2%NaCl vào túi PE vô trùng có chứa 25g

parahaemolyticus cần gây nhiễm, ủ tăng sinh trong tủ ấm ở 37°c trong 20 giờ

2 2.7.Phương pháp nuôi cấy V parahaemolyticus

Phương pháp nuôi cấy V parahaemolyticus được tiến hành theo tiêu chuẩn của

để đánh giá phương pháp PCR

parahaemolyticus trên môi trường này có đặc trưng như sau: khuẩn lạc có màu xanh, láng, bóng, nhô cao, đường kính khoảng 3 - 4mm, tâm khuẩn lạc đậm màu hơn Màu

Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc đặc trưng cấy lên 3 ống nghiệm chứa môi trường TSA

đúng cho khuẩn lạc nào thì khẳng định đó là chủng V parahaemolyticus dương tính

parahaemolyticus

2.2.8.Th ử nghiệm Oxidase

phenol có màu xanh dương

trường TSA 2% NaCl sang giấy lọc Nhỏ một giọt thuốc thử oxidase lên sinh khối và

màu xanh dương; phản ứng là (-) khi sinh khối không chuyển màu V

parahaemolyticus có phản ứng dương tính với thuốc thử oxidase nên sinh khối sẽ