THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KIỀU THỊ DIỄM TRANG THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh - Năm 2005 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn chân thành, xin cảm ơn: Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh cung cấp cho kiến thức quý báu suốt khóa học Thầy Trần Linh Thước hướng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn Thầy Nguyễn Tiến Dũng quan tâm theo sát bảo suốt trình làm luận văn Các em Huệ, Na em Phòng Công Nghệ Gen Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên nhiệt tình giúp đỡ suốt trình thực nghiệm Nhân xin chân thành cảm ơn sở Giáo dục Đào tạo tỉnh Đồng Tháp, Ban Giám hiệu Trường Phổ thông Trung học thị xã Sa Đéc tạo điều kiện thuận lợi cho suốt khóa học Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2005 Kiều Thị Diễm Trang iii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AOAC: Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội nhà hóa học phân tích nhà nước) bp: Base pair (cặp base) CDC: Center for Disease Control (Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh) CFU: Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) Da: Dalton (đơn vị khối lượng protein) DNA: Deoxyribonucleic acid (AND) dNTP: 2' - Deoxynucleoside - 5' - triphosphate (nucleotide dùng để tổng hợp DNA) ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme) FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực Nông nghiệp) FDA: Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm) ISO: International Standards Organization (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế) kb:Kilo base (1.000 base) kDa: Kilo Dalton (1.000 da) Mb: Mega base (1.000.000 base) MPN: Most Probable Number (số có xác suất cao nhất, số tối khả) NĐTP: ngộ độc thực phẩm NordVal: Nordic System for Validation of Alternative Biological Method (Hệ thống đánh giá phương pháp sinh học thay Nordic) PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuồi tổng hợp polymerase) TAE: Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Taq: Thermus aquaticus TE: Tris-EDTA TDH: Thermostable direct hemolysin (hemolysin trực tiếp bền nhiệt) iv TL: Thermolabile hemolysin (hemolysin bền nhiệt) TRH: Thermostable Related hemolysin (hemolysin liên quan đến TDH) UV: Ultraviolet (tia tử ngoại) V parahaemolyticus: Vibrio parahaemolyticus v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii T T BẢNG CHỮ VIẾT TẮT iv T T MỤC LỤC vi T T ĐẶT VẤN ĐỀ T T PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU T T 1.1.Ngộ độc thực phẩm T T 1.1.1.Ngộ độc thực phẩm vi sinh vật đặc điểm T T 1.1.2.Thực trạng NĐTP giới Việt Nam T T 1.1.3.Một số vi sinh vật gây bệnh thực phẩm thường gặp T T 1.2.Đặc điểm sinh học bệnh học Vibrio parahaemolyticus T T 1.2.1.Đặc điểm hình thái tăng trưởng T T 1.2.2.Đặc điểm sinh hóa miễn dịch 10 T T 1.2.3.Đặc điểm bệnh học 12 T T 1.2.3.1.Bệnh chế gây bệnh 12 T T 1.2.3.2.Gen mã hóa độc tố 13 T T 1.2.3.4.An toàn V parahaemolyticus thực phẩm 15 T T 1.3.Phương pháp phát V parahaemolyticus thực phẩm 15 T T 1.3.1.Phương pháp nuôi cấy truyền thống 15 T T 1.3.2.Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 16 T T 1.3.3.Phương pháp lai phân tử (Hybridization) 17 T T 1.3.4.Phương pháp PCR 18 T T 1.3.4.1.Nguyên tắc 18 T T 1.3.4.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 19 T T vi 1.3.4.3.Một số ưu điểm nhược điểm phương pháp PCR phát T vi sinh vật gây bệnh thực phẩm 21 T 1.3.4.4.Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR để phát V T parahaemolyticus thực phẩm 21 T 1.4.Xác nhận hiệu lực phương pháp sinh học 22 T T 1.4.1.Định nghĩa khái niệm 22 T T 1.4.2.Các bước xác nhận hiệu lực 23 T T 1.4.3.Các thông số kỹ thuật xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi T sinh vật 23 T 1.4.4.Ý nghĩa việc xác nhận hiệu lực 25 T T PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 T T 2.1.Vật liệu 26 T T 2.1.1.Thiết bị dụng cụ 26 T T 2.1.2.Hóa chất môi trường 26 T T 2.1.3.Vật liệu thí nghiệm 27 T T 2.2.Phương pháp 28 T T 2.2.1.Thu xử lý mẫu 28 T T 2.2.2.Đồng mẫu tăng sinh 28 T T 2.2.3.Xác định mẫu âm tính 28 T T 2.2.4.Phương pháp pha loãng vi sinh vật 29 T T 2.2.5.Định lượng phương pháp đếm khuẩn lạc 29 T T 2.2.6.Phương pháp gây nhiễm vi khuẩn lên mẫu thực phẩm 30 T T 2.2.7.Phương pháp nuôi cấy V parahaemolyticus 30 T T 2.2.8.Thử nghiệm Oxidase 31 T T 2.2.9.Thử nghiệm KIA 32 T T vii 2.2.10.Thử nghiệm Lysine Dercarboxylase (LDC) 33 T T 2.2.11.Thử khả chịu mặn 34 T T 2.2.12.Thử nghiệm ONPG 35 T T 2.2.13.Khảo sát điều kiện ly trích khuôn DNA từ dịch tăng sinh mẫu thực T phẩm xử lý nhiệt 36 T 2.2.14.Điều kiện tiến hành phản ứng PCR 37 T T 2.2.15.Điện di phân tích 38 T T 2.2.16.Kiểm chứng tính chuyên biệt cặp mồi TL 38 T T 2.2.17.Kiểm chứng điều kiện tối ưu phản ứng 38 T T 2.2.18.Khảo sát thời gian tăng sinh tối thiểu phát V.parahaemolyticus T mẫu thủy sản 39 T 2.2.19.Kiểm chứng độ nhạy phản ứng PCR 39 T T 2.2.20.Xác định giới hạn phát V parahaemolyticus mẫu thực tế 39 T T 2.2.21.Xác định thông số kỹ thuật phản ứng PCR 40 T T 2.2.22.Đánh giá độ lặp lại phương pháp thay 41 T T 2.2.23.Đánh giá độ ổn định phương pháp thay 41 T T 2.2.23.Ứng dụng qui trình phát V parahaemolyticus phương pháp T PCR vào thực tế 42 T PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43 T T 3.1.Phân lập chủng V parahaemolyticus từ mẫu thủy sản 43 T T 3.2.Xây dựng qui trình phát V parahaemolyticus thực phẩm T phương pháp PCR 44 T 3.2.1.Thời gian xử lý nhiệt trích khuôn DNA 44 T T 3.2.2.Khả khuếch đại cặp mồi TL 45 T T 3.2.3.Độ chuyên biệt cặp mồi TL phát V parahaemolyticus T thực phẩm 46 T viii 2.2.4.Điều kiện tối ưu phản ứng PCR 47 T T 3.2.5.Thời gian tăng sinh tối thiếu phát V.parahaemolyticus mẫu T thủy sản 50 T 3.2.6.Độ nhạy phản ứng PCR 51 T T 3.2.7.Qui trình phát V parahaemolyticus thực phẩm phản T ứng PCR 52 T 3.3.Xác nhận hiệu lực phương pháp PCR phát V parahaemolyticus T thực phẩm 54 T 3.3.1.Giời hạn phát V parahaemolyticus thực phẩm phản T ứng PCR 54 T 3.3.2.Xác định thông số kỹ thuật qui trình PCR 56 T T 3.3.3.Đánh giá độ lặp lại 58 T T 3.3.4.Đánh giá độ ổn định 59 T T 3.4.Ứng dụng qui trình PCR phát V parahaemolyticus mẫu thực T tế 63 T PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 T T 4.1 Kết luận 66 T T 4.2.Đề nghị 67 T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 T T PHỤ LỤC 70 T T ix Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Không phải ngẫu nhiên mà hàng năm vào khoảng tháng tư nước ta lại rầm rộ quân với phong trào "Tháng hành động vệ sinh an toàn thực phẩm" Chủ đề phong trào ương năm 2005 "Sản xuất, kinh doanh sử dụng thực phẩm theo pháp lệnh vệ sinh an toàn thực phẩm" [15] Những năm gần nhiều vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) bếp ăn tập thể, nhà hàng, khách sạn xảy ra; số vụ ngộ độc có xu hướng ngày tăng ý thức vệ sinh an toàn thực phẩm người dân chưa cao NĐTP gây tổn thất lổn kinh tế mà có khả ảnh hưởng nghiêm trọng cho sức khỏe trước mắt lâu dài NĐTP không vấn đề đáng lo ngại nước nghèo phát ừiển, nước phát triển mà nước phát triển Theo Tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm số ca ngộ độc thực phẩm Mỹ 175 ca/1000 dân, Anh New Zealand 190 ca/1000 dân, úc 220 ca/1000 dân, Việt Nam trung bình có khoảng 7000 ca/năm Tổn thất gây vụ NĐTP cấp tính số nước phát triển 1.679 đô úc (úc), 1.531 đô Mỹ (Hoa Kỳ), 789 bảng (Anh), 1.100 đô Canada (Canada) [13] Có nhiều nguyên nhân gây NĐTP, nguyên nhân vi sinh vật chiếm tỉ lệ cao Trong số vi sinh vật gây bệnh Vibrio parahaemolyticus (V parahaemolyticus), Salmonella spp, Shigella spp xem mối đe dọa, gánh nặng bệnh tật đến sức khỏe người Việt Nam [17] V parahaemolyticus loài vi khuẩn ưa mặn, xuất nhiều loài thủy hải sản vùng nước ấm ven bờ biển Nước ta có hệ thống sông rạch chằng chịt bờ biển dài 3.260 km, có nguồn lợi thủy hải sản vô to lớn, không đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nội địa mà tạo nguồn hàng xuất mạnh thị trường quốc tế Do việc kiểm tra giám sát diện V parahaemolyticus thực phẩm thủy hải sản vô quan trọng Việc phát vi sinh vật thực phẩm thường thực phương pháp nuôi cấy truyền thống Phương pháp tốn nhiều thời gian, công sức lao động nên làm ứ động hàng hóa, ngăn cản lưu thông, tăng chi phí sản xuất Vì vậy, việc tìm phương pháp mới, nhanh, nhạy xác để phát vi sinh Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang Kết cho thấy, thay đổi nồng độ Mg2+ phản ứng từ 1-4mM P P không làm ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR Do sai số cho phép lon 2,5 ± 1,5 - Anh hưởng nhiệt độ bắt cặp mồi khuôn phản ứng PCR Nhiệt độ bắt cặp chọn dựa Tm mồi Thông thường qui trình chọn nhiệt độ bắt cặp ban đầu nhỏ Tm mồi từ - 6°C Nhiều tác giả chọn 54 55°C làm nhiệt độ khảo sát nhiệt độ thường tối ưu cho hầu hết cặp mồi có chiều dài 20bp Trong qui trình thiết lập, chọn nhiệt độ bắt cặp 55°C tiến hành khảo sát ảnh hưởng thay đổi nhiệt độ bắt cặp khoảng 50 - 62°C đến kết phản ứng PCR Kết trình bày Bảng 14 Hình 21 62 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang Kết cho thấy nhiệt độ bắt cặp mồi khuôn dao động khoảng 50 - 62°C 3.4.Ứng dụng qui trình PCR phát V parahaemolyticus mẫu thực tế Khảo sát nhằm mục đích áp dụng qui trình thiết lập vào việc phát V parahaemolyticus mẫu thực phẩm thị trường, qua đánh giá sơ tỉ lệ nhiễm vi sinh vật loại thực phẩm Việc phân tích thực đồng thời hai phương pháp PCR nuôi cấy để khẳng định khả thay phương pháp PCR Số lượng mẫu thực phẩm khảo sát 100 mẫu đại diện cho nhóm mẫu khác thu từ chợ siêu thị địa bàn Tp Hồ Chí Minh Kết khảo sát trình bày Bảng 15 63 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 64 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang Kết Bảng 15 cho thấy tỉ lệ mẫu nhiễm V parahaemolyticus 38% (phương pháp PCR) 36,5% (phương pháp nuôi cấy) nhóm thủy hải sản, 5% (PCR) 0% (nuôi cấy) nhóm thịt, 0% (PCR nuôi cấy) nhóm sữa, trứng rau Nhóm thủy hải sản nhóm có tỉ lệ nhiễm V parahaemolyticus cao, nhóm trứng, sữa rau khảo sát không bị nhiễm V parahaemolyticus Tỉ lệ nhiễm chung 21% (đối với phương pháp PCR) 19% (đối với phương pháp nuôi cấy) Như tỉ lệ nhiễm V parahaemolyticus mẫu thực phẩm động vật cao Qua kết phân tích cho thấy phương pháp PCR có độ nhạy cao phương pháp truyền thống ương việc phát V parahaemolyticus thực phẩm Như phương pháp PCR hoàn toàn thay cho phương pháp vi sinh truyền thống việc phát V parahaemolyticus thực phẩm 65 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Các kết thực nghiệm cho phép rút số kết luận sau: - Đã xây dựng thành công qui trình phát V parahaemolyticus thực phàm băng phương phápvcho phép phát V parahaemolyticus mật độ CFU/25g thực phẩm thời gian tối đa 24 (20 tăng sinh, thực phản ứng PCR) - Đã tiến hành đánh giá hiệu lực qui trình phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy theo tiêu chuẩn NordVal (NV-DOC.D-2004-01-01) cho phép kết luận: + PCR có độ ổn định cao dễ dàng thao tác + Mức dao động cho phép thành phần tham gia phản ứng: Taq DNA polymerase, – 4U; mồi TL, 2,5 - 6,25pM; MgCl , 1,0 - 4,0mM; nhiệt độ bắt cặp R R mồi khuôn, 50 - 62°C + So với phương pháp nuôi cấy, phương pháp PCR có độ nhạy tương đối, độ đặc hiệu tương đối độ xác tương đối 100%, tì lệ dương tính giả âm tính giả 0% - Đã áp dụng qui trình PCR để khảo sát tỉ lệ nhiễm V parahaemolyticus 100 mẫu đại diện cho nhóm thực phẩm (thủy hải sản, thịt, trứng, sữa rau quả) địa bàn Tp Hồ Chí Minh Tỉ lệ nhiễm V parahaemolyticus trung bình ương mẫu thực phẩm kiểm 21% (bằng phương pháp PCR) 19% (bằng phương pháp nuôi cấy) - Các kết cho phép kết luận qui trình PCR để phát V parahaemolyticus thực phẩm dựa cặp mồi TL thay phương pháp vi sinh truyền thống 66 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 4.2.Đề nghị Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên số nội dung chưa thực Để hoàn thiện qui trình thiết lập đưa qui trình áp dụng rộng rãi thực tế, đề nghị số điểm sau: - Thực bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để có đủ sở triển khai phương pháp PCR phát V parahaemolyticus vào thực tế - Thực khảo sát diện V parahaemolyticus loại thực phẩm diện rộng vào thời điểm khác năm để đánh giá xác tỉ lệ nhiễm V parahaemolyticus thực phẩm thị trường 67 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt 1.Lê Huy Chính, Cẩm nang vi sinh vật y học, NXB Y Học, Tp Hồ Chí Minh, (2005) 2.Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục, Tp Hồ Chí Minh, (2003) 3.Đỗ Đình Địch, Ngộ độc thực phẩm, Nhà xuất Y Học Giải Phóng, (1976) 4.Vũ Quang Huy, Tìm hiểu phân bố Vibrio cholerae số Vibrio khác bệnh ỉa chảy cấp ven đô Thành phố Hồ Chí Minh (1989-1990) tính nhạy cảm thuốc in vitro chúng, Luận án phó tiến sĩ Khoa học Y Dược, Học viện Quân Y, Bộ Quốc Phòng, (1993) 5.Tiến Khâm, "Vệ sinh thực phẩm mối lo cho sức khỏe người", Tạp chí Sức khỏe đời sống, số 40, tr 40, tháng 04/1998 6.Trương Lê Na cộng sự, Thiết lập qui trình phát Vibrio parahaemolyticus mẫu thủy hải sản kỹ thuật PCR, Những vấn đề nguyên cứu khoa học sống, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 439 - 442, (2004) 7.Phạm Văn Tất, "Nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm Saỉmonella", Thuốc sức khỏe, số 73, tr 20, ngày tháng 8/1996 8.Phạm văn Tất, "Ngộ độc thực phẩm hai năm qua", Thuốc sức khỏe, số 138, tr 10, ngày 15 tháng 4/1999 9.Nguyễn Chí Thuận cộng sự, Xác định gen độc tố Thermostable dỉrect hemolysin (tdh) Vibrìo parahaemolyticus kỹ thuật lai AND, Những vấn đề nguyên cứu khoa học sống, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 475 - 478, (2004) 10.Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất Giáo Dục, Tp Hồ Chí Minh, (2003) 11.http://hanoi.vnn.vn/yduoc/index.asp?sora 68 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 12.http://www.cimsi.org.vn/tapchi/sottyd/nam200(Vbai2-5-2000.htm 13.http://www.cimsi.org.vn/tapchi/sottyd/bai2-5-2001 htm 14.http://www.cimsi.org.vn/tapchi/sottyd/so7-2001 htm 15.http://www.nea.gov vn/thongtinmƯnoidung/pl4_ 10_5_04.htm 16.http://www.moh.gov.vn/Chamsocsuckhoecongdong/Ngodoc.htm 17.http://www.vnn.vn/khoahoc/suckhoe/2004/! 1/344943/ 18.http://www.vtv.vn/vi-vn/VTV2/skcmn/2005/l/37172.vtv 19.http://www.yds.edu.vn/Tcyh-tphcm/!9961997/thuc%20an%20& %20cac%20benh%20nhiem%20trung%20tieu%20hoa.htm B.Tài liệu tiếng Anh 20.http ://w ww.microbiology scu.edu tw/wong/research/vp-eng.htm 21.http ://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-9.html 22.http ://w w w foodsafety ttu edu/pptfiles/cholera ppt 23.http://www.genome.gen-info-osaka-u.ac.jp/bacteria/ vpara/overview htm 24.http://www.journals.uchicago.edu//cgi-bin/resolve?id=doi: lo 1086/ 345731 25.http://www.lapublichealth.org/acd/news/phl00/acdn2209.pdf 26.http://www.medscape.eom/viewarticle/414448 27.http://www.nzfsa.govt.nz/science-technology/data-sheets/vibrioparahaemolyticus.pdf 28.http://www.nzfsa.govt.nz/science-technology/risk-profiles/vibrioparahaemolyticus.pdf 29.http ://www shellíishquality ca/vibrio.htm 69 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang PHỤ LỤC This image cannot currently be displayed 70 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 71 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 72 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 73 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang This image cannot currently be displayed 74 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 75 Thiết lập qui trình… Kiều Thị Diễm Trang 76