Xây dựng quy trình phát hiện clostridium perfringens trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR polymerase chain reaction và thử nghiệm ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ NGỌC YẾN XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KĨ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2005 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng chân thành, tơi xin cảm ơn: Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh cung cấp cho tơi kiến thức quý báu suốt khóa học Thầy PGS.TS Trần Linh Thước ThS Nguyễn Tiến Dũng tận tâm hướng dẫn tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt luận văn Thầy Long, bạn Huệ, Na, Phượng, Ánh, Thanh, Loan Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Sinh học, Phịng Thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh hết lịng giúp đỡ suốt thời gian thực nghiệm Nhân xin chân thành cảm ơn Sở Giáo dục Đào tạo Tp Hồ Chí Minh, Ban Giám Hiệu Trường Trung học phổ thông Trần Phú tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt khóa học Thành phố Hồ Chí Minh tháng – 2005 Nguyễn Thị Ngọc Yến BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AOAC : Association of Official Analytical Chemist (Hiệp Hội nhà hóa học phân tích nhà nước) Bp : base pair (cặp base) CFU : Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) kDa : Kilo Dalton (1.000 da) DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : 2'- Deoxynucleoside - 5'- triphosphate (nucleotide dùng để tổng hợp DNA) ELISA : Enzyme - linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzim) ISO : International Standards Organization (Tổ chức Tiêu chuẩn quốc tế) NordVal : Nordic System for Validation of Alternative Biological Method (hệ thống Nordic đánh giá phương pháp sinh học thay thế) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi tổng hợp polymerase) TAE : Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Taq : Thermus aquaticus TE : Tris - EDTA MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 0T 0T BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 0T 0T MỤC LỤC 0T T MỞ ĐẦU 0T T CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 12 0T 0T 1.1 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 12 T 0T 1.2 KHÁI QUÁT VỀ GIỐNG CLOSTRIDIUM 12 T T 1.2.1 Đặc điểm chung [4], [20] 12 T T 1.2.2 Các tác hại Clostridium [4], [17] 13 T T 1.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 13 T T 1.3.1 Lịch sử phát [2], [10] 13 T T 1.3.2 Đặc điểm sinh học 14 T 0T 1.3.2.1 Hình thái sinh lí tế bào [1], [2] 14 T T 1.3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy [1] 14 T T 1.3.2.3 Đặc điểm sinh hóa [8], [9] 15 T T 1.3.2.4 Phân loại [10], [16] 15 T T 1.4 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO C PERFRINGENS 16 T T 1.4.1 Nguyên nhân triệu chứng ngộ độc thực phẩm C perfiingens [5], [9] T T 16 1.4.2 Độc tố đường ruột C perfringens [9], [11] 17 T T 1.4.3 Các tiêu C perfringens thực phẩm [4] 19 T T 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN C PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 20 T T 1.5.1 Phương pháp nuôi cấy [4], [8] 20 T T 1.5.2 Phương pháp ELISA (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) [18, 19] T T 21 1.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [6], [7] 21 T T 1.5.4 So sánh ưu nhược điểm phương pháp 22 T T 1.6 KĨ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM 22 T 0T 1.6.1 Nguyên tắc kĩ thuật PCR [3], [4] 22 T T 1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR [3], [4] 24 T T 1.6.3 Ưu nhược điểm phương pháp PCR phát vi sinh vật gây T bệnh thực phẩm 26 0T 1.7 XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ 27 T T 1.7.1 Các khái niệm [13], [14] 27 T T 1.7.2 Các bước xác nhận hiệu lực [13], [14] 28 T T 1.7.3 Các thông số kĩ thuật quỉ trình xác nhận hiệu lực phương pháp định T tính vi sinh vật 28 0T 1.7.4 Ý nghĩa việc xác nhận hiệu lực 30 T T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 0T T 2.1 VẬT LIỆU 32 T 0T 2.1.1 Dụng cụ thiết bị 32 T 0T 2.1.2 Hóa chất môi trường 32 T 0T 2.1.2.1 Hóa chất 32 T 0T 2.1.2.2 Môi trường 34 T 0T 2.1.3 Nguyên vật liệu 35 T 0T 2.2 PHƯƠNG PHÁP 36 T 0T 2.2.1 Phương pháp thu xử lí mẫu 36 T T 2.2.2 Pha loãng mẫu 36 T 0T 2.2.3 Đồng mẫu 37 T 0T 2.2.4 Xác định mẫu âm tính 37 T 0T 2.2.5 Định lượng Clostridium perfringens 37 T T 2.2.6 Phương pháp phân lập khẳng định C perfringens từ mẫu thực T phẩm 39 T 2.2.7 Phương pháp loại bỏ ôxi khỏi môi trường nuôi cấy 40 T T 2.2.8 Gây nhiễm C perfiingens lên mẫu thực phẩm 41 T T 2.2.9 Thu xử lí khn DNA cho phản ứng PCR 41 T T 2.2.10 Điều kiện phản ứng PCR 42 T T 2.2.11 Phân tích sản phẩm PCR điện di gel agarose 42 T T 2.2.12 Khảo sát điều kiện tối ưu phản ứng PCR 42 T T 2.2.13 Khảo sát thời gian tăng sinh tối thiểu phát C perfringens mẫu T thực phẩm 43 0T 2.2.14 Xác định tính chuyên biệt cặp mồi PL 43 T T 2.2.15 Khảo sát độ nhạy phát C perfringens PCR 43 T T 2.2.16 Xác định giới hạn phát C perfringens 44 T T 2.2.17 Xác định thông số kĩ thuật tương đối phương phấp PCR so với T phương pháp nuôi cấy 44 0T 2.2.18 Ứng dụng quy trình PCR để phát C perfringens mẫu thực T phẩm 46 T CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47 0T T 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 47 T 0T 3.1.1 Tính chuyên biệt cặp mồi phát Clostridium perfringens T phương pháp PCR 47 0T 3.1.2 Khảo sát điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR 48 T T 3.1.2.1 Xác định nồng độ Mg2+ tối ưu 48 T P P T 3.1.2.2 Xác định nồng độ mồi tối ưu 49 T T 3.1.2.3 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 50 T T 3.1.3 Thời gian tăng sinh cần thiết để phát C perfringens thực phẩm T phản ứng PCR 51 0T 3.1.4 Khảo sát độ nhạy phản ứng PCR phát C perfringens 52 T T 3.1.5 Quy trình PCR phát C perfringens mẫu thực phẩm 53 T T 3.2 XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ PHÂN TÍCH C PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 56 T T 3.2.1 Phân lập định danh chủng C perfringens thực phẩm 56 T T 3.2.2 Giới hạn phát C perfringens mẫu thực phẩm 59 T T 3.2.3 Xác định thông số kĩ thuật tương đối phương pháp PCR so với T phương pháp nuôi cấy 60 0T 3.3 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐE KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM C PERFRINGENS TRÊN MẪU THỰC TẾ 63 T T KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 0T 0T TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 0T 0T MỞ ĐẦU Trong kinh tế xã hội phát triển nay, đời sống vật chất tinh thần người dân nâng cao Điều kéo theo yêu cầu chất lượng vệ sinh thực phẩm khắt khe Người tiêu dùng khơng địi hỏi cao chất lượng dinh dưỡng, cảm quan thực phẩm mà mức độ an tồn vệ sinh thực phẩm Tuy nhiên, thực tế cho thấy tình trạng ngộ độc thực phẩm năm gần lại xảy nhiều, chủ yếu vụ ngộ độc tập thể cơng ty, xí nghiệp, trường học, khu chế xuất., gây khơng hoang mang người tiêu dùng Trong số tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, vi sinh vật thường chiếm tỉ lệ gây ngộ độc cao nên việc kiểm nghiệm chúng thực phẩm quan tâm Vì vậy, vấn đề cấp bách cần phải có phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm hữu hiệu nhằm ngăn ngừa tình trạng ngộ độc giảm ca ngộ độc đến mức thấp Ngồi cần có phương pháp xét nghiệm tìm nguyên nhân gây ngộ độc để có biện pháp điều trị kịp thời Để đáp ứng nhu cầu trên, nhiều phương pháp kiểm nghiệm nhanh tự động hóa bước phát triển phổ biến rộng như: phương pháp phân tích miễn dịch (ELISA, IMS ), phương pháp PCR, phương pháp sử dụng mẫu dò, phương pháp phát dựa kĩ thuật phát quang sinh học [4] Góp phần vào việc nghiên cứu trình phát nhanh mầm bệnh vi sinh có thực phẩm, Trung tâm Khoa học Cơng nghệ với Phịng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh tiến hành quy trình khảo sát phát E coli, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus aureus, Shigella thực phẩm Hiện nay, tiếp tục hướng nghiên cứu việc khảo sát quy trình phát Clostridium perfringens gây bệnh thực phẩm phương pháp PCR Ngộ độc thực phẩm C perfringens gây không nguy hiểm ngộ độc thịt lại xảy phổ biến, đặc biệt nước phát triển Mỹ, Phần Lan Tại Mỹ, C perfringens tác nhân thường xuyên gây ngộ độc thực phẩm xếp vào hàng thứ ba sau Salmonella spp Staphylococcus aureus Tại Phần Lan, số vụ ngộ độc C perfringens gây chiếm 20% tổng số ca ngộ độc thống kê từ năm 1975 đến năm 1999 [12] Các trường hợp ngộ độc C perfringens gây phần lớn có liên quan đến loại đồ hộp, sản phẩm tạo điều kiện kị khí mơi trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển sinh độc tố Vì vậy, tiêu vi sinh thực phẩm đóng chai, đóng hộp khơng cho phép diện loại vi khuẩn Từ trước đến nay, nước ta việc phát C perfringens thực phẩm thường dựa phương pháp nuôi cấy vi sinh, sinh hóa truyền thống Các phương pháp có độ ổn định cao hạn chế mặt thời gian, tốn cơng lao động nên làm tăng chi phí sản xuất, tồn đọng hàng hóa Do hạn chế đó, việc phát nhanh, nhạy xác vi khuẩn thực phẩm cần thiết quan trọng Với phát triển nhanh chóng kĩ thuật sinh học phân tử nhiều phương pháp phát nhanh vi sinh vật thực phẩm thiết lập Các phương pháp phân tích có xu hướng rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, giảm bớt cơng lao động, thay phương pháp truyền thống việc phát đánh giá mức độ an toàn vi sinh thực phẩm Tuy nhiên, phương pháp số nhược điểm định, chưa đạt tất yêu cầu trên, chúng chưa phổ biến rộng rãi Trong đó, phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) xem phương pháp có nhiều ưu điểm Có nhiều nghiên cứu nước cố gắng thiết lập hồn thiện qui trình phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm lã thuật PCR, phương pháp chưa ứng dụng rộng rãi chưa xem phương pháp thức sử dụng để xét nghiệm C perfringens hệ thống phân tích đo lường Để phương pháp trở thành có giá trị sử dụng rộng rãi thi phương pháp cần xác nhận hiệu lực 10 Thioglycolate vô trùng, ủ tăng sinh 37°C qua đêm Hút 1ml dịch tăng sinh vào eppendorf l,5ml, li tâm 5000 vòng/phút phút để thu sinh khối Loại bỏ dịch bên trên, rửa tế bào lml nước cất vơ trùng Tiếp tục li tâm 5000 vịng/phút phút, loại bỏ phần nước thu sinh khối Huyền phù hóa sinh khối tế bào 100µl TE Xử lí nhiệt 100°C 10 phút Để nguội, li tâm 5000 vòng/phút phút để loại bỏ mảnh màng tế bào, thu dịch bên làm khuôn cho phản ứng PCR - Thực phản ứng PCR: Phản ứng PCR thực với thể tích 25µl eppendorf 0,5ml 0,2ml gồm thành phần Bảng Bảng Thành phần sử dụng phản ứng PCR phát C.perfringens Thành phần sử dụng Nồng độ (µl) Thể tích sử dụng (µl) Mồi PL3 pmol/µl Mồi PL7 pmol/µl MgCl 2,5 R Dung dịch đệm PCR 10 x 500mM KCL, 100mM Tris - HCL 2,5 dNTP 100mM 2,5 Khuôn DNA Taq DNA polimerase 1U/µl dH O R 0,5 12 R Phản ứng PCR thực theo chương trình khuếch đại: biến tính DNA 95°C phút; phản ứng PCR gồm 35 chu kì, chu kì gồm bước: 94°C 30 giây, 55°C 40 giây, 72°C 45 giây Sau phản ứng, sản phẩm PCR giữ 72°C 10 phút để đoạn DNA chưa tổng hợp hoàn chỉnh tiếp tục tổng hợp để hoàn tất chiều dài Sản phẩm khuếch đại giữ ổn định 4°C điện di phân tích sản phẩm - Phân tích sản phẩm khuyếch đại: 54 Sản phẩm sau khuếch đại điện di gel agarose 1,2% điện 110V 30 phút Sau điện di, sản phẩm nhuộm dung dịch ethidium bromide ương 10 phút, rửa lại nước quan sát tia UV có bước sóng 312nm - Xử lí kết quả: + Nếu xuất vạch tương đương với 283bp vạch chuẩn kết luận phản ứng PCR dương tính + Nếu khơng xuất vạch vạch có kích thước khác với 283bp kết luận phản ứng PCR âm tính Các bước quy trình phát C perfringens thực phẩm tóm tắt Hình 14 Vậy tổng thời gian cho tồn quy trình phát C perfringens khoảng 24 giờ; gồm khoảng 20 tăng sinh, thực phản ứng PCR xem kết quả, kể từ nhận mẫu cho kết So với phương pháp ni cấy truyền thống phải cần từ - ngày phương pháp PCR phát C perfringens thực phẩm cho kết nhanh Mẫu thực phẩm (10ml) + 90ml SPW Hút 1ml dịch tăng sinh vào eppendorf, li tâm 5000 vòng/ phút phút Rửa sinh khối tế bào nước cất vô trùng Li tâm 5000 vòng/ phút phút để thu sinh khối tế bào 55 Huyền phù sinh khối tế bào 100µl TE, xử lí nhiệt 1000C 10 phút P P Li tâm 5000 vòng / phút vòng, thu phần dịch bên Thực phản ứng PCR Điện di sản phảm PCR gel agarose 1,2% Xử lí kết Hình 14 Sơ đồ tóm tắt qui trình phát C perfringens thực phẩm phương pháp PCR 3.2 XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ PHÂN TÍCH C PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 3.2.1 Phân lập định danh chủng C perfringens thực phẩm Để có chủng C perfringens dùng cho việc xác nhận hiệu lực phương pháp PCR để xét nghiệm C perfringens, tiến hành phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu thực phẩm nguồn nước sông Sài Gịn Mẩu thực phẩm khơ mực, cá lưỡi trâu, cá cơm, cá vàng , mắm (mắm nêm, mắm cá sặc, mắm tôm, nước mắm ), thu từ chợ Tân Phú (Thủ Đức), chợ Bình Hưng Hịa (Bình Chánh), chợ Tam Bình (Thủ Đức) nước thu từ nguồn nước sơng Sài Gịn Từ 40 mẫu thực phẩm, nước sơng Sài Gịn chúng tơi phân lập 20 chủng (Bảng 9) có đặc trưng hình thái khuẩn lạc C perfringens môi trường ISA (Hình 15A) Các chủng khẳng định thử nghiệm khả 56 lên men lactose sinh axit, tính di động, thử nghiệm nitratase, gelatine Kết thử nghiệm cho phép khẳng định 20 chủng phân lập C Perfringens - Thử nghiệm khả lên men sữa: sau lên men môi trường ironmilk, sữa bị đông tụ axit sinh lên men lactose C perfringens (Hình 15B) - Khả di động: môi trường thạch mềm, C perfringens mọc theo đường cấy mà không mọc lan môi trường xung quanh Như vậy, C perfringens khơng có khả di động (Hình 15C) Hình 15 Kết phân lập khẳng định cấc chủng C perfringens A Khuẩn lạc C perfringens môi trường ISA; B Khả lên men lactose đông tụ sữa; C Tính khơng di động; D Khả khử nitrate; E Khả làm tan gelatin Khơng có C perfringens; Chủng C perfringens phân lập 57 - Khả khử nitrate: thêm sulphanilamide N-napthylenediamine vào môi trường nitrate broth có vi khuẩn mọc, mơi trường chuyển sang màu đỏ hồng Như vậy, C perfringens có khả khử nitrate thành nitrite (Hình 15D) - Khả thủy giải gelatine: sau 1-3 ngày nuôi cấy môi trường gelatin, vi khuẩn làm tan chảy môi trường Vậy C perfringens có khả thủy giải gelatin (Hình 15E) Bảng Kết phân lập chủng C perfringens loại thực phẩm STT Nguồn phân lập (theo nhóm thực phẩm) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Tôm khô Khô cá cơm trắng Khô cá cơm đen Khô cá vàng Khô cá vàng ướt gia vị Khô cá lù đù Khô cá lưỡi trâu Con ruốc trắng Con ruốc đỏ Tôm khô Khô cá sặt Chà Lạp xưởng bán lẻ Lạp xưởng Vissan Khơ bị Khổ mực Khơ mực tẩm gia vị Khơ cá lìm kìm Khơ cá phay Khơ mực Mắm cá lóc Mắm tơm Mắm ruốc Mắm nềm xay Mắm chua Mắm cá thu Mắm cá sặc Mắm cá sặc xay Địa điểm thu mẫu Chợ Bình Hưng Hịa Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Siêu thị Sài Gịn Chợ Bình Hưng Hịa Chợ Tân Phú Chợ Tam Bình Chợ Tam Bình Chợ Tam Bình Chợ Bình Hưng Hịa Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Chợ Tam Bình Chợ Tam Bình Chợ Tân Phú 58 Kết + + + + + + + + + + + + + + + Kí hiệu chủng 10 11 12 13 14 15 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Mắm cá linh Nước mắm bán lẻ Nước mắm Knor Nước mắm Chinsu Nước mắm Hưng Thịnh Nước mắm Phú Quốc Nước mắm Nha Trang Mắm ruốc Trí Hải Ba khía Dưa mắm Chợ Tân Phú Chợ Tân Phú Siêu thị Miền Đông Siêu thị Miền Đông Siêu thị Miền Đông Siêu thị Miền Đông Siêu thị Miền Đông Siêu thị Miền Đông Siêu thị Miền Đông Chợ Tân Phú Phía chân cầu Sài Gịn Rạch nhỏ sơng SG Nước sơng Sài Gịn Nước sơng Sài Gịn + + + + + 16 17 18 19 20 Bảng cho thấy vi khuẩn C perfringens diện nhiều thực phẩm khô, mắm 3.2.2 Giới hạn phát C perfringens mẫu thực phẩm Gây nhiễm mẫu thực phẩm xác định âm tính với C perfringens cách huyền phù tế bào C perfringens cho mật độ vi khuẩn đạt 0,1 - 5, - 10, 11 -20, 21 - 50 CFU/g mẫu ủ 37°C điều kiện kị khí Sau 24 nuôi cấy, lấy lml canh khuẩn để xử lí phân tích để xác định giới hạn phát mẫu thực phẩm phương pháp PCR Kết trình bày Bảng 10 Hình 16 Bảng 10 Giới hạn phát C perfringens loại mẫu thực phẩm Thời Mật độ C perfringens gây nhiễm (CPU/g) Mẫu gian 1-5 - 10 11 - 20 21 - 50 thực nuôi PCR Nuôi PCR Nuôi PCR Nuôi PCR Nuôi PCR Nuôi phẩm cấy cấy cấy cấy cấy cấy (giờ) 24 + + + + + + + + Patê gan 48 + + + + + + + + đóng 72 + + + + + + + + hộp Viên gia vị 24 - - + + + + + + + + 48 - - + + + + + + + + 72 - - + + + + + + + + 59 Hình 16 Giới hạn phát C perfringens loại mẫu thực phẩm - 6: Gia vị gây nhiễm; 7—11: Đồ hập gây nhiễm 1: Thang DNA 100bp; 2,7: 0CFU/g; 3, 8: 1- 5CFU/g; 4, 9: - 10CFU/g; 5,10: 11 20CFU/g; 6, 11: 21 - 50CFU/g Kết Bảng 10 Hình 16 cho thấy sau 24 tăng sinh, phương pháp PCR cho kết dương tính tất mẫu thực phẩm gây nhiễm với mật độ - 5CFU/g Kết phù hợp với kết phân tích phương pháp ni cấy Các mật độ gây nhiễm từ -10CFU/g hay cao hơn, phương pháp nuôi cấy phương pháp PCR cho cho kết dương tính loại mẫu thực phẩm gây nhiễm Kết khảo sát cho thấy phương pháp PCR có nhiều ưu điểm phương pháp nuôi cấy như: giới hạn phát tương đương phương pháp nuôi c, thời gian cho kết lại ngắn 3.2.3 Xác định thông số kĩ thuật tương đối phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Bảng 11 Kết phân tích C perfiingens mẫu thực phẩm STT Tên mẫu Viên nấu bún riêu Phomai Tiêu Sả Mẫu gây nhiễm Mẫu không gây nhiễm PCR Nuôi cấy PCR Nuôi cấy + + + + + + + + 60 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Xíu mại xốt cà Bị hầm Bắp non hộp Thịt heo xơng khói Cà chua Heo lát Viên nấu hủ tiếu Sữa đặc có đường Sữa tươi tiệt trùng Đậu trắng đóng hộp Đậu Hà lan đóng hộp Pate gan Bột canh Sữa chua Cà nấu ragu hộp Khóm + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - Các thông số kĩ thuật phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đánh giá dựa 20 mẫu thực phẩm thuộc nhóm: sữa, thịt, rau quả, gia vị âm tính với C perfringens gây nhiễm với mật độ - 10CFU/g Mầu gây nhiễm phân tích đồng thời phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy Kết phân tích trình bày Bảng 11 Từ kết Bảng li tóm tắt mối tương quan kết phân tích phương pháp PCR nuôi cấy Bảng 12 Bảng 12 Mối tương quan kết phân tích phương pháp PCR phương pháp ni cấy truyền thống Phương pháp PCR Số kết dương tính Số kết âm tính Phương pháp ni cấy Số kết dương tính Số kết âm tính PA = 16 PD = ND = NA = 23 PA (positive agreement): kết đồng dương tính (phương pháp PCR +; phương pháp nuôi cấy +) NA (negative agreement): kết đồng âm tính (phương pháp PCR -; phương pháp nuôi cấy -) ND (negative deviation): độ lệch âm (phương pháp PCR -; phương pháp nuôi cấy +) 61 PD (positive deviation): độ lệch dương (phương pháp PCR +; phương pháp nuôi cấy -) Từ liệu Bảng 12, thông số kĩ thuật tương đối phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy đước tính tốn sau: -Độ xác tương đối AC (%) = SE (%) -Độ nhạy tương đối= PA × 100 16 × 100 = = 94,1% PA + ND 16 + -Độ đặc hiệu tương đối= SP(%) NA × 100 23 × 100 = = 100% PA + PD 23 + PD × 100 × 100 = = 0% PD + NA + 23 -Độ lệch dương FP = (%) -Độ lệch âm FN(%) = ( PA + NA) × 100 (16 + 23) × 100 = = 97,5% PA + NA + PD + ND 16 + 23 + + ND × 100 1× 100 = = 5,8% ND + PA + 16 ( PD − ND − 1)2 ( − − 1)2 = = = -Độ khác biệt χ ND + PD 1+ Các thông số kĩ thuật cho thấy phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy cho kết tương đồng chấp nhận Với 20 mẫu âm tính 20 mẫu gây nhiễm khảo sát, độ xác tương đối 97,5%, độ đặc hiệu tương đối 100%, độ nhạy tương đối 94,1% Hai phương pháp có độ lệch âm 0%, độ lệch dương 5,8% Giá trị χ2