Nghiên cứu phát triển bệnh viêm ruột hoạt tử ở lợn và gà do chủng vi khuẩn clostridium perfringens bằng kỹ thuật PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC “NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH VIÊM RUỘT HOẠT TỬ Ở LỢN VÀ GÀ DO CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS BẰNG KỸ THUẬT PCR” NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Bích Hồng Sinh viên thực : Nguyễn Lê Nhật Trang Mã sinh viên : 1653070317 Lớp : K61A – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội -2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Hà Bích Hồng tận tình hướng dẫn, bảo suốt q trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ, bảo tận tình cho em khơng q trình làm khóa luận mà trình học tập, bồi dưỡng Trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi trình học tập, sinh hoạt, làm nghiên cứu khoa học hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Vì điều kiện thời gian, khả thân cịn có hạn chế nên Khóa luận tốt nghiệp cịn có thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp q báu thầy giáo, nhà khoa học bạn sinh viên để khóa luận em hồn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Lê Nhật Trang i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU vi CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Bệnh truyền nhiễm 1.1.1 Khái niệm bệnh truyền nhiễm 1.1.2 Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm 1.2 Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà lợn 1.2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử ở gà lợn 1.2.3 Bệnh viêm ruột hoại tử gà 11 1.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm gia súc, gia cầm 15 1.3.1 Phương pháp truyền thống 15 1.3.2 Phương pháp đại 16 1.3.3 Chẩn đoán kĩ thuật PCR 19 CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mục tiêu đề tài 28 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 28 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 28 2.2 Đối tượng nghiên cứu 28 2.3 Phạm vi nghiên cứu 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Mẫu bệnh phẩm, hóa chất trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 29 ii 2.4.1 Mẫu bệnh phẩm 29 2.4.2 Hóa chất thí nghiệm 29 2.4.3 Trang thiết bị nghiên cứu 29 2.4.4 Dụng cụ thí nghiệm 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1 Thu nhận, bảo quản mẫu bệnh phẩm 30 2.5.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm 30 2.5.3 Kỹ thuật PCR 30 2.5.4 Kỹ thuật điện di 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết tách chiết DNA 33 3.1.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm lợn 33 3.1.2 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm gà 34 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn 35 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 38 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết đầy đủ STT Từ viết tắt AC-ELISA AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome DNA Deoxyribonucleic Acid ELISA FA Flourescence Assay ILT Infectious Laryngotracheitis ILTV IP ITS Internal Strancribed Spacer 10 NE Necrotic Enteritis 11 ORT Ornithobacterium Rhinotracheale 12 PCR Polymerase Chain Reaction 13 RNA Ribonucleic Acid 14 SARS Severe Acute Respiratory Syndrom 15 SDS 16 Ta Temperature annealing 17 Tm Temperature melting Antigen Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Enzyme Linked Immunosorbent Assay Infectious Laryngotracheitis Virus Immunoperoxidase Sodium Dodecyl Sulfate iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các typ độc tố vi khuẩn C perfringens Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn 13 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.2: Mồi sử dụng đề tài 31 Bảng 2.3 : Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 32 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Clostridium perfringens qua kính hiển vi Hình 3.1: Kết kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác lợn chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử gel agarose 1% 33 Hình 3.2: Kết kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 34 Hình 3.3: Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 16S_F/R mẫu DNA tách từ phân Heo chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 36 Hình 3.4: Kết PCR với cặp mồi 16S_F/R 37 Hình 3.5: Kết nhân đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens từ mẫu bệnh phẩm gà 38 Hình 3.6: Quy trình phát bệnh ở gia súc, gia cầm phương pháp PCR 41 vi MỞ ĐẦU Trong lĩnh vực chăn nuôi gia xúc, gia cầm, bệnh truyền nhiễm xem trở ngại lớn ảnh hưởng đến tăng trưởng phát triển bền vững ngành chăn nuôi ở nước ta Những tác hại mà bệnh truyền nhiễm mang đến như, bệnh nhẹ: vật chủ tăng trưởng – chất lượng thịt kém, giảm sản lượng trứng, bệnh nặng: tử vong hàng loạt – gây ô nhiễm mơi trường Để kiểm sốt giảm thiểu hậu bệnh truyền nhiễm mang lại, cần phải xác định tác nhân gây bệnh làm sở để lựa chọn hoàn thiện giải pháp nhằm hạn chế sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) bệnh truyền nhiễm điển hình thường gặp ở ngành chăn nuôi chủng vi khuẩn Clostridium perfringens gây Bệnh thừa nhận toàn cầu thách thức bệnh dẫn đầu, ước tính phí tổn ngành gia cầm gần tỷ USD riêng năm 2015 Ở Việt Nam, công tác chẩn đoán bệnh gia xúc, gia cầm áp dụng kĩ thuật chẩn đoán truyền thống chủ yếu, hầu hết dựa vào triệu chứng vết bệnh tích ở vật chủ, hình thái, cấu tạo hoạt tính sinh học tác nhân gây bệnh, điều ảnh hưởng đến hiệu sử dụng thuốc thuốc kháng sinh bệnh có bệnh lý triệu chứng tương đồng Tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh không hiệu dẫn đến bệnh khơng tiêu diệt triệt để, hình thành ổ dịch tự nhiên, thúc đẩy tích lũy đột biến ở tác nhân gây bệnh Với phát triển lĩnh vực sinh học phân tử, tiêu biểu kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) kéo theo hàng loạt thành tựu khoa học mang tính thực dụng cao Ưu điểm phương pháp này: đơn giản, giá thành thấp nhanh chóng Do đó, lĩnh vực chẩn đoán bệnh, PCR xem phương pháp chẩn đốn xác tác nhân gây bệnh, phát đến phân chủng, áp dụng với nhiều dạng hàm lượng mẫu bệnh phẩm khác Xuất phát từ tính chất vượt trội kỹ thuật PCR lĩnh vực chẩn đốn bệnh, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu phát nhanh bệnh viêm ruột hoạt tử lợn gà chủng vi khuẩn Clostridium perfringens kỹ thuật PCR” CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Bệnh truyền nhiễm 1.1.1 Khái niệm bệnh truyền nhiễm Bệnh truyền nhiễm loại bệnh có khả lây lan nhanh chóng (từ quần thể nhỏ đến cộng đồng), thời gian ủ bệnh tương đối dài nên việc phát kiểm sốt bệnh vấn đề khó khăn y tế dự phịng Bên cạnh số bệnh có biểu hiện, triệu chứng bệnh có điểm tương tự nhau, bệnh xâm nhiễm ở loài hay nhiều loài định, mức độ phát tán bệnh trạng phụ thuộc vào đặc tính hình thái, cấu tạo cấu trúc sinh học tác nhân gây bệnh Bệnh truyền nhiễm nguyên nhân chủ yếu làm trì trệ phát triển bền vững lĩnh vực chăn nuôi, không thiệt hại kinh tế, mà cịn ảnh hưởng đến mơi trường, sức khỏe cộng đồng Một số bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại ngành chăn nuôi gia cầm ở Việt Nam như: dịch cúm gia cầm (12/2003), nước ta phải thiêu hủy 38 triệu tương đương với 380 tỷ đồng (https://www.nhandan.com.vn/kinhte/item/8045602-.html), hàng năm phải tiêu hủy hàng nghìn gia cầm trận dịch nhỏ, lẻ xảy thường xuyên rải rác khắp nước; hay bệnh viêm ruột hoại tử (NE), ORT (Vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale), viêm khí quản (Gallid herpesvirus 1), tiêu chảy (Vi khuẩn Escherichia Coli), thương hàn (Salmonella Gallinarum), bệnh phổ biến ở Việt Nam, bệnh xảy thường xuyên gặp điều kiện thời tiết dinh dưỡng thích hợp năm Điển hình trận dịch lợn tai xanh (Arterivirus), lở mồm long móng (Aphthovirus) gần dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever virus) gây thiệt hại vô cùng lớn cho ngành chăn ni (Đỡ Tiến Duy, 2015, 2016; Ngũn Đình Qt, 2015) Một số bệnh không gây tử vong thiệt hại kinh tế chúng mang đến chí cịn nghiêm trọng bệnh gây tử vong, bởi hậu bệnh làm vật chủ chậm phát triển giảm sản lượng trứng Các tác nhân gây bệnh hầu hết sinh vật nhân sơ, chúng sinh vật đơn bào có tần số đột biến cao, lợi vòng đời ngắn ngủi giúp cho tác nhân gây bệnh dễ dàng hình thành nên quần thể kháng kháng thể (hoặc kháng thuốc kháng sinh) thông qua tích lũy đột biến yếu tố chọn lọc Ngồi ra, ở sinh vật nhân sơ khơng có yếu tố sửa sai hệ gen ở sinh vật nhân thực, điều dẫn đến tỉ lệ đột biến ở sinh vật nhân sơ tăng cao Thứ yếu, phát tán bệnh từ quần thể cách ly nhỏ, bệnh lan truyền qua đường vận chuyển quốc tế, truyền máu, Thứ ba, phát tán virus có sẵn ở sinh vật khác địa vực (sống cách ly), nhà khoa học ước lượng ba phần tư bệnh bắt nguồn theo cách Các loài sinh vật xem ổ chứa tự nhiên chủng virus, bệnh SARS bùng phát năm 2002 ở Trung Quốc, nguyên nhân dơi, ổ chứa bệnh SARS bán làm thức ăn cùng thời điểm (World Health Organization) Một cách thức quan trọng khác tái tổ hợp di truyền vật chủ bị lây nhiễm nhiều chủng virus thời điểm Cụ thể virus cúm, xem nguyên nhân dẫn đến bùng phát đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918, virus 1918 gây đại dịch cho hậu đại 02 chủng virus cúm từ động vật có vú lồi chim thơng qua trơi dạt kháng ngun (antigenic drift), (https://www.cdc.gov/flu/about/viruses/change.htm) Bệnh phát tán thường thông qua đường sol khí, tiếp xúc trực tiếp với dịch thể nhiễm bệnh (máu, nước bọt , ), dụng cụ ô nhiễm (kim tiêm, đồ dùng sinh hoạt , ), hay vật trung gian (côn trùng, thức ăn ô nhiễm , ) Các tác nhân gây bệnh phá hủy hay giết tế bào việc giải phóng enzyme thủy phân từ lysosome làm phân giải màng tế bào vật chủ, thân tác nhân có thành phần phân tử độc tố phần protein lớp áo virus, phần lipid vi khuẩn… Mức độ phá hủy tế bào chủ mà tác nhân gây phụ thuộc vào khả tái sinh mơ bị lây nhiễm qua q trình phân chia tế bào Nhiều CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết DNA Đối với bệnh truyền nhiễm ở gia súc, gia cầm trước tiến hành lấy mẫu để tách chiết DNA phải có thơng tin loại tác nhân gây bệnh, quan mô nơi tác nhân gây bệnh ký sinh Từ đó, đưa định thu loại mẫu bệnh phẩm để tách chiết axit nucleic (DNA, RNA) phục vụ cho việc phát bệnh phương pháp PCR Cụ thể, với tác nhân gây bệnh virus thu dịch thể mô để tách chiết axit nucleic, vi khuẩn thu dịch thể, mơ, ký sinh trùng thu dịch thể, mơ, phân 3.1.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm lợn Hình 3.1: Kết kiểm tra DNA tởng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác lợn chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử gel agarose 1% Trong đó, mẫu máu (giếng 1), mẫu phân ( giếng 2), mẫu ruột (giếng 3) lợn chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử Hình 3.1 kết tách chiết DNA tổng số từ 03 mẫu bệnh phẩm lợn chẩn đoán mắc bệnh viêm ruột hoại tử DNA tách từ mẫu máu (Giếng 1, Hình 3.1) mẫu ruột (Giếng 3, Hình 3.1) có chất lượng tương đối tốt, hàm lượng DNA khơng nhiều đủ tiêu chuẩn để làm khuôn cho phản ứng 33 PCR Riêng DNA tách từ mẫu phân (Giếng 2, Hình 3.1) gần khơng quan sát thấy băng sáng nhiên sản phẩm tách DNA sử dụng để tiến hành phản ứng PCR PCR kỹ thuật nhạy cần lượng nhỏ DNA khn nhân đoạn gen mong muốn 3.1.2 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm gà DNA tách chiết từ mẫu máu sử dụng kit tách chiết “G-spinTM Total DNA Extraction Kit” theo hướng dẫn sử dụng Kết tách chiết DNA từ 06 mẫu máu bệnh phẩm thể hình 3.2 Trong đó, 04 mẫu máu chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử có chất lượng hàm lượng DNA khác (Hình 3.2A) Cụ thể, mẫu số 01 có hàm lượng DNA lớn so với mẫu lại chất lượng DNA tương đối tốt thể vạch sáng rộng dải smear (tạo thành DNA bị đứt gãy thành đoạn nhỏ) ngắn bên vạch DNA (Giếng 1, Hình 3.2A) Mẫu 02 03 có hàm lượng DNA thấp hẳn so với mẫu 01, chất lượng DNA tương đối tốt (Giếng 2, 3; Hình 3.2A) Riêng mẫu số 04 gần khơng nhìn thấy vạch sáng DNA, điều cho thấy hiệu tách chiết DNA từ mẫu chưa tốt (Giếng 4; Hình 3.2A) mẫu khơng sử dụng cho bước nghiên cứu Hình 3.2: Kết kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác gà chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử Trong đó, mẫu máu (A), mẫu ruột (B) gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 34 Kết tách chiết DNA tổng số từ 02 mẫu bệnh phẩm ruột Gà thể ở Hình 3.2B Trong đó, mẫu số 01 có hàm lượng DNA tương đối lớn DNA bị đứt gãy thể ở dải smear kéo dài xuống phía (Giếng 1, Hình 3.2.B) Sự đứt gãy DNA trình nghiền mẫu nitơ lỏng với lực mạnh thời gian nghiền mẫu khơng hồn tồn bảo quản lạnh nitơ, mà có thời điểm mẫu nghiền hết nitơ tạo điều kiện enzyme DNase tế bào hoạt động cắt phần DNA tổng số thành đoạn ngắn Với hàm lượng DNA lớn mẫu 01 cần pha lỗng 50 lần để đạt hàm lượng DNA thích hợp cho tiến hành phản ứng PCR Mẫu 02 khơng xuất vạch DNA (Giếng 2, Hình 3.2.B), điều cho thấy hiệu tách chiết DNA mẫu 02 không đạt mẫu không sử dụng cho bước nghiên cứu Nguyên nhân nhầm lẫn cột chứa dung dịch có DNA ống ly tâm 2.0ml khơng chứa DNA Vì vậy, tách chiết DNA người làm thí nghiệm cần phải tập trung cẩn thận với bước q trình làm thí nghiệm, tránh chủ quan dẫn đến sai sót 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn Tiểu đơn vị nhỏ 16S - rRNA hai tiểu phần quan trọng cấu thành nên ribosome vi khuẩn, chúng ngắn (chỉ 1.542 nucleotide) Với vai trò quan trọng việc dịch mã tổng hợp nên protein ribosome tính bảo thủ lồi sinh giới cao, hầu hết loài tồn đến hậu duệ loài tổ tiên từ 3,5 tỷ năm trước (Campbel cộng sự, 2008) Tuy nhiên, gen 16S - rRNA từ vi khuẩn khác có vài nucleotide khác nằm rải rác trình tự, dựa vào sai khác mà gen 16S-rRNA thường sử dụng để phân biệt loài Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn loài vi khuẩn C perfringens gây nên Chủng vi khuẩn C perfringens diện ở quan tiêu hóa, chủ yếu ruột non Trong nghiên cứu này, 16S-rRNA chọn làm đối tượng 35 để thiết kế mồi nhằm phát tác nhân gây bệnh C perfringens mẫu bệnh phẩm thu từ cá thể lợn chẩn đoán lâm sàng Cặp mồi 16S_F/R sử dụng nghiên cứu bắt cặp bổ sung với đoạn gen mã hóa cho 16S - rRNA C perfringens (Wang cộng sự, 1994) Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA có kích thước 279bp đặc hiệu lồi C perfringens Wang cộng (1994) công bố nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 55oC, từ tham khảo chúng tơi chọn dải nhiệt độ 50oC, 52oC, 55oC, 58oC, 60oC để thực phản ứng PCR gradient nhằm tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu Đối với DNA tách từ mẫu máu ruột lợn không xuất sản phẩm PCR ở tất nhiệt độ Mẫu phân hàm lượng DNA tổng số ít, khơng nhìn thấy ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số (Giếng 2, Hình 3.1) xuất sản phẩm PCR ở bốn nhiệt độ 52oC, 55oC, 58oC, 60oC, riêng ở nhiệt độ 50oC khơng xuất sản phẩm PCR (Hình 3.3) Dựa vào độ sáng băng sản phẩm PCR hình 3.3 cho thấy nhiệt độ gắn mồi thích hợp cặp mồi 16S_F/R 60oC Hình 3.3: Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 16S_F/R mẫu DNA tách từ phân Heo chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử Nhiệt độ gắn mồi tương ứng 500C (giếng 1), 520C (giếng 2), 550C (giếng 36 3), 580C (giếng 4), 600C (giếng 5), M: ADN Marker 100bp Hình 3.4: Kết PCR với cặp mồi 16S_F/R Trong đó: giếng –mẫu máu ; giếng – mẫu phân; giếng – mẫu ruột, giếng – đối chứng âm không bổ sung DNA khuôn mà thay nước, M: marker 100bp Trong thí nghiệm cặp mồi 16S_F/R sử dụng để nhân đoạn gen 16S-rRNA 03 mẫu bệnh phẩm lợn (mẫu máu, ruột phân) Kết hình 3.4 có mẫu phân cho kết dương tính với băng DNA đặc hiệu với kích thước gần 300 bp kích thước dự kiến (Giếng 2, Hình 3.4), cịn mẫu từ máu ruột khơng xuất băng sản phẩm PCR Với kết này, chúng tơi khẳng định mẫu phân lợn sử dụng nghiên cứu có nhiễm vi khuẩn C perfringens Hai mẫu cịn lại máu ruột, lấy cùng lợn lại không xuất băng DNA đặc hiệu lợn nhiễm khuẩn vi khuẩn chưa xâm nhiễm vào máu ruột Một điều quan trọng mẫu DNA tách từ phân gần không xuất điện di gel agarose 1% kết PCR lại khẳng định có DNA mẫu tách chiết với hàm lượng nhỏ Tuy nhiên, hàm lượng DNA đủ để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân thành công đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens 37 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở gà Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủng vi khuẩn C perfringens gây nên Do đó, cặp mồi 16S_F/R sử dụng để phát bệnh viêm ruột hoại tử gà Nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 16_F/R tối ưu ở thí nghiệm 60oC Phản ứng PCR thực 03 mẫu DNA tách từ máu 01 mẫu DNA tách từ ruột Kết phản ứng PCR thể hình 3.5 Hình 3.5: Kết nhân đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens từ mẫu bệnh phẩm gà Giếng 1: Đối chứng âm (không bổ sung DNA khuôn mà thay H2O); giếng 2: mẫu ruột 01; giếng 3-5: mẫu máu 01-03; M: DNA marker kb Trong tổng số 04 mẫu DNA tách chiết từ 01 mẫu ruột 03 mẫu máu gà có mẫu ruột cho kết dương tính với cặp mồi 16S_F/R Sản phẩm PCR từ mẫu ruột có kích thước 279bp dự kiến với băng DNA đặc hiệu (Giếng 2, Hình 3.5) Kích thước đoạn DNA khuếch đại sử dụng cặp mồi 16S_F/R ở nhiệt độ gắn mồi 60oC thu từ mẫu ruột tương đồng với kết Rong-Fu Wang cộng (1994) Điều khẳng định việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát bệnh 38 viêm ruột hoại tử ở gà khả thi loài C perfringens tác nhân gây bệnh mẫu gà nghiên cứu Tuy nhiên, mẫu DNA từ máu lại không xuất băng DNA dự kiến (Giếng 3, 4, 5; Hình 3.5) Mẫu DNA tách từ máu khơng xuất sản phẩm PCR đặc hiệu mẫu bệnh phẩm khơng chứa DNA lồi vi khuẩn C perfringens Nguyên nhân tác nhân gây bệnh chưa xâm nhiễm vào hệ thống máu Hoặc q trình sinh sản vơ tính C perfringens bị bất hoạt bởi thuốc kháng sinh sử dụng điều trị cho gà nên ở mẫu máu khơng cịn tồn tác nhân gây bệnh Bên cạnh đó, khả tồn C perfringens máu thấp, vi khuẩn C perfringens loại vi khuẩn yếm khí sống đường ruột Mẫu ruột cho lên băng DNA đặc hiệu với đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn C perfringens, nhiên băng DNA không sáng nét Do vi khuẩn bám lông nhu ruột, kí sinh nên thu thập mẫu tách DNA mẫu DNA có chứa DNA vi khuẩn, từ cho kết dương tính với cặp mồi 16S_F/R Băng lên khơng rõ số khuếch đại đoạn DNA đích vi khuẩn C perfringens tương đối thấp Trong nghiên cứu Josephine Wu cộng (2008) phát gen mã hóa độc tố 16S rRNA vi khuẩn Clostridium perfringens ở mẫu mô ngâm paraffin PCR với cặp mồi 16S_F/R DNA pha loãng 10 lần từ 5.105 đến copy chạy với chu trình nhiệt 35 chu kỳ phút ở 94°C, phút ở 53°C, phút ở 72°C cho kết dương tính với cặp mồi 16S_F/R phát C perfringens Qua cho thấy phản ứng PCR có độ nhạy cao dù số lượng đoạn DNA đích khuếch đại khơng cao vi khuẩn phát Tương tự Rong-Fu Wang cộng (1994) phát nhanh chóng gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens có loại thực phẩm (đùi gà) sau chế biến, cặp mồi 16S_F/R với phương pháp PCR Phản ứng chạy với chu trình nhiệt 95°C phút , 35 chu kỳ 95°C giây, 55 giây phút 39 ở 76°C Các sản phẩm PCR đoạn DNA 279 bp Tất chủng C perfringens thử nghiệm cho kết dương tính xét nghiệm PCR Qua cho thấy phản ứng PCR có độ nhạy cao xác Thực phẩm sau chế biến cịn tồn vi khuẩn, phản ứng PCR phát cách nhanh chóng kịp thời xử lí Như vậy, chúng tơi thành cơng việc chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử mẫu ruột ở gà kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 16S_F/R Chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử kỹ thuật PCR cho ta kết xác nhanh chóng, q trình chẩn đốn khoảng 04 Điều đặc biệt quan trọng việc lập kế hoạch phòng ngừa hiệu chương trình kiểm sốt bệnh viêm ruột hoại tử Từ kết thấy chẩn đốn bệnh phương pháp truyền thống có độ tin cậy thấp, nhiều tác nhân gây bệnh khác có biểu bệnh lý giống có biểu triệu chứng tương tự Vì vậy, để phịng ngừa kiểm sốt dịch bệnh hiệu cần phải kết hợp chẩn đoán lâm sàng chẩn đoán kỹ thuật PCR dịch bệnh có tính nguy hại cao Đối với bệnh vi khuẩn gây yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thành cơng phương pháp chẩn đốn PCR xác định loại mẫu bệnh phẩm chứa nhiều mầm bệnh để từ tách chiết DNA RNA vi khuẩn gây bệnh Đối với cặp mồi 16S_F/R cần tiếp tục nghiên cứu tối ưu phương pháp tách chiết DNA từ mẫu máu, cụ thể tách chiết DNA từ mẫu huyết tương khơng sử dụng mẫu máu tổng số Có thể tiếp tục thu thêm loại mẫu bệnh phẩm khác từ gà chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử để tìm loại mẫu bệnh phẩm cho kết chẩn đốn bệnh xác Để phát bệnh gia súc, gia cầm phương pháp PCR cần đảm bảo điều kiện sau: Tách chiết ADN từ mẫu bệnh phẩm tối ưu hóa phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu tác 40 nhân gây bệnh sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng Do đó, kit phát bệnh ở gia súc, gia cầm bao gồm: hóa chất tách chiết ADN, hóa chất PCR, hóa chất chạy điện di Trong nghiên cứu này, quy trình hồn chỉnh từ nhận mẫu bệnh phẩm tới trả kết tối ưu hóa với tổng thời gian 04 (Hình 3.6) Điều cho thấy hiệu việc sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán sớm bệnh ở gia súc, gia cầm Hình 3.6: Quy trình phát bệnh ở gia súc, gia cầm phương pháp PCR 41 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã tách chiết thành công DNA từ mẫu bệnh phẩm thu được, bao gồm: mẫu máu, mẫu ruột, mẫu phân từ lợn chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử; mẫu máu mẫu ruột từ gà chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử - Đã phát thành công bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn phương pháp PCR sử dụng cặp mồi 16S_F/R để phát loài vi khuẩn C perfringens Trong đó, bệnh viêm ruột hoại tử phát hiệu với mẫu bệnh phẩm phân, mẫu máu mẫu ruột khơng phát - Đã phát thành công bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủng vi khuẩn C perfringens gây kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 16S_F/R Tuy nhiên, kết phát bệnh thành công mẫu ruột, cịn mẫu máu khơng phát 4.2 Kiến nghị Do thời gian thực đề tài hạn chế, nên số kết chưa đạt mong muốn Do đó, đề tài có số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu sử dụng cặp mồi 16S_F/R phát loài vi khuẩn C perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử đối tượng gia súc, gia cầm khác - Tiếp tục sử dụng đoạn gen 16S - rRNA để nhận biết phát typ khác vi khuẩn C perfringens 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Khánh Hưng cs, 2012, “Xác định quy trình real-time RT-PCR với chất nhuộm Evagreen định lượng định chủng virut gây hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp heo”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 1, Tập 19, 30-35 Đỗ Tiến Duy cs, 2015, “Phát triển quy trình multiplex PCR phát mầm bệnh vi khuẩn virus gây rối loạn hơ hấp heo”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 7, Tập 22, 28-36 3.Nguyễn Đình Qt cs, 2015, “Chẩn đốn Actinobacillus Pleuropneumoniae (APP) xác định typ 1,2,5,8 kỹ thuật PCR”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nơng Lâm nghiệp, Số 3, 15-20 Nguyễn Thị Loan cs, 2016, “Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR để chẩn đoán bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis) ở gà đẻ trứng số tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Số 9, Tập 14, 1387-1394 Đỗ Tiến Duy cs, 2016, “Xác định diện Duck Circovirus Reimerella Anatipestifer từ ca bệnh bại huyết vịt kỹ thuật PCR”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 6, 14-21 Nguyễn Tiến Minh cs, “Ứng dụng kỹ thuật real-time PCR để chẩn đoán nhanh cúm A/H5N1 virus hợp bào đường hơ hấp”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, Số 1, Tập 5, 19-24 Võ Tấn Đại cs, 2016, “So sánh hiệu chẩn đoán bệnh Care chó phương pháp xét nghiệm nhanh kỹ thuật RT-PCR, phân tích đoạn gen hemagglutinin virus gây bệnh”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 8, Tập 23, 29-36 Tiếng Anh S Fernandez, et al, 2003, “A multiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of the seven Eimeria species that infect domestic fowl”, Parasitology, Vol.127, No.4, 317-325 Hakan Kalender, 2004, “Isolation of Clostridium perfringens from Chickens and Detection of the Alpha Toxin Gene by Polymerase Chain Reaction (PCR)”, Turk J Vet Anim Sci, Vol.29, No.3, 847-851 10 F Kawahara, et al, 2008, “Detection of five avian Eimeria species by species-specific real-time polymerase chain reaction”, 10.1637/8351050908-Reg.1 11 Josephine Wu, et al, 2008, “Detection and Toxin Typing of Clostridium perfringens in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Samples by PCR”, 10.1128/JCM.01324-08 12 Yan Zhao, et al, 2013, “Detection of Infectious Laryngotracheitis Virus by Real-Time PCR in Naturally and Experimentally Infected Chickens”, 10.1371/journal.pone.0067598 13 A Magouz, et al, 2018, “Detection of infectious laryngotracheitis virus (Gallid herpesvirus-1) from clinically infected chickens in Egypt by different diagnostic methods”, Iran J Vet Res, Vol.19, No.3, 194-201 14 R F Wang, et al, 1994, “A 16S rDNA-based PCR method for rapid and specific detection of Clostridium perfringens in food”, 10.1006/mcpr.1994.1018 15 H Hamidinejat, et al, 2010, “Characterization of Eimeria Species in Commercial Broilers by PCR Based on ITS1 Regions of rDNA”, Iranian J Parasitol, Vol.5, No.4, 48-54 16 Siun Chee Tan, at el, 2009, “DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present”, J Biomed Biotechnol, 10.1155/2009/574398 17 Sara Samadi Shams, et al, 2011, “Highly effective DNA Extraction Method from Fresh, Frozen, Dried Clotted Blood Samples”, Bioimpacts, Vol.1, No.3, 183-187 18 Narsin Mohammadi, et al, 2015, “A simple, Inexpensive and Safe Method for DNA Extraction of Frigid and Clotted Blood Samples”, Novelty in Biomedicine, Vol.3, No.3, 10.22037/nbm.v3i3.9507 19 Jorge C Pereira, et al, 2011, “An Efficient Method for Genomic DNA Extraction from Different Molluscs Species”, Int J Mol Sci, Vol.12, No.11, 8086-8095 20 Saeed El-Ashram, et al, 2016, “Nuleic Acid protocols: Extraction and Optimization”, Biotechnol Rep (Amst), Vol.12, 33-39 21 Lihua Xiao, et al, 2000, “Identification of Species Sources of Cryptosporidium Oocysts in Storm Waters with a Small-Subunit rRNABased Diagnostic and Genotying Tool”, Appl Environ Microbiol, Vol.66, No.12, 5492-5498 22 Shan-Chia Qu, et al, 2012, “Infectious Laryngotracheitis Virus in Chickens”, World J Virol, Vol.1, No.5, 142-149 23 Jennifer Humberd, et al, 2002, “Detection of Infectious Laryngotracheitis Virus in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue by Nested Polymerase Chain Reaction”, Avian Diseases, Vol.46, No.1, 54-74 24 Salameh Barhoom, et al, 2012, “Molecular Diagnosis of Explosive Outbreak of Infectious Laryngotracheitis(ILT) by Polymerase Chain Reaction in Palestine”, Iraqi Journal of Veterinary Medicine, Vol.36, No 2, 104-109 25 T J Bagust, et al, 2000, “Avian Infectious Laryngotracheitis”, Rev sci tech Off int Epiz, Vol.19, No.2, 483-492 26 Furkan Alaraji, et al, 2019, “Molecular detection and Phylogenetic tree of infectious laryngotracheitis virus in layers in Al-Diwaniyah province,Iraq”, Veterinary World, Vol.12 27.Vasudevan Gowthaman, et al, 2014 “Molecular detection and characterization of infectious laryngotracheitis virus (Gallid herpesvirus1) from clinical samples of commercial poultry flocks in India”, Virusdisease, Vol.25, No.3, 345-349 28 Vijay Durairaj, et al, 2007, “Necrotic Enteristis”, Center of Excellence for Poultry Science, University of Arkansas, Vol.9, No.2 29 Rosa Estela Quiroz-Castañeda, et al, 2015, “Control of Avian Coccidiosis: Future and Present Natural Alternatives”, Biomed Res Int, Vol.2015, Artile ID: 430610 30 J I Rood, et al, 1991, “Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens”, Microbiol Rev, Vol.55, No.4, 621-648 31 H To, et al, 2017, “Experimental induction of necrotic enteritis in chickens by a netB-positive Japanese isolate of Clostridium perfringens”, J Vet Med Sci, Vol.79, No.2, 350-358 32 Sourabh Sharma, et al, 2015, “Phathomorphological alterations associated with chicken coccidiosis in Jammu division of India”, J Parasit Dis, Vol.39, No.2, 147-151 33 V Vrba, et al, 2011, “The discovery of the two types of small subunit ribosomal RNA gene in Eimeria mitis contests the existence of E mivati as an independent species”, Vet Parasitol, Vol.183, No.1-2, 47-53 34 M W Shirley, et al, 1983, “Studies to determine the taxonomic status of Eimeria mitis, Tyzzer 1929 and E.mivati, Edgar and Seibold 1964”, Parasitology, Vol.87, Pt.2 35 D L J Lafontaine, et al, 2001, “The funtion and synthesis of ribosomes”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol.2, No.7, 514-520 36 Si Ming Man, et al, 2010, “The Internal Transcribed Spacer Region, a New Tool for Use Species Differentiationn and Delineation of Systematic Relationships within the Campylobacter Genus”, Appl Environ Microbiol, Vol.76, No.10, 3071-3081 37 Campbell, et al, 2008, Sinh học tái lần (Biology 4th Fourth Edition) Trang Web 38 https://www.nhandan.com.vn/kinhte/item/8045602-.html 39 Pountryhub: Necrotic Enteritis http://www.poultryhub.org/health/disease/ types-of-disease/necrotic-enteritis/ 40 Billy M Hargis, et al, “Overview of Necrotic Enteritis in Poultry”, MSD Veterinary Manual https://www.msdvetmanual.com/poultry/necroticenteritis/ overview-of-necrotic-enteritis-in-poultry 41 Farm Health Online – Animal Health and Welface Knowledge Hub, https://www.farmhealthonline.com/disease-management/poultrydiseases/coccidiosis-in-poultry/ 42 http://geneticeducation.co.in/different-types-of-dna-extraction-methods/ ... vi? ?m ruột hoại tử lợn Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh vi? ?m ruột hoại tử ở lợn Bệnh ở lợn Vi khuẩn Clostridium perfringens type A Vi? ?m ruột hoại tử (sinh ngoại độc tố) Clostridium. .. phát lồi vi khuẩn C perfringens Trong đó, bệnh vi? ?m ruột hoại tử phát hiệu với mẫu bệnh phẩm phân, cịn mẫu máu mẫu ruột không phát - Đã phát thành công bệnh vi? ?m ruột hoại tử ở gà chủng vi khuẩn. .. mẫu ruột, mẫu phân từ lợn chẩn đoán nhiễm bệnh vi? ?m ruột hoại tử; mẫu máu mẫu ruột từ gà chẩn đoán nhiễm bệnh vi? ?m ruột hoại tử - Đã phát thành công bệnh vi? ?m ruột hoại tử ở lợn phương pháp PCR