Xây dựng quy trình định lượng cytomegalovirus CMV trong máu nước tiểu bằng phương pháp real time PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - Đặng Hồng Cúc XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CYTOMEGALOVIRUS (CMV) TRONG MÁU, NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS CAO MINH NGA Thành phố Hồ Chí Minh - 2010 Lời cảm ơn Với lịng kính trọng chân thành, tơi xin cảm ơn: Q thầy, cô Khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp cho tơi kiến thức q báu suốt khóa học Cơ TS Trần Thanh Thủy, trưởng môn Vi sinh vật, khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HỒ CHÍ MINH ln tạo thuận lợi để tơi hồn thành tốt luận văn Cô PGS TS Cao Minh Nga, giảng viên mơn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, phó trưởng khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Dược tận tâm hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Cử nhân Hồ Thị Thanh Thủy- PGĐ công ty cổ phần công nghệ Việt Á, cử nhân Nguyễn Văn Hưng- trưởng phòng dịch vụ & KCS, tập thể cán bộ, công nhân viên phịng cơng ty tận tình giúp đỡ tơi thực nghiệm đề tài để tơi hồn thành kết luận văn ThS- BS Phùng Như Toàn- Trưởng phòng tham vấn tiền sản, Th.S Bs Lê Minh Hoài AnTrưởng khoa Xét nghiệm, Bs Lê Nguyễn Bảo Trân-trưởng P.A8- phịng xét nghiệm dịch vụ, KTV Tơn Nữ Thu Trang tập thể nhân viên phòng xét nghiệm bệnh viện Từ Dũ tạo thuận lợi cung cấp cho số liệu mẫu bệnh phẩm (nước tiểu, máu) nhiễm CMV Dược sĩ Nguyễn Thanh Tòng- Trưởng khoa Xét nghiệm Trung tâm y khoa Medic, BS Nguyễn Bảo Tồn-phịng Sinh học phân tử KTV Đặng Đình Triển, phịng xét nghiệm kháng thể trung tâm y khoa Medic cung cấp cho số liệu mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV, HSV Tập thể bạn lớp cao học K18 – khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HCM động viên giúp đỡ tơi suốt khóa học làm luận văn Xin chân thành cảm ơn Đặng Hồng Cúc DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT - BLAST: Basic local alignment tool - CMV: Cytomegalovirus - COBAS: COBAS AMPLICOR™ CMV MONITOR - CSF: Cerebrospinal fluid: dịch não tủy - Da: Dalton, đơn vị đo khối lượng phân tử protein - DNA: Deoxyribonucleic acid - dNTP: Deoxynucleoside triphosphate - dNTP: deoxynucleotie triphosphate - dUTP: deoxy Uracil triphosphate - EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid - gB: glycoproteinB - GE: genome-equivalent - IDT: Intergrated DNA Technologies - IE: immediate early: sớm tức - LC-PCR: LightCycler® polymerase chain reaction - PBL: Peripheral blood leucocytes: bạch cầu máu ngoại biên - PMNLs: polymorphonuclear leucocytes: bạch cầu đa nhân - Pol: polymerase - PTLD: post-transplant lymphoproliferative disorder: rối loạn tăng sinh tế bào lympho sau ghép - qPCR: quantitative polymerase chain reaction: PCR định lượng - UL: unique long - UNG: Uracyl – N – glycosylase - WB: whole blood: máu toàn phần MỞ ĐẦU Nhiễm Cytomegalovirus (CMV) loại nhiễm virus thường gặp cộng đồng, chiếm tỉ lệ từ 60% đến 99% người lớn toàn giới [51], gây triệu chứng lâm sàng, chẩn đốn nhiễm CMV quan tâm CMV tác nhân sinh bệnh nhiễm trùng hội nguy bệnh CMV tùy thuộc đáp ứng miễn dịch thể Nhiễm CMV tái kích hoạt bệnh nhân có hệ thống miễn dịch suy yếu, tác nhân gây bệnh nặng, chí gây tử vong cho người sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, người cấy ghép nội tạng, đặc biệt người nhiễm virus HIV CMV nguyên nhân gây nhiễm trùng bẩm sinh thường gặp thai phụnhiễm trùng ToRCH (Toxoplasmase, Rubella, CMV, Herpes simplex virus), gây nguy hại cho thai nhi: 0,5%-2,5% trẻ sơ sinh mắc bệnh CMV bị vàng da, lách to, giảm tiểu cầu, suy thai, nhỏ đầu, viêm võng mạc, CMV để lại di chứng khốc liệt lúc sinh[11], [12], [13], [24], [72] Ngoài ra, nghiên cứu Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC) xuất số ngày 15 tháng năm 2009, cho thấy lần CMV, nguyên nhân gây huyết áp cao, kết hợp với yếu tố nguy khác bệnh tim, CMV gây xơ vữa, xơ cứng động mạch [51] Do đó, chẩn đốn sớm nhiễm CMV để đánh giá xác tình trạng bệnh nhân cần thiết Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu chẩn đốn nhiễm CMV tìm kháng thể IgG-CMV, IgM-CMV, ni cấy virus, tìm tế bào nội mô cho kết khả quan Đặc biệt, với phát triển sinh học phân tử, người ta sử dụng PCR định tính CMV phương pháp khó phân biệt nhiễm tiềm tàng (nhiễm CMV không biểu triệu chứng) hay nhiễm họat động (nhiễm CMV biểu triệu chứng) Jiska Jebbink, cộng [42] số lượng CMV khoảng 10.000 genomes virus /ml mẫu máu báo trước nhiễm CMV có nguy cao phát triển thành bệnh CMV Ngồi cịn số cơng trình khác mối tương quan số lượng virus mẫu thử bệnh CMV (bảng 1) Bảng 1: Minh họa kết định lượng CMV tương quan bệnh CMV Tài liệu tham khảo Jayne C.Fos [41] năm 1995 PP định lượng Mẫu thử Số lượng gen virus/ml mẫu thử PCR (gB) Nước tiểu 106,5 Biểu triệu chứng x Không biểu triệu chứng Jayne C.Fos [41] năm1995 PCR (gB) Nước tiểu 105,2 Lazzarotto[47] năm 2000 qcPCR (IE1) Dịch ối 105 x Gouarin [45] năm 2002 Real-Time qPCR (UL83) Dịch ối 2,8x105 x Mẫu máu 3,5 log10 Mẫu máu 4,2log10 x Marianne LeruezVille [49] năm 2003 Marianne LeruezVille [49] năm 2003 Real-Time qPCR (UL123) Real-Time qPCR (UL123) x x Boppana [23] năm 2005 Real-Time qPCR (gB) Mẫu máu 1x104 x Ravit Arav-Boger [66] năm 2007 Real-Time qPCR (US17) Dịch ối 2,8x105 x Ravit AravBoger [66] năm 2007 Real-Time qPCR (US17) Dịch ối 8x103 x Vì vậy, việc định lượng CMV giúp bác sĩ tiên lượng có liệu pháp chữa trị sớm Phát kháng nguyên pp65 máu giúp cho việc định lượng CMV hữu hiệu, nhanh, nhiều nhược điểm Trong thời gian gần đây, từ 1993 đến phương pháp Real-Time PCR sử dụng nhiều nước [18], [26], [27] ,[28], [32], [33], [42], [46], [53], [56], [59], [70] định lượng CMV nhanh, xác , độ nhạy độ đặc hiệu cao giúp cho tiên lượng bệnh nhân nhiễm CMV có nguy phát triển thành bệnh CMV để kịp thời chữa trị, đồng thời giúp cho việc theo dõi kiểm tra hiệu lực liệu pháp chữa trị Tại Việt Nam nay, miền Nam Việt Nam, vài nơi công ty cổ phần công nghệ Việt Á, công ty khoa Thương, công ty Nam Khoa, bệnh viện Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh, bệnh viện Chợ Rẫy có kit thử định lượng CMV từ máu bệnh nhân Real-Time PCR, chưa thấy cơng trình xây dựng kỹ thuật định lượng CMV từ nước tiểu phương pháp Real-Time PCR Xuất phát từ thực tiễn trên, tiến hành đề tài : “Xây dựng quy trình định lượng CMV máu nước tiểu phương pháp Real-Time PCR” Giới hạn đề tài: Hiện nay, có bốn kiểu phản ứng sử dụng kỹ thuật Real-Time PCR với độ nhạy tương đương Molecular beacon, chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi, probe lai, probe thủy giải (TaqMan probe) Đề tài chọn kiểu phản ứng dùng TaqMan probe, vừa đơn giản, vừa có tính đặc hiệu cao Nhiệm vụ đề tài : - Thiết kế primers, TaqMan probe đặc hiệu định lượng CMV - Khảo sát điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real-Time PCR xây dựng quy trình định lượng CMV máu nước tiểu - Ứng dụng quy trình chẩn đốn số bệnh phẩm Đối tượng phạm vi nghiên cứu: - Những mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV phòng xét nghiệm BV Từ Dũ, trung tâm y khoa Medic, công ty cổ phần công nghệ Việt Á Đề tài thực phịng kỹ thuật mơn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh cơng ty cổ phần cơng nghệ Việt Á CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương CMV CMV gọi virus đại bào, tế bào bị nhiễm CMV có kích thước khổng lồ, đặc biệt bên nhân bào tương lại xuất nhiều thể vùi có hình mắt cú đặc trưng (hình 1.1) Hình 1.1: Tế bào bị nhiễm CMV (bên trái), thể vùi “mắt cú” (bên phải) “Nguồn: www,pathguy,com/lectures/infect,htm” 1.1.1 Lược sử nghiên cứu CMV [14], [50], [51], [72] - Từ năm 1881, Ribbert người mơ tả tế bào kích thước khổng lồ mang thể vùi diện thận em bé tử vong giang mai Năm 1907, phòng thí nghiệm Ribbert tiếp tục phát thể vùi 30 tuyến mang tai đứa trẻ từ tháng đến hai tuổi Nhưng ông sai lầm cho nguyên nhân động vật nguyên sinh (có tên Entamoeba mortinatalium) Vào năm 1920, Goodpasture Talbert người cho tề bào bị phình to hậu nhiễm virus, Goodpasture đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalia” để phồng to tế bào bị nhiễm Vào 1956, Smith Rowe phân lập CMV từ tuyến hàm tuyến amidan em bé, CMV gọi là: “virus tuyến nước bọt”, “virus gây bệnh thể vùi tuyến nước bọt” - Đến năm 1960, Weller cộng đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalovirus” thuật ngữ “bệnh virus tuyến nước bọt-CID (Cytomegalic inclusion disease)” khó sử dụng sai lầm, tuyến nước bọt nhiều vị trí bị nhiễm, Klemola Kaarrianinen mô tả bệnh tăng bạch cầu đơn nhân CMV(1965), năm người ta phát CMV bệnh nhân ghép thận Trong hai thập niên 1970 1980, sinh học phân tử CMV tiếp tục nhà khoa học nghiên cứu khám phá 1.1.2 Phân loại CMV người  CMV người Human Cytomegalovirus (HCMV) thành viên giống Herpesvirus thuộc họ Herpesviridae, chi Betaherpesvirinae Nhân sợi đơi DNA Có lồi virus Herpes người chia làm phân họ (bảng 1.1) Bảng 1.1: loài virus Herpes gây bệnh người Phân họ Alpha- TT VIRUS Bệnh liên quan HSV-1 Mụn rộp môi HSV-2 herpesvirinae Mụn rộp phận sinh dục, gây ung thư cổ tử cung VARICELLA-ZOSTER VIRUS (VZV) Bệnh thủy đậu (HHV3) Bệnh Betaherpesvirinae EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV_HHV4) tăng tế bào đơn nhân, Burkitt lymphoma, ung thư dạng carcinoma vùng mũi hầu, bệnh tăng sinh tế bào lympho sau ghép (PLTD) Phân họ TT VIRUS CMV (HHV-5) Betaherpesvirinae Bệnh liên quan Bệnh CMV Bệnh ban đào(roseola), bệnh não ghép HHV-6 (Transplant-encephalopathy), bệnh xơ cứng rải rác Gammaherpesvirinae HHV-7 HHV-8 Bệnh ban đào (roseola) Kaposi sarcoma, lymphoma đáy xoang thể, bệnh sarcoid 1.2 Tình hình nhiễm CMV [3], [6], [11], [12], [13], [14], [16], [20], [23], [24], [29],[31], [50], [51], [52], [60], [71], [72] CMV virus có mặt khắp nơi thường gây nhiễm cho nhiều loài sinh vật khác nhau, tác nhân sinh bệnh thường gặp người CMV gây bệnh cho người ghi nhận từ thời cổ đại Người ta tìm thấy dấu vết nhiễm CMV lạc Da Đỏ cổ đại Nam Mỹ (ngày thuộc lãnh thổ Brazin) Tỷ lệ nhiễm CMV tùy thuộc vào vị trí địa lý, tình trạng kinh tế xã hội, yếu tố nuôi dưỡng giáo dục, tỉ lệ nhiễm CMV trung bình giới khoảng 40% Ở Mỹ, từ 50% đến 80% số người lớn 40 tuổi nhiễm CMV, phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ tỉ lệ nhiễm CMV 60-65%, 0,7-4% phụ nữ mang thai nhiễm CMV nguyên phát, nhiễm sang thai nhi 30- 40%, 40% nhiễm bẩm sinh có 10% xuất triệu chứng bệnh CMV, 5-15% số 90% lại sau vài năm có biểu di chứng muộn CMV khiếm khuyết nghe, nhìn chậm phát triển tinh thần CMV gây nhiễm lứa tuổi, nhiên lứa tuổi thiếu niên là độ tuổi thường bị nhiễm nguyên phát, tỉ lệ nhiễm CMV tăng dần theo lứa tuổi Theo thống kê Hoa kỳ với tuổi từ 6-11 tuổi 36,3%, lớn tuổi tỉ lệ nhiễm 58,9%, từ 80 tuổi trở lên tỉ lệ nhiễm 90,8% Nhiễm CMV khác chủng tộc: 51,2% Tây Ban Nha người da trắng, 75,8% Tây Ban Nha người da đen, 81,7% người Mỹ gốc Mexico Mỗi năm Hoa Kỳ khoảng 340.000 người gốc Tây Ban Nha da trắng, 130.000 người gốc Tây Ban Nha da đen, 50.000 phụ nữ Mỹ gốc Mexico bị nhiễm CMV nguyên phát Đối với bệnh nhân AIDS, 40% bị nhiễm CMV, người cấy ghép nội tạng, khơng có can thiệp kháng virus biểu triệu chứng nhiễm CMV: 39-41% người ghép tim, phổi; 9-35% người ghép tim; 22-29% người ghép gan tụy; 8-32% người ghép thận; 50% người ghép thận tụy; 22% ghép đoạn ruột Ở miền Nam Việt Nam từ 16 ca ghép thận Chợ Rẫy [3] ghi nhận số liệu bảng 1.2 Bảng 1.2: Tần suất nhiễm CMV 16 ca ghép thận Huyết dương tính Người cho thận Người nhận thận IgG-CMV 12/16 13/16 IgM-CMV 3/16 2/16 Thống kê nhiễm CMV từ năm 2008 đến tháng 04/2010: + Ở bệnh viện Từ Dũ tỉ lệ mẫu xét nghiệm có kháng thể IgG-CMV 94,26% (6013/6379), kháng thể IgM-CMV 3,76% (240/6379) + Ở trung tâm y khoa Medic 88,59% (4896/5526) người xét nghiêm có kháng thể IgGCMV, kháng thể IgM-CMV 9,89% (547/5526) Xét nghiệm DNA-CMV từ 2009 đến tháng 04/2010 kết dương tính 30,61% ca xét nghiệm (30/98) Giá xét nghiệm mẫu máu định lượng CMV kit Roche 750.000đ Việt Nam 1.3 Cấu tạo CMV [6], [14], [51] * CMV (hoặc HCMV) có đặc điểm cấu trúc đặc trưng họ virus Herpes Hạt virion HCMV từ (hình 1.2) gồm: Một gen (genome) phần lõi (core) virus, capsid (khoảng 162 capsomers), chất (tegument) chứa enzymes, màng bọc ngồi (envelope hay membrane) glycoprotein Hình 1.2: Một virion HCMV (Human Cytomegalovirus) “Nguồn :www,abbottdiagnostics,com/science, www,who,int/publications ” 1.3.1 Bộ gen CMV (hình 1.3, 1.4) phân tử DNA sợi đôi mạch thẳng, dài 64 nm, chia làm hai cấu phần “duy nhất” (unique), cấu phần dài UL (unique long), cấu phần ngắn US (unique short) Ở hai đầu vùng trình tự vùng trình tự lặp lại đầu cuối TR (terminalrepeat sequence) vùng trình tự đảo ngược IR (inverted repeat sequence) Vùng UL gen virus vùng mang gen mã hóa cho protein quan trọng cần thiết cho xâm nhập chép virus UL55 mã hóa cho glycoprtein B màng bọc ngồi, UL123 mã hóa cho protein IE, gen CMV cịn có vùng xác định tương đồng với số vùng DNA người [6] Đây gen có kích thước lớn họ virus Herpesviridae, xấp xỉ 230240Kb (hình 1.3) Có khoảng 31% - 75% Guanin+ Cytocine Với gen > 240.000bp, có tiềm mã hố protein cho 200 khung đọc mở (opening reading frames) có khả tổng hợp khoảng 100 protein virus Hiện nay, xác định vài protein từ gen virus Có đoạn gen mã hoá quan trọng cần cho chép virus, có đoạn gen khơng thiết yếu, lại sản sinh yếu tố lây truyền từ tế bào sang tế bào khác Hình 1.3: Minh họa gen số loài Herpesvirus “Nguồn:http://cmbi,bjmu,edu,cn/www-learn/micro-ac uk/335/HHV5,html” :: ||| : 3' CCTATTCGCCCTCTACACCTA KQ HETERO DIMER primer ngược với Taqman probe Delta G -6.6 kcal/mole Base Pairs 5' GTTCATGAGCCTTTCGAGGA : ||||| 3' AACCCGATTGATACGTCTCGTACATACTCT 3.3 KQ kẹp tóc Taqman probe ΔG -1.44 kcal.mole-1 TM 43.5 oC ΔH -24 kcal.mole-1 ΔS -75.8 cal.K-1mole-1 KQ SELF DIMER TaqMan Probe Delta G -7.05 kcal/mole Base Pairs 5' TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCCCAA : : :: |||| :: : : 3' AACCCGATTGATACGTCTCGTACATACTCT KQ HETERO DIMER TaqMan probe với primer xuôi Delta G -4.74 kcal/mole Base Pairs 5' TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCCCAA : ||| : 3' CCTATTCGCCCTCTACACCTA KQ HETERO DIMER Taqman probe với primer ngược 5' Delta G -6.6 kcal/mole Base Pairs TCTCATACATGCTCTGCATAGTTAGCCCAA ||||| : 3' AGGAGCTTTCCGAGTACTTG Kết Annhyb số loài khác với hệ primer Taqman probe thiết kế 4.1 Kết khảo sát khả bắt cặp primer xi với lồi khác 4.2 Kết khảo sát khả bắt cặp TaqMan probe với loài khác 4.3 Kết khảo sát khả bắt cặp primer ngược với loài khác 5.Kết chạy phản ứng kiểm tra độ đặc hiệu loài PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 11-May-10 04:38 PM Data generated on: 11-May-10 at 1:11 PM Optical data file name: DH 11-05-10.opd Plate Setup file used: DH 11-05-10.pts Protocol file used: CMV.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 57.0ºC Data collection and real-time analysis enabled Step 3: 72.0ºC for 13:30 for 00:15 for 01:00 for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct Setpoint A03 A04 E04 E05 E06 E07 E09 E10 E12 F09 F11 F12 G08 G09 EBV(-) EBV(+) MTB(+) HBV(+) HCV(+) HBV(-) MTB(-) HCV(-) HPV(+) HPV(-) CMV(+) CMV(-) HSV(+) HSV(-) N/A 29.3 28.7 21.0 27.9 N/A N/A N/A 25.8 N/A 31.8 N/A 25.2 N/A 65.0 65.0 60.1 60.1 60.1 60.1 60.1 60.1 60.1 58.7 58.7 58.7 57.7 57.7 6.Kết chạy liên phản ứng ngày 1: PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: Data generated on: Optical data file name: Plate Setup file used: Protocol file used: Sample volume: Hot Start? Well factor collection: Comments 03-Jun-10 10:55 AM 01-Jun-10 at 01:53 PM 01-06-10.opd 01-06-10.pts CMV.tmo 25.00 ul No Experimental Plate Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 57.0ºC Data collection and real-time analysis enabled Step 3: 72.0ºC for 13:30 for 00:15 for 01:00 for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Standard Curve Graph for FAM-490 Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number Type E02 E03 E04 E09 Standard Standard Standard mẫu1 Identifier Rep Ct 36.13 28.71 22.65 29.52 Log SQ 2.000 4.000 6.000 3.893 SQ SQ Mean SQ SD Ct Mean 1.00E+02 1.00E+04 1.00E+06 7.82E+03 1.00E+02 1.00E+04 1.00E+06 7.82E+03 N/A N/A N/A N/A 36.13 28.71 22.65 29.52 E10 mẫu 26.28 4.856 7.18E+04 7.18E+04 Kết chạy liên phản ứng ngày 2: PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: Data generated on: Optical data file name: Plate Setup file used: Protocol file used: Sample volume: Hot Start? Well factor collection: Comments Protocol 03-Jun-10 01:01 PM 02-Jun-10 at 04:53 PM 02-06-10.lien2.opd 02-06-10.lien2.pts CMV.tmo 25.00 ul No Experimental Plate Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 57.0ºC Data collection and real-time analysis enabled Step 3: 72.0ºC for 13:30 for 00:15 for 01:00 for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 N/A 26.28 Standard Curve Graph for FAM-490 Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number Type Identifier E02 E03 E04 F02 F03 Rep Standard Standard Standard Mẫu Mẫu 1 Ct 35.44 27.80 21.64 25.54 28.48 Log SQ 2.000 4.000 6.000 4.797 3.945 SQ SQ Mean SQ SD Ct Mean Ct SD 1.00E+02 1.00E+04 1.00E+06 6.97E+04 8.00E+03 1.00E+02 1.00E+04 1.00E+06 6.27E+04 8.80E+03 N/A N/A N/A N/A N/A 35.44 27.80 21.64 25.54 28.48 N/A N/A N/A N/A N/A Kết chạy liên phản ứng ngày 3: PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: Data generated on: Optical data file name: Plate Setup file used: Protocol file used: Sample volume: Hot Start? Well factor collection: Comments Protocol 03-Jun-10 04:44 PM 03-Jun-10 at 02:00 PM Lien 3.opd Lien 3.pts CMV.tmo 25.00 ul No Experimental Plate Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 57.0ºC Data collection and real-time analysis enabled Step 3: 72.0ºC for 13:30 for 00:15 for 01:00 for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Standard Curve Graph for FAM-490 Standard Curve Spreadsheet Data for FAM-490 Units: copy number Type Identifier E02 E03 E04 G02 G06 Standard Standard Standard mẫu2 mẫu Rep Ct 33.99 27.08 20.75 22.97 26.29 Log SQ 2.000 4.000 6.000 5.299 4.297 SQ SQ Mean SQ SD Ct Mean Ct SD 1.00E+02 1.00E+04 1.00E+06 9.01E+04 9.18E+03 1.00E+02 1.00E+04 1.00E+06 1.99E+05 1.98E+04 N/A N/A N/A N/A N/A 33.99 27.08 20.75 22.97 26.29 N/A N/A N/A N/A N/A Kết chạy phản ứng đại diện mẫu 7792 3544 PCR Standard Curve Report with PCR Amp Cycle Graph PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: 21-Jun-10 09:11 AM Data generated on: 25-Apr-10 at 11:04 AM Optical data file name: CMV- 24-04-2010.opd Plate Setup file used: CMV 24-04-2010.pts Protocol file used: CUC.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: Cycle 2: ( 40X) Step 1: Step 2: Data collection enabled Step 3: 95.0ºC for 13:30 95.0ºC 57.0ºC for 00:15 for 01:00 72.0ºC for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 standard 7792 Standard Curve Graph for FAM-490 PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: Data generated on: 22-Jun-10 01:13 AM 08-Feb-10 at 07:20 PM Optical data file name: CMV 08-02-10.opd Plate Setup file used: CMV 08-02-10.pts Protocol file used: cmv 57.tmo Sample volume: 25.00 ul Hot Start? No Well factor collection: Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 60.0ºC Data collection and real-time analysis enabled Step 3: 72.0ºC for 15:00 for 00:15 for 01:00 for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 3544 10 Kết xử lý thống kê hệ số biến thiên nội phản ứng: 11 Kết xử lý thống kê hệ số biến thiên liên phản ứng: HSBTLPƯ 102 104 102 Tiêu chuẩn (HSBTNPƯ) 106 104 Mẫu 106 Mẫu Mẫu Mẫu Giá trị trung bình (M) 32,55 27,76 19,58 26,52 35,06 Sai số chuẩn giá trị trung bình 0,75 0,17 0,34 0,39 0,30 Giá trị trung vị 32,56 27,6 19,48 26,75 34,97 Độ lệch chuẩn (S) 1,30 0,29 0,58 0,67 0,53 Khoảng quan sát 2,6 0,52 1,15 1,28 1,04 Giá trị nhỏ 31,25 27,58 19,05 25,76 34,59 Giá trị lớn 33,85 28,1 20,2 27,04 35,63 Tổng 97,66 83,28 58,73 79,55 105,19 Số lần lặp lại 3 3 Giới hạn khoảng tin cậy (95,0%) 3,23 0,73 1,44 1,67 1,31 HSBT (CV)=S/M x100 3,99 1,06 2,97 2,53 1,50 P (ĐỘ CHÍNH XÁC)=100-CV 96,01 98,94 97,03 97,47 98,50 Giá trị trung bình (M) 35,18 27,86 21,68 28,097 24,93 Sai số chuẩn giá trị trung bình 0,63 0,47 0,54 0,95 1,002 Giá trị trung vị 35,44 27,8 21,64 28,48 25,54 Độ lệch chuẩn (S) 1,09 0,81 0,95 1,64 1,73 Khoảng quan sát 2,14 1,63 1,9 3,23 3,31 Giá trị nhỏ 33,99 27,08 20,75 26,29 22,97 Giá trị lớn 36,13 28,71 22,65 29,52 26,28 Tổng 105,56 83,59 65,04 84,29 74,79 Số lần lặp lại 3 3 2,71 2,02 2,36 4,09 4,31 HSBT (CV)=S/M x100 3,10 2,93 4,38 5,86 6,96 P (ĐỘ CHÍNH XÁC)=100-CV 96,89 97,06 95,61 94,13 93,03 Giới hạn khoảng tin cậy (95,0%) 12 Các thiết bị sử dụng Tủ tách chiết DNA Máy chạy phản ứng Real-Time PCR Máy Bio-Rad, chạy phản ứng Real-Time PCR Máy ly tâm Máy ủ khô Máy vorte x 13 Cấu trúc primers probe đặc hiệu loài virus khảo sát độ đặc hiệu: EBV - forward : 5’-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3’ - reverse : 5’-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3’ - probe: 5’-FAM-ACAAATTGCCAGTAGCCCACCAGGAGA-TAMRA-3’ MTB 16s RNA - S97(F): 5’-GTGGCGAACGGGTGAGTAAC-3’ - TBR: 5’- CCTACCAAGGCGACGACG-3’ - TB probe : 5’-FAM-CTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTGGTCCT-TAMRA3’ HBV - HBVTAQ1 (F): 5’-GTG TCT GCG GCGTTT TAT CA-3’ - HBVTAQ2(R): 5’-GAC AAA CGG GCA ACA TAC CTT-3’ - HBVTAQPR: 5’ FAM-CCT CT(T/G) CAT CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTAMRA-3’ HPV - fw: 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’ - re: 5’- CTTTTTATTGACATTTAGTATAAG-3’ - Probe: 5’- Fam- GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA-Tamra-3’ HSV - F: 5’-GAG TGC GAA AAG ACG TTC-3’ - R: 5’-GTC TAC GAG GAC GGC C-3’ - P: 5’-FAM-TGC TCA TCA AGG GCG TGG ATC TGG-TAMRA-3’ HCV - R: 5’-CGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCG-3’ - F: 5’-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’ - Probe: 5’-FAM-GCGAGCCACCGGAATTGCCAGGACGACCGCTCGC-Tamra-3’ QUY TRÌNH TÁCH CHI?T DNA/RNA M? u Thêm o 200 µ l d ung d? ch Hút 200 µ l µ lm? u (M?u b ?n hlao h út1 00 µ l) Vortex Ð? yên 10 p hút Vào e ppe ndorf ch? a 90 µ l du ng d?ch Tr? n d? u Ð? d ung d?ch n ?i Thu c? n màu xan h Ly tâ m1 3.000 vòn g/phú ,t 10 p hút Làm ? l nh 10 p hút Hút6 00 µ l du ng d?ch n? ivào eppe ndorf có s?n 00 µl du ng d?ch Ly tâm 13 00 v òng/ph út, 10 phút Thêm o 900 µ l d ung d?ch Ly tâm 13 00 v òng /p hút, p hút Ð? d ung d ? ch n ?i thu c? n màu xan h Th? mv gi? y cho S?y khô ? 60 o C Cho vào 50 µ l d ung d?ch TE 1X M?u lao c ho vào 00 µ l d ung d ? ch TE X M? u RNA cho v 50 µ l du ng d?ch DEP C B?o q u? n l? nh -20 oC ... thử định lượng CMV từ máu bệnh nhân Real- Time PCR, chưa thấy cơng trình xây dựng kỹ thuật định lượng CMV từ nước tiểu phương pháp Real- Time PCR Xuất phát từ thực tiễn trên, tiến hành đề tài : ? ?Xây. .. TaqMan probe đặc hiệu định lượng CMV - Khảo sát điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real- Time PCR xây dựng quy trình định lượng CMV máu nước tiểu - Ứng dụng quy trình chẩn đốn số bệnh... tiến hành đề tài : ? ?Xây dựng quy trình định lượng CMV máu nước tiểu phương pháp Real- Time PCR? ?? Giới hạn đề tài: Hiện nay, có bốn kiểu phản ứng sử dụng kỹ thuật Real- Time PCR với độ nhạy tương đương