Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 8 ppsx

78 78 Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đối tượng là các mẫu được sàng lọc dương tính với promoter 35S ở thí nghiệm 2. Các mẫu này được lặp lại 2 lần trong cùng một lần thí nghiệm. Các kết quả được phân tích trên đồ thị DNA quantification như sau. Hình 4.13: Đồ thị định lƣợng p35S của các mẫu thí nghiệm Ghi chú: Hình 4.14: Đƣờng chuẩn phản ứng định lƣợng p35S Ghi chú: B1 B2 B4 B6 B7 B10 B11 Mẫu chuẩn Mẫu chưa biết 79 79 Hình 4.15: Đồ thị định lƣợng gen tham chiếu của các mẫu thí nghiệm Ghi chú: Hình 4.16: Đƣờng chuẩn phản ứng định lƣợng gen tham chiếu Ghi chú: Bảng 4.14: Các thông số kết quả của thí nghiệm Thí nghiệm định lƣợng Thông số p35S Gen tham chiếu Hệ số tƣơng quan (Correlation Coefficient) Hiệu quả PCR (PCR Efficiency) (%) 0,998 110,7 0,987 116,8 Bảng 4.15: Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm B1 B2 B4 B6 B7 B10 B11 Mẫu chuẩn Mẫu chưa biết 80 80 STT Tên và đặc điểm của mẫu Kí hiệu Chu kỳ phát hiện Promoter 35S Gen tham chiếu 1 2 3 4 5 6 7 Bắp giống 1 Bắp giống 2 Bắp giống 4 Bắp trái ăn tươi Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc Thức ăn gia súc 2 Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1 B1 B2 B4 B6 B7 B10 B11 27.38 27.61 28.93 29.73 26.35 26.51 34.16 33.46 27.71 27.8 26.05 27.33 24.99 25.81 27.69 27.14 25.6 24.4 23.02 24.23 23.91 23.93 28.32 28.31 24.92 24.92 30.59 27.44 Từ các kết quả trên đây chúng tôi rút ra một số nhận xét sau : - Nhìn trên đồ thị DNA Quantification ta thấy các mẫu đều dương tính rõ rệt, các đường cong đồ thị đều vượt lên trên khá rõ so với chu kỳ ngưỡng. - Hiệu quả của phản ứng : Phản ứng đạt hiệu quả cao với đường chuẩn được xây dựng chính xác thể hiện qua các thông số như : hệ số tương quan của đường chuẩn đạt 0,998 (định lượng p35S) và 0,987 (định lượng gen tham chiếu) cao hơn yêu cầu của nhà sản xuất (0,98); hiệu quả PCR cũng đạt 110,7 % (định lượng p35S) và 116,8 % (định lượng gen tham chiếu). Bảng 4.16: Độ lệch tiêu chuẩn chu kỳ phát hiện của mẫu (C T Standard Deviation) Mẫu Độ lệch tiêu chuẩn của chu kỳ phát hiện (C T Standard Deviation) p35S Gen tham chiếu 81 81 B1 B2 B4 B6 B7 B10 B11 0.16 0.56 0.11 0.50 0.06 0.91 0.58 0.39 0.85 0.86 0.01 0.01 0.00 2.23 - Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm trong 2 lần lặp lại là xấp xỉ nhau. Điều này được thể hiện ở Bảng 4.15 và 4.16 , độ lệch chuẩn của chu kỳ phát hiện là khá thấp, đặc biệt là một số mẫu như B6, B7, B10. - Tuy nhiên, nhìn trên đường chuẩn ở Hình 4.14 và 4.16, ta thấy một số mẫu có thể có kết quả định lượng không chính xác do chúng vượt quá giá trị thấp nhất và cao nhất của các mẫu chuẩn. Điều này có thể do sự ngoại nhiễm trong thao tác hay chất lượng DNA ly trích gây ra. Kết quả định lượng và tỷ lệ phần trăm chuyển gen trong các mẫu theo công thức bên dưới: %GMO = (Số lƣợng trình tự gen chuyển nạp/Số lƣợng trình tự gen đối chiếu) x 100 Bảng 4.17: Kết quả định lƣợng các mẫu thí nghiệm (2 lần lặp lại) Kí hiệu mẫu Kết quả định lƣợng (copy) Tỷ lệ % chuyển gen (%) Giá trị trung bình (2 lần lặp lại) p35S Gen tham chiếu 82 82 B1 B2 B4 B6 B7 B10 B11 5940 945 7880 33,3 4900 7240 17700 96100 4460 12900 9270 43500 4270 331 6.18 21.19 61.09 0.36 11.26 169.56 5347.43 Một số nhận xét được rút ra như sau: Các mẫu đều có sự hiện diện của p35S trong mẫu. Điều này phù hợp với kết quả sàng lọc ỏ thí nghiệm trước. Một số mẫu có sự hiện diện p35S trong mẫu khá thấp (B6: 33,3 copy), một số mẫu hiện diện p35S rất lớn (B11: 17700 copy, B4: 7880 copy). Điều này có lẽ do sự khác biệt về nguồn gốc các sản phẩm trong mẫu Độ lệch chuẩn chu kỳ phát hiện của các mẫu không lớn. Điều này chứng tỏ, kết quả định lượng không có sự biến động lớn ở các lần lặp lại. Kết quả so sánh tỷ lệ phần trăm chuyển gen 3 mẫu B1, B2, B4 (đều là hạt giống bắp) cho thấy sự hiện diện rất chênh lệch số lượng p35S trong các giống bắp khác nhau. Tuy nhiên, dựa trên cơ sở lý thuyết, chúng tôi cho rằng chỉ có mẫu B1 là có kết quả định lượng đáng tin cậy. Mẫu B6 có kết quả định lượng khá tin cậy, dựa trên các kết quả thu nhận được ở Bảng 4.17, 4.18 và 4.19. Các kết quả này chứng tỏ sự hiện diện của sản phẩm biến đổi gen trong bắp trái ăn tươi tại Tp Hồ Chí Minh và phụ cận. Tương tự, kết quả định lượng ở mẫu B7 cũng khá tin cậy, dựa trên các kết quả thu nhận được. Mẫu này có nguồn gốc từ các loại bắp được trồng từ giống B1, B2, B4 và các giống khác, sau đó qua quá trình xay xát tạo nên. Điều này cũng chứng minh có sự hiện diện của hạt giống bắp chuyển gen tại Việt Nam. Hai mẫu B10 và B11 có kết quả định lượng p35S vượt quá kết quả định lượng gen tham chiếu. Điều này có thể do các mẫu này là sản phẩm chế biến, được tạo thành từ rất nhiều thành phần nguyên liệu khác nhau, nên có thể con số này là tổng số lượng promoter 35S trong mẫu chứ không chỉ riêng từ bắp chuyển gen. Mặc khác, do bắp 83 83 chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong thành phần nguyên liệu nên số lượng gen tham chiếu phát hiện được rất thấp. Điều này đã ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Đây cũng chính là nhược điểm của phương pháp định lượng dựa trên promoter 35S. Như vậy, từ các kết quả thu nhận được từ thí nghiệm 5, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: - Phương pháp Real-Time PCR với mẫu dò Taqman có thể được ứng dụng cho việc định lượng các mẫu sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam. Các kết quả thu nhận được từ các mẫu có nguồn gốc khác nhau, từ các mẫu thô (hạt bắp) đến các mẫu đã trải qua quá trình chế biến phức tạp (bột ngũ cốc dinh dưỡng) chứng tỏ khả năng áp dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng của phương pháp Real-Time PCR. - Các kết quả trong thí nghiệm này cùng với kết quả sàng lọc bằng phương pháp Real-Time PCR (SYBR Green I) cũng cố thêm chứng minh về độ nhạy cao của phương pháp này. Mặc dù các kết quả là khác biệt, chúng cho thấy phương pháp Real-Time PCR có thể cho phép phát hiện và định lượng trình tự DNA trong các mẫu có nguồn gốc và chất lượng rất khác nhau. - Các sai lệch về kết quả định lượng trong thí nghiệm này có thể giải thích do một số nguyên nhân như sau: Sự ngoại nhiễm do môi trường thực hiện thí nghiệm cũng như thao tác của kĩ thuật viên gây ra. Các sai sót này có thể do việc bơm hút mẫu, môi trường làm việc không vô trùng, dụng cụ thí nghiệm chưa khử trùng kỹ lưỡng…điều này chứng tỏ độ nhạy rất cao của phương pháp đồng thời đặt ra các yêu cầu về việc chuẩn hóa các phòng thí nghiệm định lượng. Chất lượng DNA ly trích. Các kết quả khác biệt có thể xảy ra ngay trong cùng một mẫu do chất lượng DNA ly trích có thể không ổn định hay do thao tác khi bơm hút mẫu của kĩ thuật viên. Điều này đặt ra yêu cầu về việc hoàn thiện hóa các quy trình ly trích DNA chuẩn nhằm đảm bảo tốt nhất chất lượng của DNA, đối tương chính của thí nghiệm này. Như vậy, tuy phương pháp này đặt ra một số yêu cầu đối với đầu tư trang thiết bị, chuẩn hóa phòng thí nghiệm, huấn luyện kĩ thuật viên, khả năng ứng dụng thành công phương pháp này tại nước ta là rất hứa hẹn. 84 84 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Vấn đề định lượng sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam còn khá mới mẻ. Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi chỉ mới bước đầu nghiên cứu về tính khả thi của phương pháp Real-Time PCR trong việc định lượng DNA. Từ các kết quả thu nhận được, chúng tôi có một số kết luận về quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen như sau: - Bước 1: Ly trích DNA mẫu sản phẩm. Phương pháp đề nghị: Quy trình 3 (quy trình biến đổi). Tác nhân biến tính màng là CTAB, biến tính protein là phenol/chloroform, tủa bằng Isopropanol trong điều kiện lạnh (4 o C). Khó khăn: Lượng DNA thu được chưa cao, một số mẫu không ly trích được DNA. Giải pháp: Thử nghiệm các phương pháp mới, sử dụng bộ kit ly trích. - Bước 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I. Khó khăn: Xuất hiện hiện tượng mồi bắt cặp không đặc hiệu trong một số mẫu. Giải pháp: Cần tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp. - Bước 3: Định lượng các sản phẩm biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò đặc hiệu Taqman với độ nhạy 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm . Khó khăn: Chỉ có thể định lượng tổng số thành phần chuyển gen trong các mẫu hỗn hợp. Giải pháp: Cần định lượng các trình tự đặc hiệu hơn cho từng loại sản phẩm. Về việc ứng dụng phương pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trường, chúng tôi có một số kết luận sau: - Các mẫu đã sàng lọc và định lượng có sản phẩm biến đổi gen: 3 mẫu hạt giống bắp, 1 mẫu bắp trái ăn tươi, 1 mẫu bột bắp làm nguyên liệu thức ăn gia súc, 1 mẫu thức ăn gia súc, 1 mẫu bột ngũ cốc dinh dưỡng. 85 85 - Có hiện diện các sản phẩm chuyển gen là thực phẩm cho người như: bắp trái ăn tươi, bột ngũ cốc dinh dưỡng. Chúng có thể bắt nguồn hay có chứa thành phần nguyên liệu có nguồn gốc từ cây trồng biến đổi gen. 2. Đề nghị Tuy nhiên, do giới hạn thời gian và điều kiện thí nghiệm, cũng như đây là nghiên cứu ban đầu về phương pháp Real-Time PCR trong định lượng sản phẩm biến đổi gen, chúng tôi có một số đề nghị sau: - Khóa luận chưa kiểm chứng độ đặc hiệu của mồi tự thiết kế và trong bộ kit định lượng p35S vì vậy, cần tiến hành một số phương pháp khẳng định lại sản phẩm khuếch đại DNA là p35S như: dùng enzyme cắt giới hạn, giải trình tự gen. - Các mẫu âm tính có thể là mẫu chuyển gen bằng các thành phần khác (promoter 35S chỉ hiện diện trong 70 % tổng số cây trồng biến đổi gen trên thế giới), vì vậy cần mở rộng nghiên cứu sang các trình tự khác, làm phong phú thêm khả năng phát hiện và định lượng - Tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về định lượng sản phẩm biến đổi gen, tiến đến định lượng các trình tự đặc hiệu của từng sản phẩm biến đổi gen, như: gen chuyển nạp, trình tự nối promoter và gen chuyển nạp…nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp định lượng dựa trên promoter 35S là chỉ có thể định lượng được tổng số thành phần biến đổi gen trong các mẫu sản phẩm hỗn hợp. - Tiến hành nghiên cứu và khảo sát trên số lượng mẫu lớn, các chủng loại mẫu khác nhau để có tổng kết về tình hình sản phẩm biến đổi gen tại Việt Nam. 86 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Lan Anh, 2004. Khảo sát qui trình biến nạp gen trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv Samsun). Khóa luận cử nhân khoa học, ĐH Khoa Học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, trang 5-12, 16-19. 2. Lê Thanh Bình, 2004. Quản lý an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen và sản phẩm của chúng. Hội nghị National Workshop on Risk Assessment of GM Crops-VN, tháng 10 năm 2004, 42 slide. 3. Clive James, 2004. Tình trạng cây trồng chuyển gen/cây trồng công nghệ sinh học được trồng và mua bán trên toàn thế giới trong năm 2004. Báo cáo đánh giá. ISAAA, Mỹ, 14 trang. 4. Cơ quan dịch vụ quốc tế về tiếp thu các ứng dụng Công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA), 2005. Cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu gần đạt mức tăng trưởng kỉ lục. ISAAA, Mỹ. 2 trang. 5. Bùi Văn Lệ, 2004. Sinh vật biến đổi gen: Thực trạng và giải pháp. Báo cáo chuyên đề, ĐH Khoa Học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, 55 slides. 6. La Tuấn Nghĩa, 2004. Bài phát biểu giới thiệu. Hội nghị National Workshop on Risk Assessment of GM Crops-VN, tháng 10 năm 2004, 5 trang. 7. Nguyễn Hồng Minh Ngọc, 2004. Hoàn thiện phương pháp chuẩn đoán nông sản chuyển gen dựa trên kỹ thuật PCR. Khóa luận Kỹ sư Nông nghiệp, Khoa Nông học, ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, 56 trang. 8. Nguyễn Thái Thủy, 2004. PCR và Real-Time PCR. Bài giảng ĐH Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, 110 slides. 9. Phạm Thị Anh Thư, 2004. “Giới thiệu về sinh vật chuyển đổi gen (GMOs)”. Hội thảo, Hội các phòng thí nghiệm Việt Nam (VINATEST), Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam. Anh văn 10. Agrifood Awareness Australia Limited, 2004. Global GM Food Labelling Laws. Biotech Bulletin 8. Agrifood Awareness Australia Limited, 7 pages. 11. Applied Biosystems. Real-Time PCR Vs. Traditional PCR. Tutorial, Applied Biosystems, USA, 15 pages 12. Benbrook C., 2003. Impacts of Genetically Engineered Crops on Pesticide Use in the United States: The First Eight Years. BioTech InfoNet, Technical Paper Number 6, USA, 46 pages. 87 87 13. Bio-Rad, 2005. GMO Testing in Food and Feed: Extraction, Detection and Quantification. Bio-Rad, American, 8 pages. 14. Bio-Rad, 2005. MyiQ™ Single-Color Real-Time PCR Detection System. Instruction manual, catalog number 170-9740. Bio-Rad, USA, 133 pages. 15. Bio-Rad. Biotechnology Explorer™ GMO Investigator™ Kit. Bio-Rad, USA, 79 pages. 16. Carolina Roa-Rodríguez, 2003. Promoters used to regulate gene expression. Cambia Intellectual Property Resource, Australia, p. 1-24, 55-65. 17. Choi Yang Do, Cheong Jong-Joo, 2004. The Current Status of GMOs Development. Crop Functional Genomics Center, School of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, p 3, 7-17. 18. Clive James, 2004. Biotech crop Countries and Mega-Countries, 2004. ISAAA, USA. 19. Clive James, 2004. Global Adoption rates (%) for pricipal Biotech Crops (Million Hectares). ISAAA, USA. 20. Clive James, 2004. Global Area of Biotech Crops Million Hectares (1996 to 2004). ISAAA, USA. 21. Clive James, 2005. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2004. ISAAA, 12 pages. 22. Council For Biotechnology Information, 2002. Benefits of Plant Biotechnology. Council For Biotechnology Information. 54 slides. 23. EEA (European Environment Agency), 1999. Genetically modified organisms. Environment in the European Union at the turn of the century. Environmental assessment report No 2: 245- 261. EEA (European Environment Agency), EU. 24. Eyquem F., 2004. Quantitative Detection of Roundup Ready Soybean by ELISA. The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.). European Commission Joint Research Center, EU. 21 pages. 25. Francisco Xavier Moreano Guerra, 2005. Development of techniques for the quantification of DNA from genetically modified organisms in processed foods. Doctor thesis, Technology University of Munich, Germany. 124 pages. 26. Friends of the Earth International, 2003. Biosafety Protocol ratification provides new measures to guard against genetically modified organisms. Fact sheet, Friends of the Earth International, 3 pages. 27. Friends of the Earth, 2004. Genetically Modified Crops: a decade of failure [1994 - 2004]. Issue 105. Friends of the Earth International, 52 pages. [...]... Systems: Principles of Real-Time PCR and Taqman Systems, PE Biosustems, Australia and New Zealand http://cgr.otago.ac.nz/SLIDES/TAQMAN/SLD013.HTM 48 Real-Time PCR 2004 http://www.au.poznan.pl/~mschmidt/realpisuar.htm 89 90 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đệm trích 1 - Tris/HCl 0,05 mol/l - EDTA 0,05 mol/l - SDS 30 g/l - Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M - Hấp tiệt trùng - Giữ 4oC sử dụng trong 6 tháng Phụ lục 2:. . .88 28 Gaskell George et at., 2000 Biotechnology and the European public Nature Biotechnology 1 8: 935-9 38 Nature, American 29 GeneScan Calibration DNA Standards for 35S Corn DNA Quantification Standard Lot #0220502 GeneScan, Germany, 1 page 30 GeneScan GMOQuant 35S Screen Corn Kit Protocol for use of Product cat No 5121200610 GeneScan, Germany, 3 pages 31 ISAAA Does... mol/l - Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M - Hấp tiệt trùng - Giữ 4oC sử dụng trong 6 tháng Phụ lục 3: Dung dịch CTAB tủa - CTAB 5 g/l - NaCl 0,04 mol/l - Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M - Hấp tiệt trùng - Giữ 4oC sử dụng trong 6 tháng Phụ lục 4: Dung dịch RNase A - RNase A 10 mg/ml - Hòa tan trong nước cất siêu sạch - Giữ -20oC, chỉ nên sử dụng một lần sau khi rã đông Phụ lục 5: Dung dịch NaCl... Veterinary Institute, NORWAY http://www.entransfood.com/workinggroups/wg4TQA/GMO%20detection%20methods%20usi ng%2 0PCR% 20review.htm http://www.entransfood.com/workinggroups/wg4TQA/ahjgmrevfig5.gif 45 Food and Feed Safety Community register of GM Food & Feed http://europa.eu.int/comm/food/dyna/gm_register/index_en.cfm 46 Genetic Transcription and Regulation and Control http://www.mun.ca/biology/scarr/4241A_Ch13.html... of Genetically Modified Soybean in Processed Foods Using Real-Time Quantitative PCR with SYBR Green I Dye on the DNA Engine Opticon® 2 System Application Note Vol.2, No.6, MJ Research, Inc., South San Francisco, CA, USA, 4 pages 33 Querci M., Maretti M., Mazzara M., 2004 Qualitative Detection of Mon810, Bt-176 Maize ang Roundup Ready Soybean by PCR The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically... analytical methods for the identification and determination of genetically modified organisms (GMOs) in food and food ingredients Final Report, The European Commission DG Joint Research Centre, p 9-12 88 89 40 Viljoen, C.D., Botha, G.M and Chetty, L GMO testing: A prerequisite for Identity Preservation of non-GM crops GMO Testing Facility, Department of Plant Science, University of the Free State, 6 pages... Qualitative PCR Systems Described in the Manual The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.) European Commission Joint Research Center, EU p 4 35 Querci M., Van den Eede G., Jermini M., 2004 Overview, General Introduction on Genetically Modified Organisms (GMOs), EU legislation The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically... 3-12, Annex 1 36 Rogers S.O and Bendich A.J, 1 988 Extraction of DNA from plant tissues Plant Molecular Biology Manual A6, p.1-10 37 Soil Association, 2004 GM Food: Scientific Evidence of Health Risks Information sheet, Soil Association, England, 3 pages 38 Somma M., 2004 Extraction and Purification of DNA The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van... Assessment of GM Crops-VN, Oct 2004, 40 slides 42 Weighardt F., 2004 Quantitative PCR for the Detection of GMOs The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms (Querci M., Van den Eede G., Jermini M.) European Commission Joint Research Center, EU p 3- 18 Web 43 AgriQuality GMO Services – Quantification http://www.agriquality.co.nz/horticulture/agriquality_gmo_services/quantification.cfm . của phương pháp Real-Time PCR trong việc định lượng DNA. Từ các kết quả thu nhận được, chúng tôi có một số kết luận về quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen như sau: - Bước 1: Ly. nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp. - Bước 3: Định lượng các sản phẩm biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề ngh : Real-Time PCR với mẫu dò đặc hiệu. sản phẩm. Về việc ứng dụng phương pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trường, chúng tôi có một số kết luận sau: - Các mẫu đã sàng lọc và định lượng có sản phẩm biến đổi gen: 3