Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 6 ppt

52 52 - Kết quả thí nghiệm được hiển thị ở mục Data Analysis. Trong trường hợp phân tích một kết quả thí nghiệm cũ, chọn mục Library và chọn chương trình chạy trong mục View Post-Run Data. Hình 3.5: Màn hình View Post-Run Data - Phân tích kết quả trên màn hình DNA Quantification (chế độ Normal View). Các thao tác phân tích được tiến hành như sau: Loại trừ tín hiệu nền trên đồ thị bằng cách chọn Background Subtracted ở mục Select analysis mode. Phân tích đường đồ thị bằng cách chọn mục PCR Base line Subtracted. Xác định chu kỳ ngưỡng (Threshold Cycle Calculation): Tính toán giá trị chu kỳ ngưỡng, bao gồm hai mục nhỏ: Baseline Cycles (xác định chu kỳ thu nhận tín hiệu huỳnh quang làm tín hiệu nền), Threhold Position (xác định vị trí chu kỳ ngưỡng). Cả hai mục này đều cho phép 2 chế độ: Auto Calculated (máy tự động thiết lập), User Defined (người dùng tự thiết lập). - Xây dựng đường chuẩn ở mục PCR Standard Curve dựa trên các mẫu chuẩn với các thông số đã biết. Ta cần xác định các thông số tốt nhất cho đường chuẩn bao gồm: Thông số giá trị tương quan r 2 (Correlation Coefficient): thông thường phải đạt trên 0,98. Hiệu quả PCR (PCR efficiency) phải trong mức 80%-120%. 53 53 Hình 3.6: Màn hình PCR Quantification - Xác định các kết quả tính toán: Dựa trên đường chuẩn đã xây dựng, ta xác định các giá trị của mẫu chưa biết như: số lượng copy ban đầu, độ lệch chuẩn Hình 3.7: Màn hình PCR Standard Curve - Phân tích Melt Curve: Phân tích nhiệt độ nóng chảy, dùng trong trường hợp Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I. Chúng tôi tiến hành như mục 5.5.3. 54 54 Như vậy, các kết quả thí nghiệm 3 cho phép chúng tôi so sánh hai phương pháp định lượng bằng kỹ thuật Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dò Taqman. Phương pháp đề nghị sẽ được ứng dụng cho các thí nghiệm về sau. 8. Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR. Mục tiêu Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR được đề nghị ở thí nghiệm 3 qua các chỉ tiêu: độ nhạy, độ chính xác. Nguyên tắc - Độ nhạy của phƣơng pháp: Được xác định qua số lượng bản copy promoter 35S hiện diện thấp nhất trong mẫu thí nghiệm mà phương pháp đề nghị có thể phát hiện và định lượng. - Độ chính xác: được thể hiện qua khả năng định lượng chính xác một mẫu thực vật biến đổi gen đã biết trước tỷ lệ % chuyển gen (Bắp Bt 176 1%). Vật liệu thí nghiệm - Chuẩn 35S của công ty GeneScan. - Bắp chuyển gen Bt 176 với tỷ lệ phần trăm chuyển gen là 1% (GeneScan). Trang thiết bị Tương tự thí nghiệm 3. Hóa chất - GMO Quant 35S Screen Corn Kit Cat. No. 512 12006 10 (GeneScan). Gồm có: 35S master mix (2 x 50 phản ứng) Gen tham chiếu (Corn-reference) master mix (2 x 50 phản ứng) Chuẩn 35S Chuẩn gen tham chiếu (corn-reference) DNA bắp chuyển gen Bt176 1% 55 55 - Nước siêu sạch. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix Các master mix này được dùng cho các phản ứng định lượng bắp chuyển gen có chứa promoter 35S trong thực phẩm. 35S master mix chứa các thành phần cần thiết cho việc phát hiện đặc hiệu trình tự promoter CaMV 35S hiện diện trong một số giống bắp chuyển gen phổ biến hiện nay. Gen tham chiếu (Corn-reference) master mix có chứa tất cả các thành phần cần thiết cho việc phát hiện gen tham chiếu trong cả bắp chuyển gen và không chuyển gen. Cả hai hệ thống đều sử dụng mẫu dò (probe) có gắn chất phát quang FAM 490. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference calibration DNA standards) Bảng 3.12: Lƣợng lý thuyết (Số lƣợng phân tử) của hai chuẩn Chuẩn Lƣợng lý thuyết (Số lƣợng phân tử) (copy) 35S Gen tham chiếu Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3 Chuẩn 4 40960 5120 640 80 5120 640 80 10 Các chuẩn này giúp cho việc xác định đường chuẩn phục vụ cho việc định lượng DNA. Phƣơng pháp thực hiện Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR được đề nghị ở thí nghiệm 3. 56 56 Bố trí thí nghiệm Độ nhạy phản ứng Thể hiện thông qua khả năng phát hiện và định lượng promoter 35S hiện diện trong mẫu ở số lượng thấp nhất có thể. Để thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi định lượng mẫu có số lượng 1 copy gen đích. Bảng 3.13: Xác định độ nhạy phƣơng pháp Real-Time PCR Thành phần Số lƣợng lý thuyết Mẫu 1 1 copy Độ chính xác: Thể hiện thông qua khả năng định lượng chính xác mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen được xác định trước. Mẫu được lặp lại nhiều lần nhằm đánh giá độ chính xác của phương pháp. Các mẫu được sử dụng là bắp chuyển gen Bt 176 1% (biết trước tỷ lệ). - Mẫu bắp Bt 176 được định lượng để xác định lại tỷ lệ phần trăm chuyển gen. Mẫu được lặp lại 2 lần Thiết kế phản ứng định lƣợng Thí nghiệm Real-time PCR được thiết kế như sau: - 1 phản ứng PCR dùng phát hiện promoter 35S (trình tự DNA đặc trưng cho GMO). Bao gồm: 4 phản ứng cho 4 chuẩn 35S, dùng để dựng đường chuẩn định lượng p35S. 1 phản ứng cho đối chứng dương. 1 phản ứng cho đối chứng âm. Các phản ứng cho mẫu thí nghiệm chưa biết. - Phản ứng PCR thứ hai được thiết kế để xác định trình tự một gen đối chiếu, đặc trưng cho loài và thường sử dụng cho định lượng GMO. Bao gồm: 57 57 4 phản ứng cho 4 chuẩn gen tham chiếu, dùng để dựng đường chuẩn định lượng gen tham chiếu. 1 phản ứng cho đối chứng dương. 1 phản ứng cho đối chứng âm. Các phản ứng cho mẫu thí nghiệm chưa biết. Thành phần phản ứng Real-Time PCR Bảng 3.14: Thành phần phản ứng Real-Time PCR trong thí nghiệm 4 35S Gen tham chiếu 35S Master mix Mẫu DNA 20 μl 5 μl Corn-reference Master mix Mẫu DNA 20 μl 5 μl Tổng cộng 25 μl Tổng cộng 25 μl Chƣơng trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR Bảng 3.15: Chƣơng trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR (mẫu dò Taqman) Nhiệt độ Thời gian Đọc tín hiệu huỳnh quang Giai đoạn 1 95 o C 10 phút Giai đoạn 2 - Bƣớc 1 - Bƣớc 2 Số chu kỳ 95 o C 60 o C 45 15 giây 1 phút x 58 58 Phân tích kết quả Các kết quả được phân tích tương tự như thí nghiệm 3. Chúng sẽ được so sánh với các số lượng lý thuyết biết trước nhằm đánh giá khả năng của phương pháp. Các kết quả thu nhận được sẽ được tính toán thành tỷ lệ phần trăm chuyển gen trong mẫu, theo công thức: % GMO= (số lượng promoter 35S/số lượng gen tham chiếu) x 100 Như vậy, kết quả của thí nghiệm này cho phép ta đánh giá được khả năng định lượng của phương pháp. Các kết quả thu được giúp chúng tôi tiến hành ứng dụng phương pháp này trên các mẫu sản phẩm trên thị trường. 9. Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng Mục tiêu Bằng phương pháp Real-Time PCR đề nghị, chúng tôi khảo sát tỷ lệ phần trăm chuyển gen một số mẫu sản phẩm bắp có mặt trên thị trường. Các kết quả này cho ta một cái nhìn tương đối về tình hình sản phẩm biến đổi gen tại Tp Hồ Chí Minh và vùng phụ cận nơi thu nhận mẫu Nguyên tắc Các mẫu thu thập được định lượng gen tham chiếu của bắp và promoter 35S bằng phương pháp Real-Time PCR. Các kết quả thu nhận được tính toán thành tỷ lệ phần trăm chuyển gen của các mẫu trên. Vật liệu thí nghiệm - Đối chứng dương: Bắp chuyển gen Bt 176 1% (GeneScan). - Đối chứng âm: Nước siêu sạch - Các mẫu có kết quả sàng lọc dương tính bằng phương pháp đề nghị ở thí nghiệm 2 Trang thiết bị và hóa chất Tương tự thí nghiệm 4 59 59 Phƣơng pháp thực hiện Bố trí thí nghiệm Các mẫu thí nghiệm được lặp lại 2 lần trong cùng 1 thí nghiệm và lặp lại thí nghiệm nhiều lần để đạt kết quả tốt nhất. Thiết kế phản ứng định lƣợng Tương tự thí nghiệm 4. Thành phần phản ứng và chƣơng trình nhiệt thiết lập Tương tự thí nghiệm 4. Phân tích kết quả Các kết quả thu nhận được tính toán theo công thức: % GMO=(số lượng promoter 35S/số lượng gen tham chiếu)x100 Các kết quả này cung cấp cho ta tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một số mẫu bắp hiện diện trên thị trường. Các kết quả này có thể phục vụ cho các mục tiêu khảo sát về sau. 60 60 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Khảo sát các quy trình ly trích DNA Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 quy trình ly trích DNA. Mỗi quy trình được lặp lại 3 lần, mỗi lần 4 eppendorf. Các kết quả ly trích được đo OD ở các bước sóng 260 nm và 280 nm và được điện di trên gel agarose 2% nhằm đánh giá chất lượng và hàm lượng DNA ly trích. Các kết quả thu nhận được như sau: Hình 4.1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích Sau khi ly trích, chúng tôi đo OD các mẫu ở bước sóng 260 nm và 280 nm, tính tỷ lệ OD 260nm /OD 280nm , xác định độ tinh sạch của mẫu DNA, và xác định lượng DNA thu được từ 0,1 g mẫu. Các kết quả thu nhận được như sau: Bảng 4.1: Kết quả đo OD 3 quy trình ly trích DNA Quy trình Số mẫu có tỷ lệ OD 260/280 ngoài khoảng 1,8-2 Số mẫu có tỷ lệ OD 260/280 trong khoảng 1,8-2 Phần trăm mẫu tinh sạch Lƣợng DNA thu đƣợc từ 0,1 g mẫu (μg) 1 2 3 8 8 5 4 4 7 33.33 33.33 58,33 1.75 ± 0,45 5,04 ± 1,44 11,33 ± 1,58 Quy trình 3 Quy trình 2 Quy trình 1 61 61 Chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau: - Quy trình 3 cho kết quả ly trích tốt nhất, số lượng mẫu tinh sạch cao, lượng DNA thu được từ mẫu là cao nhất. - Tác nhân phá màng: Không có sự khác biệt đáng kể giữa CTAB và SDS. - Tác nhân thu tủa: Isopropanol cho kết quả thu tủa DNA tốt hơn ethanol tuyệt đối. - Điều kiện tủa DNA: Ly tâm ở nhiệt độ thấp cho kết quả thu tủa DNA tốt hơn nhiệt độ bình thường. - Số lần biến tính protein nhiều (quy trình 1 và 2) làm DNA bị mất và gãy nhiều. - Quy trình 3: Số lần biến tính thấp (2 lần) với tác nhân biến tính mạnh, đồng thời giai đoạn thu tủa DNA được tiến hành trong nhiệt độ thấp nên lượng DNA thu được là cao nhất so với 2 quy trình còn lại. - Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng quy trình 3 để ly trích DNA các mẫu sản phẩm phục vụ cho các thí nghiệm sau. Dựa trên quy trình ly trích đề nghị, chúng tôi tiến hành ly trích các mẫu sản phẩm có được. Kết quả điện di 12 mẫu sản phẩm như sau: Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm [...]... lọc các mẫu sản phẩm có DNA ly trích đạt chất lượng tốt từ quy trình 2 Mẫu thí nghiệm là 10 mẫu có DNA ly trích đạt chất lượng tốt ở bảng 3.1 Các mẫu sản phẩm được thử nghiệm bằng 2 phương pháp: - Phương pháp 1: PCR truyền thống (phương pháp đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới) - Phương pháp 2: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I (phương pháp đề nghị) Phƣơng pháp 1: PCR truyền thống Các. . .62 Ghi ch : 1: mẫu B1 3: mẫu B3 5: mẫu B5 7: mẫu B7 9: mẫu B9 1 1: mẫu B11 2: mẫu B2 4: mẫu B4 6: mẫu B6 8: mẫu B8 1 0: mẫu B10 1 2: mẫu B12 Bảng 4. 2: Kết quả tách chiết DNA các mẫu Lƣợng mẫu trích Kí hiệu mẫu Lƣợng DNA thu một lần (mg) STT đƣợc (µg) ± SD 1 B1 100 mg 11,051 ± 0,25 2 B2 100 mg 11.08 ± 0.31 3 B3 100 mg 12,2 96 ± 1 ,61 4 B4 100 mg 11,4 ± 0,91 5 B5 100 mg 12,121 ± 1, 76 6 B6 100 mg... 2 ,65 ± 0,17 10 B10 100 mg 2 .68 ± 0,11 11 B11 100 mg 1,98 ± 0,18 12 B12 100 mg 0,845 ± 0,051 Chúng tôi nhận thấy, kết quả ly trích các mẫu có sự chênh lệch lớn, các mẫu thô hoặc chưa qua chế biến có lượng DNA ly trích thu được nhiều hơn các mẫu đã qua chế biến Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu các quy trình ly trích thích hợp cho từng loại sản phẩm Từ kết quả ly trích các mẫu sản phẩm chúng tôi quy t định. .. thức ăn gia súc B7 6 Thức ăn gia súc 2 B10 7 Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1 B11 Nhận xét - Các kết quả điện di cho thấy quy trình PCR được thiết kế tốt, mồi có độ đặc hiệu cao được thể hiện qua bảng điện di không có sản phẩm phụ Về phương pháp PCR, chúng tôi có nhận xét như sau : Sản phẩm khuếch đại DNA được đánh giá bằng kĩ thuật điện di và đọc kết quả trên đèn UV Quá trình này đòi hỏi sản phẩm DNA phải được... sàng lọc mẫu sản phẩm chuyển gen 62 63 Bảng 4. 3: Các mẫu ly trích đạt kết quả tốt Tên và đặc điểm của mẫu STT Kí hiệu 1 Bắp giống 1 B1 2 Bắp giống 2 B2 3 Bắp giống 3 B3 4 Bắp giống 4 B4 5 Bắp giống 5 B5 6 Bắp trái ăn tươi B6 7 Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc B7 8 Thức ăn gia súc 1 B9 9 Thức ăn gia súc 2 B10 10 Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1 B11 2 Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Trong thí... di như sau: Qua kết quả điện di, chúng tôi xác định được có 7 mẫu dương tính với promoter 35S (xuất hiện vạch điện di có kích thước 123 bp) 63 64 Mẫu: B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B9 B10 B11 Hình 4. 3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phƣơng pháp 1 Bảng 4. 4: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng phƣơng pháp 1 STT Mẫu dƣơng tính Kí hiệu 1 Bắp giống 1 B1 2 Bắp giống 2 B2 3 Bắp giống 4 B4 4 Bắp trái ăn tươi B6 5 Bột bắp... nhận xét như sau : Sản phẩm khuếch đại DNA được đánh giá bằng kĩ thuật điện di và đọc kết quả trên đèn UV Quá trình này đòi hỏi sản phẩm DNA phải được lấy ra khỏi eppendorf và chịu tác động của các yếu tố cơ học, 64 . sản phẩm chúng tôi quy t định chọn ra 10 mẫu để thực hiện thí nghiệm sàng lọc mẫu sản phẩm chuyển gen. 1: mẫu B1 2: mẫu B2 3: mẫu B3 4: mẫu B4 5: mẫu B5 6: mẫu B6 7: mẫu B7 8: mẫu B8 9:. chất lượng tốt ở bảng 3.1. Các mẫu sản phẩm được thử nghiệm bằng 2 phương pháp: - Phương pháp 1: PCR truyền thống (phương pháp đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới). - Phương pháp 2: Real-Time. hình sản phẩm biến đổi gen tại Tp Hồ Chí Minh và vùng phụ cận nơi thu nhận mẫu Nguyên tắc Các mẫu thu thập được định lượng gen tham chiếu của bắp và promoter 35S bằng phương pháp Real-Time