Xây dựng quy trình định lượng cytomegalovirus (CMV) trong máu, nước tiểu bằng phương pháp real time PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - Đặng Hồng Cúc XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CYTOMEGALOVIRUS (CMV) TRONG MÁU, NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS CAO MINH NGA Thành phố Hồ Chí Minh - 2010 Lời cảm ơn Với lòng kính trọng chân thành, xin cảm ơn: Quý thầy, cô Khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp cho kiến thức quý báu suốt khóa học Cô TS Trần Thanh Thủy, trưởng môn Vi sinh vật, khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HỒ CHÍ MINH tạo thuận lợi để hoàn thành tốt luận văn Cô PGS TS Cao Minh Nga, giảng viên môn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, phó trưởng khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Dược tận tâm hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Cử nhân Hồ Thị Thanh Thủy- PGĐ công ty cổ phần công nghệ Việt Á, cử nhân Nguyễn Văn Hưng- trưởng phòng dịch vụ & KCS, tập thể cán bộ, công nhân viên phòng công ty tận tình giúp đỡ thực nghiệm đề tài để hoàn thành kết luận văn ThS- BS Phùng Như Toàn- Trưởng phòng tham vấn tiền sản, Th.S Bs Lê Minh Hoài AnTrưởng khoa Xét nghiệm, Bs Lê Nguyễn Bảo Trân-trưởng P.A8- phòng xét nghiệm dịch vụ, KTV Tôn Nữ Thu Trang tập thể nhân viên phòng xét nghiệm bệnh viện Từ Dũ tạo thuận lợi cung cấp cho số liệu mẫu bệnh phẩm (nước tiểu, máu) nhiễm CMV Dược sĩ Nguyễn Thanh Tòng- Trưởng khoa Xét nghiệm Trung tâm y khoa Medic, BS Nguyễn Bảo Toàn-phòng Sinh học phân tử KTV Đặng Đình Triển, phòng xét nghiệm kháng thể trung tâm y khoa Medic cung cấp cho số liệu mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV, HSV Tập thể bạn lớp cao học K18 – khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HCM động viên giúp đỡ suốt khóa học làm luận văn Xin chân thành cảm ơn Đặng Hồng Cúc DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT - BLAST: Basic local alignment tool - CMV: Cytomegalovirus - COBAS: COBAS AMPLICOR™ CMV MONITOR - CSF: Cerebrospinal fluid: dịch não tủy - Da: Dalton, đơn vị đo khối lượng phân tử protein - DNA: Deoxyribonucleic acid - dNTP: Deoxynucleoside triphosphate - dNTP: deoxynucleotie triphosphate - dUTP: deoxy Uracil triphosphate - EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid - gB: glycoproteinB - GE: genome-equivalent - IDT: Intergrated DNA Technologies - IE: immediate early: sớm tức - LC-PCR: LightCycler® polymerase chain reaction - PBL: Peripheral blood leucocytes: bạch cầu máu ngoại biên - PMNLs: polymorphonuclear leucocytes: bạch cầu đa nhân - Pol: polymerase - PTLD: post-transplant lymphoproliferative disorder: rối loạn tăng sinh tế bào lympho sau ghép - qPCR: quantitative polymerase chain reaction: PCR định lượng - UL: unique long - UNG: Uracyl – N – glycosylase - WB: whole blood: máu toàn phần MỞ ĐẦU Nhiễm Cytomegalovirus (CMV) loại nhiễm virus thường gặp cộng đồng, chiếm tỉ lệ từ 60% đến 99% người lớn toàn giới [51], gây triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán nhiễm CMV quan tâm CMV tác nhân sinh bệnh nhiễm trùng hội nguy bệnh CMV tùy thuộc đáp ứng miễn dịch thể Nhiễm CMV tái kích hoạt bệnh nhân có hệ thống miễn dịch suy yếu, tác nhân gây bệnh nặng, chí gây tử vong cho người sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, người cấy ghép nội tạng, đặc biệt người nhiễm virus HIV CMV nguyên nhân gây nhiễm trùng bẩm sinh thường gặp thai phụnhiễm trùng ToRCH (Toxoplasmase, Rubella, CMV, Herpes simplex virus), gây nguy hại cho thai nhi: 0,5%-2,5% trẻ sơ sinh mắc bệnh CMV bị vàng da, lách to, giảm tiểu cầu, suy thai, nhỏ đầu, viêm võng mạc, CMV để lại di chứng khốc liệt lúc sinh[11], [12], [13], [24], [72] Ngoài ra, nghiên cứu Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC) xuất số ngày 15 tháng năm 2009, cho thấy lần CMV, nguyên nhân gây huyết áp cao, kết hợp với yếu tố nguy khác bệnh tim, CMV gây xơ vữa, xơ cứng động mạch [51] Do đó, chẩn đoán sớm nhiễm CMV để đánh giá xác tình trạng bệnh nhân cần thiết Đã có nhiều công trình nghiên cứu chẩn đoán nhiễm CMV tìm kháng thể IgG-CMV, IgM-CMV, nuôi cấy virus, tìm tế bào nội mô cho kết khả quan Đặc biệt, với phát triển sinh học phân tử, người ta sử dụng PCR định tính CMV phương pháp khó phân biệt nhiễm tiềm tàng (nhiễm CMV không biểu triệu chứng) hay nhiễm họat động (nhiễm CMV biểu triệu chứng) Jiska Jebbink, cộng [42] số lượng CMV khoảng 10.000 genomes virus /ml mẫu máu báo trước nhiễm CMV có nguy cao phát triển thành bệnh CMV Ngoài số công trình khác mối tương quan số lượng virus mẫu thử bệnh CMV (bảng 1) Bảng 1: Minh họa kết định lượng CMV tương quan bệnh CMV Tài liệu tham khảo Jayne C.Fos [41] năm 1995 PP định lượng Mẫu thử Số lượng gen virus/ml mẫu thử PCR (gB) Nước tiểu 106,5 Biểu triệu chứng x Không biểu triệu chứng Jayne C.Fos [41] năm1995 PCR (gB) Nước tiểu 105,2 Lazzarotto[47] năm 2000 qcPCR (IE1) Dịch ối 105 x Gouarin [45] năm 2002 Real-Time qPCR (UL83) Dịch ối 2,8x105 x Mẫu máu 3,5 log10 Mẫu máu 4,2log10 x Marianne LeruezVille [49] năm 2003 Marianne LeruezVille [49] năm 2003 Real-Time qPCR (UL123) Real-Time qPCR (UL123) x x Boppana [23] năm 2005 Real-Time qPCR (gB) Mẫu máu 1x104 x Ravit Arav-Boger [66] năm 2007 Real-Time qPCR (US17) Dịch ối 2,8x105 x Ravit AravBoger [66] năm 2007 Real-Time qPCR (US17) Dịch ối 8x103 x Vì vậy, việc định lượng CMV giúp bác sĩ tiên lượng có liệu pháp chữa trị sớm Phát kháng nguyên pp65 máu giúp cho việc định lượng CMV hữu hiệu, nhanh, nhiều nhược điểm Trong thời gian gần đây, từ 1993 đến phương pháp Real-Time PCR sử dụng nhiều nước [18], [26], [27] ,[28], [32], [33], [42], [46], [53], [56], [59], [70] định lượng CMV nhanh, xác , độ nhạy độ đặc hiệu cao giúp cho tiên lượng bệnh nhân nhiễm CMV có nguy phát triển thành bệnh CMV để kịp thời chữa trị, đồng thời giúp cho việc theo dõi kiểm tra hiệu lực liệu pháp chữa trị Tại Việt Nam nay, miền Nam Việt Nam, vài nơi công ty cổ phần công nghệ Việt Á, công ty khoa Thương, công ty Nam Khoa, bệnh viện Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh, bệnh viện Chợ Rẫy có kit thử định lượng CMV từ máu bệnh nhân Real-Time PCR, chưa thấy công trình xây dựng kỹ thuật định lượng CMV từ nước tiểu phương pháp Real-Time PCR Xuất phát từ thực tiễn trên, tiến hành đề tài : “Xây dựng quy trình định lượng CMV máu nước tiểu phương pháp Real-Time PCR” Giới hạn đề tài: Hiện nay, có bốn kiểu phản ứng sử dụng kỹ thuật Real-Time PCR với độ nhạy tương đương Molecular beacon, chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi, probe lai, probe thủy giải (TaqMan probe) Đề tài chọn kiểu phản ứng dùng TaqMan probe, vừa đơn giản, vừa có tính đặc hiệu cao Nhiệm vụ đề tài : - Thiết kế primers, TaqMan probe đặc hiệu định lượng CMV - Khảo sát điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real-Time PCR xây dựng quy trình định lượng CMV máu nước tiểu - Ứng dụng quy trình chẩn đoán số bệnh phẩm Đối tượng phạm vi nghiên cứu: - Những mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV phòng xét nghiệm BV Từ Dũ, trung tâm y khoa Medic, công ty cổ phần công nghệ Việt Á Đề tài thực phòng kỹ thuật môn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh công ty cổ phần công nghệ Việt Á CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương CMV CMV gọi virus đại bào, tế bào bị nhiễm CMV có kích thước khổng lồ, đặc biệt bên nhân bào tương lại xuất nhiều thể vùi có hình mắt cú đặc trưng (hình 1.1) Hình 1.1: Tế bào bị nhiễm CMV (bên trái), thể vùi “mắt cú” (bên phải) “Nguồn: www,pathguy,com/lectures/infect,htm” 1.1.1 Lược sử nghiên cứu CMV [14], [50], [51], [72] - Từ năm 1881, Ribbert người mô tả tế bào kích thước khổng lồ mang thể vùi diện thận em bé tử vong giang mai Năm 1907, phòng thí nghiệm Ribbert tiếp tục phát thể vùi 30 tuyến mang tai đứa trẻ từ tháng đến hai tuổi Nhưng ông sai lầm cho nguyên nhân động vật nguyên sinh (có tên Entamoeba mortinatalium) Vào năm 1920, Goodpasture Talbert người cho tề bào bị phình to hậu nhiễm virus, Goodpasture đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalia” để phồng to tế bào bị nhiễm Vào 1956, Smith Rowe phân lập CMV từ tuyến hàm tuyến amidan em bé, CMV gọi là: “virus tuyến nước bọt”, “virus gây bệnh thể vùi tuyến nước bọt” - Đến năm 1960, Weller cộng đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalovirus” thuật ngữ “bệnh virus tuyến nước bọt-CID (Cytomegalic inclusion disease)” khó sử dụng sai lầm, tuyến nước bọt nhiều vị trí bị nhiễm, Klemola Kaarrianinen mô tả bệnh tăng bạch cầu đơn nhân CMV(1965), năm người ta phát CMV bệnh nhân ghép thận Trong hai thập niên 1970 1980, sinh học phân tử CMV tiếp tục nhà khoa học nghiên cứu khám phá 1.1.2 Phân loại CMV người  CMV người Human Cytomegalovirus (HCMV) thành viên giống Herpesvirus thuộc họ Herpesviridae, chi Betaherpesvirinae Nhân sợi đôi DNA Có loài virus Herpes người chia làm phân họ (bảng 1.1) Bảng 1.1: loài virus Herpes gây bệnh người Phân họ Alpha- TT VIRUS Bệnh liên quan HSV-1 Mụn rộp môi HSV-2 herpesvirinae Mụn rộp phận sinh dục, gây ung thư cổ tử cung VARICELLA-ZOSTER VIRUS (VZV) Bệnh thủy đậu (HHV3) Bệnh Betaherpesvirinae EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV_HHV4) tăng tế bào đơn nhân, Burkitt lymphoma, ung thư dạng carcinoma vùng mũi hầu, bệnh tăng sinh tế bào lympho sau ghép (PLTD) Phân họ TT VIRUS CMV (HHV-5) Betaherpesvirinae Bệnh liên quan Bệnh CMV Bệnh ban đào(roseola), bệnh não ghép HHV-6 (Transplant-encephalopathy), bệnh xơ cứng rải rác Gammaherpesvirinae HHV-7 HHV-8 Bệnh ban đào (roseola) Kaposi sarcoma, lymphoma đáy xoang thể, bệnh sarcoid 1.2 Tình hình nhiễm CMV [3], [6], [11], [12], [13], [14], [16], [20], [23], [24], [29],[31], [50], [51], [52], [60], [71], [72] CMV virus có mặt khắp nơi thường gây nhiễm cho nhiều loài sinh vật khác nhau, tác nhân sinh bệnh thường gặp người CMV gây bệnh cho người ghi nhận từ thời cổ đại Người ta tìm thấy dấu vết nhiễm CMV lạc Da Đỏ cổ đại Nam Mỹ (ngày thuộc lãnh thổ Brazin) Tỷ lệ nhiễm CMV tùy thuộc vào vị trí địa lý, tình trạng kinh tế xã hội, yếu tố nuôi dưỡng giáo dục, tỉ lệ nhiễm CMV trung bình giới khoảng 40% Ở Mỹ, từ 50% đến 80% số người lớn 40 tuổi nhiễm CMV, phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ tỉ lệ nhiễm CMV 60-65%, 0,7-4% phụ nữ mang thai nhiễm CMV nguyên phát, nhiễm sang thai nhi 30- 40%, 40% nhiễm bẩm sinh có 10% xuất triệu chứng bệnh CMV, 5-15% số 90% lại sau vài năm có biểu di chứng muộn CMV khiếm khuyết nghe, nhìn chậm phát triển tinh thần CMV gây nhiễm lứa tuổi, nhiên lứa tuổi thiếu niên là độ tuổi thường bị nhiễm nguyên phát, tỉ lệ nhiễm CMV tăng dần theo lứa tuổi Theo thống kê Hoa kỳ với tuổi từ 6-11 tuổi 36,3%, lớn tuổi tỉ lệ nhiễm 58,9%, từ 80 tuổi trở lên tỉ lệ nhiễm 90,8% Nhiễm CMV khác chủng tộc: 51,2% Tây Ban Nha người da trắng, 75,8% Tây Ban Nha người da đen, 81,7% người Mỹ gốc Mexico Mỗi năm Hoa Kỳ khoảng 340.000 người gốc Tây Ban Nha da trắng, 130.000 người gốc Tây Ban Nha da đen, 50.000 phụ nữ Mỹ gốc Mexico bị nhiễm CMV nguyên phát Đối với bệnh nhân AIDS, 40% bị nhiễm CMV, người cấy ghép nội tạng, can thiệp kháng virus biểu triệu chứng nhiễm CMV: 39-41% người ghép tim, phổi; 9-35% người ghép tim; 22-29% người ghép gan tụy; 8-32% người ghép thận; 50% người ghép thận tụy; 22% ghép đoạn ruột Ở miền Nam Việt Nam từ 16 ca ghép thận Chợ Rẫy [3] ghi nhận số liệu bảng 1.2 Bảng 1.2: Tần suất nhiễm CMV 16 ca ghép thận Huyết dương tính Người cho thận Người nhận thận IgG-CMV 12/16 13/16 IgM-CMV 3/16 2/16 Thống kê nhiễm CMV từ năm 2008 đến tháng 04/2010: + Ở bệnh viện Từ Dũ tỉ lệ mẫu xét nghiệm có kháng thể IgG-CMV 94,26% (6013/6379), kháng thể IgM-CMV 3,76% (240/6379) + Ở trung tâm y khoa Medic 88,59% (4896/5526) người xét nghiêm có kháng thể IgGCMV, kháng thể IgM-CMV 9,89% (547/5526) Xét nghiệm DNA-CMV từ 2009 đến tháng 04/2010 kết dương tính 30,61% ca xét nghiệm (30/98) Giá xét nghiệm mẫu máu định lượng CMV kit Roche 750.000đ Việt Nam 1.3 Cấu tạo CMV [6], [14], [51] * CMV (hoặc HCMV) có đặc điểm cấu trúc đặc trưng họ virus Herpes Hạt virion HCMV từ (hình 1.2) gồm: Một gen (genome) phần lõi (core) virus, capsid (khoảng 162 capsomers), chất (tegument) chứa enzymes, màng bọc (envelope hay membrane) glycoprotein Hình 1.2: Một virion HCMV (Human Cytomegalovirus) “Nguồn :www,abbottdiagnostics,com/science, www,who,int/publications ” 1.3.1 Bộ gen CMV (hình 1.3, 1.4) phân tử DNA sợi đôi mạch thẳng, dài 64 nm, chia làm hai cấu phần “duy nhất” (unique), cấu phần dài UL (unique long), cấu phần ngắn US (unique short) Ở hai đầu vùng trình tự vùng trình tự lặp lại đầu cuối TR (terminalrepeat sequence) vùng trình tự đảo ngược IR (inverted repeat sequence) Vùng UL gen virus vùng mang gen mã hóa cho protein quan trọng cần thiết cho xâm nhập chép virus UL55 mã hóa cho glycoprtein B màng bọc ngoài, UL123 mã hóa cho protein IE, gen CMV có vùng xác định tương đồng với số vùng DNA người [6] Đây gen có kích thước lớn họ virus Herpesviridae, xấp xỉ 230240Kb (hình 1.3) Có khoảng 31% - 75% Guanin+ Cytocine Với gen > 240.000bp, có tiềm mã hoá protein cho 200 khung đọc mở (opening reading frames) có khả tổng hợp khoảng 100 protein virus Hiện nay, xác định vài protein từ gen virus Có đoạn gen mã hoá quan trọng cần cho chép virus, có đoạn gen không thiết yếu, lại sản sinh yếu tố lây truyền từ tế bào sang tế bào khác Hình 1.3: Minh họa gen số loài Herpesvirus “Nguồn:http://cmbi,bjmu,edu,cn/www-learn/micro-ac uk/335/HHV5,html” Hình1.4: Mô tả cấu trúc chi tiết gen CMV “Nguồn:http://www,nist,gov/cstl/biochemical/genetics/cmv_structure,cfm” Ghi chú: Những mũi tên màu xanh thích trước khung đọc mở HCMV có khả mã hóa polypeptide, mũi tên màu đỏ định khung đọc mở không mã hóa polypeptide 1.3.2 Bộ khung nucleocapsid (hình 1.5) - Bảo vệ gen virus - Bộ khung capsid có hình dáng hình đa diện 20 mặt, cấu tạo non- phosphorylated proteins, ví dụ: p70, khung capsid có đường kính khoảng 116nm gồm 162 capsomers - Mỗi capsomere có đường kính khoảng 15nm, dài 20nm, có rãnh trung tâm có d=3nm Trên bề mặt capsomere có nhiều cấu trúc nhô cách đối xứng hình dáng tua tủa nan hoa Những cấu trúc cho tác dụng nối kết capsomere với Hình 1.5: Capsid herpes virus “nguồn: Linda Stannard” 1.3.3 Tegument (hình 1.6) chất (matrix) lấp đầy khoảng trống nucleocapsid vỏ bọc bên (envelope), có chất phosphorylate proteins Trong glycoprotein pp65, glycoprotein quan trọng chiếm tỷ lệ lớn Các kháng thể phản ứng với protein cho thấy có hoạt động trung hòa virus mạnh có diện bổ thể phản ứng mạnh với bề mặt tế bào bị nhiễm Đáp ứng kháng thể người glycoprotein pp65 chưa nghiên cứu Xét nghiệm tìm kháng nguyên glycoprotein pp65 máu phương pháp để phát CMV đóng vai trò quan trọng việc chẩn đoán glycoprotein envelope chất nucleocapsid Hình1.6: Chất matrix, màng bọc “Nguồn: http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/herpes,html” 1.3.4 Màng bọc virus (envelope) (hình 1.6) - Là lớp lipit kép gồm lipoprotein có 33 protein cấu trúc, vài protein cấu trúc glycoprotein (glycosylate) - Những phân tử glycoprotein nằm bề mặt có phần lồi Phần lồi giúp cho virus gắn vào thụ thể xâm nhập vào tế bào đích túc chủ mục tiêu cho kháng thể trung hoà virus Các glycoprotein định dòng CMV khác Các glycoprotein biết rõ lớp vỏ gp 116, gp58, gp86 - Một phát cho thấy glycoprotein vỏ bọc virus có vai trò tạo đáp ứng miễn dịch thể, số khác góp phần làm giảm đáp ứng miễn dịch tế bào túc chủ cách giới hạn trình diện kháng nguyên virus 1.4 Đặc điểm virus [9] 1.4.1 Tính bền vững CMV virus không bền vững, dễ bị bất hoạt yếu tố : dung môi lipit, pH[...]... nay, PCR được dùng rất phổ biến trong lĩnh vực sinh học PCR cho phép chẩn đoán nhanh nhiễm CMV, nhưng nếu kết quả dương tính cũng không cho ta xác định được là virus mới nhiễm hay là nhiễm tiềm ẩn Real- Time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dùng để định lượng có thể xác định chính xác số lượng của CMV trong cơ thể, thậm chí ở những vị trí đặc hiệu Kỹ thuật PCR có thể phát hiện được CMV-DNA trong. .. mạn - Giảm chất lượng sống, tăng chi phí điều trị 1.5 Quá trình xâm nhập của CMV vào tế bào [6], [14], [51], [72] 1.5.1 Đường lây truyền  Lây truyền CMV có thể xảy ra từ người này sang người khác, thông qua các sự tiếp xúc với dịch thể nhiễm CMV (nước tiểu, nước bọt, sữa mẹ, máu, nước mắt, tinh dịch, dịch tiết âm đạo v,v…) chẳng hạn như hôn, quan hệ tình dục, và dính nước bọt hay nước tiểu nhiễm CMV... tuần), 1.9.5 Xét nghiệm tìm kháng nguyên trong máu (antigenemia assay) Là phương pháp tiến bộ đáng kể trong chẩn đoán nhiễm CMV ở những người được ghép tạng Các tế bào nhiễm CMV được xác định bằng các kháng thể đơn dòng kháng lại các protein đặc hiệu của virus (ví dụ pp65) Đây là kỹ thuật đặc hiệu, độ nhạy cao và thông dụng nhất trong việc xác định nhiễm virus trong máu 1.9.6 Kỹ thuật lai tại chỗ (in... gan, lách, não, võng mạc, thực quản, tai trong, phổi và đại tràng, cũng như nước tiểu và tuyến nước bọt 1.6 Sự né tránh miễn dịch của CMV [6], [14] Sự tương tác giữa đáp ứng miễn dịch của túc chủ và quá trình sao chép của virus quy t định khả năng gây bệnh khi nhiễm CMV, CMV có đặc tính sống âm ỉ và kéo dài Trong giai đoạn sống tiềm ẩn virus không nhân lên trong tế bào túc chủ Đối với nhiễm CMV mạn... những vị trí đặc hiệu Kỹ thuật PCR có thể phát hiện được CMV-DNA trong bạch cầu ở máu ngoại vi và toàn bộ máu cũng như CMV-RNA trong bạch cầu Mặc dù CMV kết hợp với tế bào, CMV-DNA cũng có thể được phát hiện trong các dịch tự do của cơ thể Định lượng PCR là một phương pháp tốt nhất trong việc chẩn đoán CMV hiện nay ... virus bắt đầu Những tiểu thể của virus được tạo ra và sau đó được tập hợp lại trong nhân Vỏ bọc của virus được tạo ra bằng cách nhô ra khỏi màng nhân bên trong của tế bào chủ Từ đó, những tiểu thể này đi qua màng lưới Golgi và bắt đầu gây bệnh bằng cách phân tách, ly giải tạo glycoprotein B (gB), gB là sản phẩm gen UL55 của CMV và là glycoprotein vỏ của HCMV là nổi bật nhất Hình 1.7: Chu trình sao chép... viêm dạ dày ruột do CMV Kỹ thuật thực hiện còn cồng kềnh 1.9.7 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) xác định DNA của virus PCR (polymerase chain reaction – phản ứng trùng hợp chuỗi): năm 1985, Kary B, Mullis cùng các cộng sự đã phát minh ra phương pháp PCR Đây là một kĩ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ... virus gây bệnh cho tế bào, có nghĩa là tế bào bị nhiễm cuối cùng sẽ bị phá hủy, - CMV sống tiềm ẩn trong các dịch sinh học và các mô khác nhau của cơ thể như: nước bọt, nước tiểu, tinh dịch, sữa mẹ, phân, máu, chất tiết âm đạo và cổ tử cung, trong bạch cầu đa nhân trung tính, lympho bào T, tế bào nội mô mạch máu, biểu mô ở thận, CMV ở trạng thái thụ động, không tăng trưởng Khi có điều kiện thuận lợi hoặc... endothelial cell - CEC) Các tế bào được xác định bằng cách ly tâm phần tế bào đơn nhân của bạch cầu trên lam thủy tinh sau khi nhuộm đặc hiệu tế bào nội mô Đối với người nhận tạng, CEC không thấy trong những trường hợp được điều trị dự phòng hoặc điều trị trước Trong tương lai, xét nghiệm này trong lĩnh vực ghép tạng sẽ được áp dụng rộng rãi 1.9.4 Phân lập virus Là phương pháp thông thường và cổ điển nhất cho... polymerase và sao chép đảo ngược DNA của virus 1.9 Một số phương pháp chẩn đoán [6], [14] 1.9.1 Huyết thanh chẩn đoán tìm kháng thể kháng CMV Bao gồm các xét nghiệm tìm kháng thể kháng CMV trong máu của bệnh nhân là IgM-CMV, IgG-CMV Xét nghiệm miễn dịch men (enzym immuno assay) phát hiện kháng thể IgG, IgM đặc hiệu giúp xác định tình trạng nhiễm CMV Phương pháp sử dụng chủ yếu là ELISA 1.9.2 Giải phẫu bệnh