Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 5 pdf

39 39 - Qui trình 3: Phương pháp biến đổi. Bảng 3.2: Các quy trình ly trích Quy trình Bƣớc 1 2 3 1. Phá vỡ màng tế bào, màng nhân. - Đồng nhất mẫu. - Bổ sung 1,2 ml đệm trích 1. - Ủ 45 phút ở 65 o C. - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút, thu dịch nổi. - Đồng nhất mẫu. - Bổ sung 300 µl nước cất và 500 µl đệm trích CTAB 2%. - Ủ 45 phút ở 65 o C. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Đồng nhất mẫu. - Bổ sung 1,2 ml đệm trích CTAB 2%. - Ủ 45 phút ở 65 o C. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. 2. Loại bỏ thành phần không mong muốn. - Bổ sung 1 lần thể tích phenol, đảo nhẹ. - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 1 lần thể tích phenol/chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 500 µl chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 500 µl chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 1 lần thể tích phenol/chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. 3.Tủa DNA - Bổ sung 0,1 lần thể tích dung dịch potassium acetate 3M và 2,5 lần thể tích ethanol tuyệt đối. - Bổ sung 2 lần dung dịch CTAB tủa. - Ủ 60 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm16000 - Bổ sung 2 lần dung dịch CTAB tủa. - Ủ 60 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 16000 40 40 - Ủ qua đêm ở nhiệt độ -20 o C. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4 o C, thu tủa. vòng/phút trong 10 phút, thu tủa. - Hòa tủa trong 350 µl NaCl 1,2M. - Bổ sung 350 µl chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa. - Bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol. - Ủ 30 phút hay qua đêm ở - 20 o C. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa. vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Hòa tan tủa trong 350 µl NaCl 1,2M. - Bổ sung 350 µl phenol/chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol. - Ủ 30 phút hay qua đêm ở - 20 o C. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, thu tủa. 4.Rửa DNA - Bổ sung 500 µl dung dịch ethanol 70%. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4 o C, thu tủa. - Để khô DNA. - Hòa tan tủa bằng 100 µl nước cất siêu sạch. - Bổ sung 2 µl RNase, ủ 1 giờ ở 37 o C. - Bảo quản DNA ở -20 o C - Bổ sung 500 µl dung dịch ethanol 70%. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4 o C, thu tủa. - Để khô DNA. - Hòa tan tủa bằng 30 µl nước cất siêu sạch. - Bổ sung 2 µl RNase, ủ 1 giờ ở 37 o C - Bảo quản DNA ở -20 o C - Bổ sung 500 µl dung dịch ethanol 70%. - Ly tâm 16000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4 o C, thu tủa. - Để khô DNA. - Hòa tan bằng 30 µl nước cất siêu sạch. - Bổ sung 2 µl RNase, ủ 1 giờ ở 37 o C - Bảo quản DNA ở -20 o C 41 41 Phƣơng pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích DNA thu được từ quy trình ly trích được phân tích dựa trên các chỉ tiêu: - Độ tinh sạch của DNA: Đo độ hấp thu ánh sáng của mẫu ở bước sóng 260 nm (OD 260nm ) và 280 nm (OD 280nm ). Tính tỷ lệ OD 260nm /OD 280nm để xác định độ tinh sạch của mẫu. DNA thu được tinh sạch khi tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. - Lượng DNA: Từ chỉ số OD 260nm của các mẫu tinh sạch có thể suy ra nồng độ DNA trong mẫu theo tương quan: 1 đơn vị OD 260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 ng/µl DNA mạch đôi trong dung dịch - Độ nguyên vẹn của mẫu DNA: Điện di sản phẩm ly trích trên gel agarose và so sánh các kết quả trên bảng điện di. Mẫu DNA có độ nguyên vẹn cao khi bảng điện di xuất hiện một vạch sáng rõ với kích thước lớn. Kết quả thí nghiệm là chúng tôi xác định được một quy trình ly trích tốt nhất phục vụ cho ly trích DNA các mẫu thí nghiệm. 6. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu Phát hiện được mẫu sản phẩm biến đổi gen thông qua promoter 35S (123 bp) bằng 2 phương pháp: PCR thông thường (đang được sử dụng) và phương pháp Real- Time PCR (đề nghị). Đánh giá khả năng sử dụng phương pháp Real-Time PCR ở giai đoạn sàng lọc mẫu so với phương pháp thông thường. Nguyên tắc Vùng promoter 35S được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3/cr4 [33] . Sau đó, sản phẩm khuếch đại sẽ được phát hiện và phân tích. Sản phẩm khuếch đại vùng promoter 35S sẽ có đặc điểm như sau [33]: - Kích thước: 123 bp - Nhiệt độ nóng chảy: 86,5 o C Thí nghiệm được tiến hành theo 2 phương pháp: - Phương pháp 1: PCR truyền thống (đang được sử dụng rộng rãi). Sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose. 42 42 - Phương pháp 2: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I (đề nghị). Sản phẩm được kiểm tra bằng phân tích Melt curve. Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Công ty Proligo) [31] p35S-cf3 p35S-cr4 Trình tự 3‟ - CCACGTCTTCAAAGCA AGTGG - 5‟ 3‟ - TCCTCTCCAAATGAAAT GAACTTCC - 5‟ Chiều dài 21 25 Trọng lượng phân tử (g/mol) 6414,5 7544,2 Nhiệt độ nóng chảy (G/C) 57,4 56,3 Vật liệu thí nghiệm - Đối chứng dương: Bắp chuyển gen Bt 176 1% cấp bởi GeneScan (Đức) - Đối chứng âm: Nước cất siêu sạch - Các mẫu có kết quả ly trích DNA đạt chất lượng tốt bằng quy trình ly trích đề nghị ở thí nghiệm 1. Trang thiết bị Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2 Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp 2 - Máy luân nhiệt TECHNE TC-312. - Bộ điện di - Máy chiếu tia UV - Hệ thống Real-Time PCR iCycler MyiQ TM (Bio-Rad) - Máy vi tính - Phần mềm điều khiển MyiQ (Bio-Rad) 43 43 Phƣơng pháp thực hiện Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR Thành phần một phản ứng PCR trong ống eppendorf 0,2 ml như sau Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2 Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp 2 Thành phần Nồng độ cuối Thành phần Nồng độ cuối - PCR buffer 10X - MgCl 2 50 mM - dNTPs 2mM - Mồi xuôi - Mồi ngược - Taq polymerase 5U/µl - DNA mẫu - Nước cất siêu sạch 1X 2 mM 0,2 mM 0,5 µM 0,5 µM 1,0 U 10 - 50 ng - SYBR Green Supermix Sample 2X - Mồi xuôi - Mồi ngược - DNA mẫu - Nước cất siêu sạch 1X 0,5 µM 0,5 µM 10 - 50 ng Tổng thể tích 25 μl Tổng thể tích 25 μl Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại Bảng 3.6: Chƣơng trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2 Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Biến tính ban đầu 95 o C 3 phút Biến tính Bắt cặp Kéo dài Số chu kỳ 95 o C 62 o C 72 o C 50 25 giây 30 giây 45 giây Kéo dài cuối cùng 72 o C 4 o C 7 phút 44 44 Phát hiện sản phẩm khuếch đại Bảng 3.7: Phƣơng pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2 Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp 2 Điện di trên gel agarose 2% với thang 100 bp Molecular Ruler (Bio-Rad) Nguyên tắc: Khác biệt kích thước sản phẩm khuếch đại Phân tích Melt curve Nguyên tắc: Khác biệt nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại Phương pháp 1: Điện di trên gel agarose - Chuẩn bị gel agarose 2%. - Bơm sản phẩm PCR vào giếng với đối chứng dương, âm và thang 100 bp Molecular Ruler. - Điện di 100V trong 25 phút. - Ngâm bản gel trong dung dịch TAE 1X có chứa ethidium bromide (nồng độ 0,01 mg/ml) trong 15 phút. - Soi dưới đèn UV và đọc kết quả bằng mắt thường. Phương pháp 2: Phân tích Melt curve Bước này được thiết lập trên máy vi tính cùng với chương trình chạy PCR và tự động thực hiện ngay sau khi phản ứng khuếch đại DNA hoàn tất. Sản phẩm khuếch đại được nung biến tính từ từ. Tín hiệu huỳnh quang thu nhận sẽ được máy tính phân tích. Chương trình nhiệt được thiết lập như sau: Bảng 3.8: Chƣơng trình nhiệt phân tích Melt curve Nhiệt độ ban đầu Nhiệt độ cuối Nhiệt độ tăng mỗi chu kỳ Thời gian mỗi chu kỳ Số chu kỳ 55 o C 95 o C 0,5 o C 10 giây 80 45 45 Phân tích kết quả Phương pháp 1 : Điện di trên gel agarose Sản phẩm được so sánh với thang chuẩn và các mẫu đối chứng dương, đối chứng âm nhằm xác định chính xác vạch khuếch đại đặc hiệu của vùng promoter 35S (123bp). Phương pháp 2: Phân tích Melt curve - Kết quả thí nghiệm được hiển thị ở mục Data Analysis. - Phân tích kết quả trên màn hình DNA Quantification (2 chế độ Normal View, Log View). - Mục Melt Curve: Phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR , các chỉ tiêu phân tích gồm có: Phân tích các đỉnh nhiệt độ nóng chảy trên biểu đồ –dF/dT so với nhiệt độ (-dF/dT vs Temperature) Xác định sự hiện diện của đỉnh nhiệt độ nóng chảy ở 86,5 o C tương ứng với đoạn khuếch đại đặc hiệu vùng promoter 35S. Hình 3.1: Màn hình Melt Curve Kết quả thí nghiệm 2 giúp chúng tôi so sánh hiệu quả của 2 phương pháp sáng lọc sản phẩm biến đổi gen hiện nay, đó là phương pháp PCR truyền thống và phương pháp Real-Time PCR và đề nghị một phương pháp cho quy trình sàng lọc các sản phẩm biến đổi gen 46 46 7. Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu So sánh phương pháp định lượng promoter 35S bằng kỹ thuật Real-time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I và với mẫu dò Taqman. Xác định độ chính xác của 2 phương pháp ở các lần lặp lại và nồng độ pha loãng khác nhau. Xác định khả năng ứng dụng của 2 phương pháp này. Nguyên tắc Vùng promoter 35S của mẫu thí nghiệm được khuếch đại đặc hiệu. Tín hiệu huỳnh quang của mẫu (từ thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dò Taqman) sẽ được máy thu nhận và phân tích. Thí nghiệm được tiến hành theo 2 phương pháp: - Phương pháp 1: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I và mồi đặc hiệu được sử dụng từ thí nghiệm 2 [31]. - Phương pháp 2: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman và mồi đặc hiệu được tổng hợp thành bộ kit của công ty GeneScan. Vật liệu thí nghiệm - Đối chứng dương: bắp chuyển gen Bt 176 1% (GeneScan, Đức). - Đối chứng âm: Nước cất siêu sạch. - Chuẩn 35S của công ty GeneScan. Số lượng các chuẩn này đã được biết trước. Đơn vị tính là số lượng copy (copy number). 1 copy number tương đương với số lượng một gen đích trong mẫu thí nghiệm. Trang thiết bị - Máy My iQ TM Single Color Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) - Máy vi tính - Phần mềm điều khiển MyiQ (Bio-Rad). Phƣơng pháp thực hiện Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thiết kế như sau: 47 47 - 3 thí nghiệm với mẫu là 3 chuẩn 35S. Mục đích là dựng đường chuẩn định lượng promoter 35S. - 1 thí nghiệm với đối chứng âm: nước siêu sạch. - Các thí nghiệm với mẫu. Nhằm so sánh 2 phương pháp định lượng, chúng tôi quyết định thí nghiệm các vấn đề sau: Xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng p35S Đường chuẩn định lượng có vai trò quuyết định trong việc định lượng DNA. Nó được xây dựng dựa trên các mẫu chuẩn đã biết trước. Từ kết quả thí nghiệm nhận được, các mẫu chưa biết sẽ được so với đường chuẩn để tính toán ra kết quả định lượng. Vì vậy trong thí nghiệm này, chúng tôi thử nghiệm khả năng xây dựng đường chuẩn của phương pháp Real-Time PCR với 2 loại hóa chất định lượng khác nhau (SYBR Green I và mẫu dò đặc hiệu Taqman). Các chuẩn là chuẩn 35S của công ty GeneScan. Do điều kiện thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 3 chuẩn của công ty GeneScan như sau Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29] Chuẩn Lƣợng lý thuyết (số lƣợng phân tử) (copy) Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3 5120 640 80 Kết quả thí nghiệm sẽ được so sánh trên hệ số tương quan (Correlation coefficient), hiệu quả PCR (PCR Efficiency), chu kỳ phát hiện các mẫu chuẩn, sự xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu. Phương pháp tốt sẽ phải có hệ số tương quan (Correlation coefficient) >0,98 , hiệu quả PCR (PCR Efficiency) từ 90-120 %, chu kỳ phát hiện các mẫu chuẩn phải tỷ lệ với nhau và không xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu. 48 48 Đánh giá kết quả định lƣợng Do 2 phương pháp sử dụng hóa chất định lượng khác nhau nên phương pháp thu nhận tín hiệu huỳnh quang sẽ khác nhau. Nếu SYBR Green I định lượng bằng cách thu nhận tín hiệu huỳnh quang từ tất cả DNA mạch đôi hiện diện trong sản phẩm, thì Taqman chỉ thu nhận thu nhận tín hiệu huỳnh quang từ những mẫu bắt cặp đặc hiệu với mồi. Điều này có thể dẫn đến kết quả định lượng từ 2 phương pháp sẽ có sai lệch nhất định. Như vậy, nhằm đánh giá kết quả định lượng của 2 phương pháp, sự sai lệch có thể có trong kết quả, chúng tôi quyết định định lượng mẫu có số lượng lý thuyết là 1 copy gen đích trong mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với các mẫu trên. Kết quả sẽ được so sánh dựa trên chu kỳ phát hiện, kết quả định lượng thực tế so với số lượng lý thuyết. Phương pháp tốt hơn sẽ phải có kết quả định lượng gần với số lượng lý thuyết nhất và có độ lệch qua các lần lặp lại thấp. Kết quả của thí nghiệm này giúp chúng tôi so sánh được hiệu quả của phương pháp Real-Time PCR với 2 hóa chất định lượng khác nhau. Phương pháp này với hóa chất định lượng đề nghị sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm về sau. Thành phần phản ứng PCR Thành phần một phản ứng PCR trong ống eppendorf 0,2 ml như sau: Bảng 3.10: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 3 Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp 2 Thành phần Nồng độ cuối Thành phần Nồng độ cuối - SYBR Green Supermix Sample 2X (Bio-rad) - Mồi xuôi - Mồi ngược - DNA mẫu - Nước cất siêu sạch 1X 0,5 µM 0,5 µM 50 ng - 35S master mix (GMO Quant 35S Screen Corn Kit) (GeneScan) - DNA mẫu - Nước cất siêu sạch 1X 50 ng Tổng thể tích 25 μl Tổng thể tích 25 μl [...]... chứa tất cả các thành phần cần thiết cho phản ứng phát hiện và định lượng DNA Chƣơng trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR Bảng 3.1 1: Chƣơng trình nhiệt của 2 phƣơng pháp Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp Nhiệt độ Phƣơng pháp 2 Đọc tín gian Giai Thời Nhiệt độ hiệu Thời Đọc tín gian hiệu huỳnh Giai đoạn 1 huỳnh quang đoạn quang 95oC 3 phút 95oC 10 phút Giai đoạn 2 - Bƣớc 1 95oC 25 giây 95oC 15 giây - Bƣớc...49 Đặc điểm 35S master mix Các master mix này được dùng cho các phản ứng định lượng bắp chuyển gen có chứa promoter 35S trong thực phẩm 35S master mix chứa các thành phần cần thiết cho việc phát hiện đặc hiệu trình tự promoter CaMV 35S hiện diện trong một số giống bắp chuyển gen phổ biến hiện nay Hệ thống này sử dụng mẫu dò (probe) có gắn chất phát... nghiệm - Đọc và phân tích kết quả thí nghiệm bằng cách nhấn mục Data Analysis ở phía trái màn hình Hình 3. 2: Màn hình Edit Protocol 50 51 Hình 3. 3: Màn hình Edit Plate Setup Hình 3. 4: Màn hình View Quantities/Identifiers Phân tích kết quả thí nghiệm Các kết quả thí nghiệm được phân tích trên màn hình phần mềm MyiQ Các bước phân tích được tiến hành như sau: 51 ... protocol: Thiết lập các thông số của chương trình nhiệt Ta cũng có thể gọi một chương trình nhiệt cũ đã chạy từ mục Library - Chọn mục Edit Plate Setup: Cài đặt các thông số của mẫu thí nghiệm - Kiểm tra tên và thông số của mẫu Đặt các eppendorf vào đúng vị trí đã thiết lập - Nhấn “Run with selected protocol” để khởi động chương trình Xác định thể tích mẫu thí nghiệm - Đọc và phân tích kết quả thí nghiệm bằng. .. 45 giây Số chu kỳ 50 Giai đoạn 3 72oC x 45 4oC 7 phút 4oC 49 x 50 Cài đặt phần mềm điều khiển Phần mềm điều khiển được cung cấp bởi công ty Bio-Rad Sau khi cài đặt, ta có thể khởi động chương trình và điều khiển sự hoạt động của máy từ máy vi tính Các bước tiến hành thiết lập một chương trình hoạt động như sau: - Khởi động máy và đèn đọc tín hiệu Máy cần được làm nóng khoảng 30 phút trước khi bắt đầu . sáng lọc sản phẩm biến đổi gen hiện nay, đó là phương pháp PCR truyền thống và phương pháp Real-Time PCR và đề nghị một phương pháp cho quy trình sàng lọc các sản phẩm biến đổi gen 46 46. 46 46 7. Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu So sánh phương pháp định lượng promoter 35S bằng kỹ thuật Real-time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green. xác định được một quy trình ly trích tốt nhất phục vụ cho ly trích DNA các mẫu thí nghiệm. 6. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu Phát hiện được mẫu sản phẩm biến đổi gen