49 chất, chỉ thu đƣợc toàn plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hoá chất sử dụng đơn giản. Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2). (DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3). (DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở 100V trong 30 phút. Qua 3 lần tách chiết, chúng tôi đã hoàn thiện đƣợc quy trình tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coly biến nạp, kết quả tách chiết không còn lẫn DNA genome và các tạp DC 1 2 3 4 5 1 2 DC 3 4 5 DNA plasmid 3.0kb DNA plasmid 3.0kb 50 chất khác. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzym cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid : Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen. Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới. 4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel agarose 0.8%. (EcoRV) sản phẩm cắt bằng enzym EcoRV của plasmid tách chiết từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 :0.5 (lần 1), (DC1) plasmid gốc (chưa biến nạp), (DC2, DC3) plasmid đối chứng từ sản phẩm tách chiết. Kết quả trên hình cho thấy plasmid đã đƣợc cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kých của plasmid đối chứng, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS. Từ dạng thẳng này chúng ta có thể thực hiện phản ứng khử phosphoril ở hai đầu để duy trì sự ổn định của plasmid nhằm thực hiện phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid. 4.5 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid đã cắt bằng enzym EcoRV 4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA Trong đề tài này, chúng tôi thực hiiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng (blunt end) cho đoạn DNA DC TS TS DC EcoRV DC1 DC2 DC3 DNA plasmid 3.0kb 51 sau đó tinh sạch. kết quả tinh sạch đoạn DNA bằng 2 phƣơng pháp đƣợc thể hiện ở Hình 4.13 và Hình 4.14 Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX. Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX. . Kết quả điện di (hình 4.13) cho thấy quá trình tinh sạch đã loại đƣợc hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel. Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzym Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể đƣợc kiểm tra khi đã chèn vào plasmid (đã đƣợc cắt tạo đầu bằng) và biến nạp vào vi khuẩn. Kết quả diện di (hình 4.14) cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch không còn band phụ, tuy nhiên trong lúc kiểm tra kết quả tinh sạch cần chú ý chạy thêm đối chứng để 1 (DC) đoạn DNA đối chứng kích thước 629bp từ sản phẩm PCR chưa tinh sạch, (TS) đoạn DNA kích thước 629bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. (1) đoạn DNA kích thước 580bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch bằng phương pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX DC TS TS DC 52 đối chiếu, ở thí nghiệm này chúng tôi đã không chú ý đến điều này, đây là một thiếu sót của chúng tôi. Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60 o C agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar). Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer. 4.5.2 Tinh sạch plasmid Plasmid sau khi dùng enzym cắt mở vòng mới tinh sạch. Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX. Kết quả điện di cho thấy sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm của phản ứng cắt. Từ sản phẩm tinh sạch này chúng tôi tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối. 4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp Thực hiện phản ứng blunt-end sản phẩm PCR, tinh sạch sản phẩm của phản ứng blunt-end, và nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid ta đƣợc plasmid tái tổ hợp. Biến nạp các plasmid tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp, thu đƣợc kết quả nhƣ sau DC1 DC2 TS (DC1) mẫu plasmid cắt bằng enzym EcoRV chưa tinh sạch, (DC2) mẫu plasmid cắt bằng enzym HindIII chưa tinh sạch, (TS) mẫu plasmid cắt bằng EcoRV được tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. 53 Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG. (a) Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(b) một phần của hình ( a) được phóng to. Hình 4.17 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp trên môi trƣờng LB/amp/ X-gal/IPTG. (a)Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợpvới đoạn DNA 580bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(b) một phần của hình a được phóng to. a b a b 54 Với đoạn DNA có kých thƣớc 629bp, chỉ có 6 khuẩn lạc trắng trong tổng số 68 khuẩn lạc, các khuẩn lạc xanh là do sự tái đóng vòng của plasmid, các khuẩn lạc trắng có thể là do các tế bào mang plasmid tái tổ hợp. để khẳng định, chúng tôi tiến hành cấy chuyền, chiết tách plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thựic hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers T3, T7. Với đoạn DNA có kých thƣớc 580bp, kết quả cho 4 khuẩn lạc trắng trong tổng số 108 khuẩn lạc, để kiểm tra các khuẩn lạc trắng này chúng tôi thực hiện cấy chuyền, tách chiết plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thực hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers ITS4, ITS5. 4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp Chọn lọc những khuẩn lạc trắng từ hình 4.15 cấy sang môi trƣờng LB lỏng/Amp nhân sinh khối qua đêm và tiến hành tách chiết theo quy trình 3.3.7 Hình 4.18 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp. (1.1), (1.2), (1.3), (1.4), (1.5), (1.6) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Theo kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết mẫu số 1.5 nằm cao hơn các mẩu plasmid khác nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III các mẫu số 1.2, 1.4, 1.5. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4 Kích thƣớc dự đoán 3.0kb Kích thƣớc dự đoán 3.629kb 55 Hình 4.19 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. (2.1) ,(2.2),( 2.3),( 2.4) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết chỉ thu đƣợc hai mẫu có mang plasmid, mẫu số 2.1 nằm cao hơn mẫu 2.3 nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III mẫu số 2.1 và chạy kiểm tra với plasmid đối chứng. 4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp Sản phẩm tách chiết plasmid các mẫu biến nạp đƣợc cắt với hai enzym là BamHI và HindIII. Hai enzym này có trình tự nhận biết nằm ngoài trình tự nhận biết của enzym EcoRV, do đó khi cắt mẫu plasmid tái tổ hợp sẽ tạo dạng thẳng mang cả đoạn DNA đƣợc chèn vào theo đúng sơ đồ cắt trong vùng MCS. Kích thƣớc dự đoán 3.58kb Kích thƣớc dự đoán 3.0kb 56 Hình 4.20 Sản phẩm cắt plasmid tách chiết mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp và mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. (DCB) plasmid đối chứng cắt với enzym BamHI, (DCH) plasmid đối chứng cắt với enzym HindIII, (2.1B-1.4B) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym BamHI, (2.1H-1.4H) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym HindIII. Cắt bằng BamHI mẫu số 1.5, 2.1 khi chạy điện di các band cao hơn band mẫu đối chứng, mẫu số 1.2, 1.4 có band bằng với band của mẫu đối chứng. Cắt bằng HindIII mẫu số 2.1 khi chạy điện di band cao hơn band mẫu đối chứng, các mẫu còn lại có các band bằng với band của mẫu đối chứng. Nhƣng mẫu số 1.5 còn có thêm 1 band mờ nằm ở dƣới, có thể đoạn DNA đƣợc chèn ở mẫu số 1.5 có chứa site cắt của HindIII. Qua kết quả kiểm tra bằng men cắt chúng tôi có thể khẳng định đã chọn lọc đƣợc thể tái tổ hợp. 4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR Tiến hành chạy PCR kiểm tra mẫu số 7 với primer của đoạn DNA đó, kiểm tra mẫu số 9 với cặp primer T3, T7. DCB 2.1B 1.5B 1.2B 1.5B 1.4B 2.1H 1.5H 1.2H 1.5H 1.4H DCH . hoàn thiện đƣợc quy trình tách chiết plasmid từ vi khuẩn E. coly biến nạp, kết quả tách chiết không còn lẫn DNA genome và các tạp DC 1 2 3 4 5 1 2 DC 3 4 5 DNA plasmid 3.0kb DNA plasmid 3.0kb. tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc. plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. (2.1) ,(2.2),( 2.3),( 2.4) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp, điện di trên gel agarose 0.8%,