Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 6 doc

41 Biểu đồ 4. 1 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD 600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc cất. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. Theo đƣờng tƣơng quan này chúng tôi nhận thấy mối tƣơng quan giữa hai giá trị khảo sát tƣơng đối chặt. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) mật số tế bào là 10 8 /ml tƣơng ứng với giá trị OD là 0.145-0.45, nhƣng theo chúng tôi để đạt đƣợc 10 8 tế bào/ml thì giá trị OD phải là 1.5-1.8. với so sánh này chúng tôi nghi ngờ đã có một lƣợng lớn tế bào bị chết khi pha loãng bằng nƣớc cất. Chúng tôi tiến hành lặp lại thí nghiệm, sử dụng nƣớc muối sinh lý để pha loãng. Biểu đồ 4.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD 600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc muối sinh lý. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. 42 Dựa vào đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật số tế bào ta thấy để đạt đƣợc mật số tế bào từ 5 x 10 7 – 10 8 tế bào/ ml thì ta nên chọn dịch nuôi cấy có giá trị OD từ 0.6 – 1, kết quả này khác biệt rất nhiều so với lần thí nghiệm thứ 1. Điều đó cho thấy khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lí cho kết quả chính xác hơn khi pha loãng bằng nƣớc cất. So sánh giữa pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý và pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng có sự khác biệt rất lớn. Pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng số tế bào đếm đƣợc sẽ ít hơn khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý dù chúng có giá tri OD tƣơng đƣơng nhau. Kết quả này cho thấy khi dùng nƣớc cất vô trùng pha loãng sẽ có một số tế bào bị chết. Vì vậy, khi cần sự chính xác thì phải sử dung nƣớc muối sinh lý để pha loãng. Và khi so sánh kết quả này với nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) vẫn có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này do nhiều nguyên nhân. Trong đó có hai nguyên nhân chính là chủng vi khuẩn và thiết bị đo OD. Những điều cần lƣu ý Do phải hút dịch vi khuẩn đang nuôi cấy để đo OD nhiều lần nên dịch nuôi cấy rất dễ bị nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài, phải cẩn thận khi thao tác. Mật độ tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các yếu tố sau Thể tích môi trƣờng nuôi cấy Lƣợng tế bào vi khuẩn cho vào ban đầu Nhiệt độ nuôi cấy Tốc độ của máy lắc Vì vậy mặc dù mỗi lần xác định giá trị OD đều có các mốc thời điểm cụ thể, nhƣng không thể áp dụng các mốc thời điểm này để chuẩn bị khả nạp mà không cần xác định giá trị OD. 43 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây. (a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C. . b a c DC 44 Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây. (a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X- gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C. Kết quả biến nạp trong 90 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên hình 4.3. Với kết quả biến nạp này cho thấy có một lƣợng khả nạp tiếp nhận đƣợc plasmid và thể hiện đƣợc đặc tính chọn lọc trên môi a b c DC 45 trƣờng LB/Amp/X-gal/IPTG, nhƣ vậy tế bào khả nạp đƣợc chuẩn bị có khả năng tiếp nhận plasmid. Tuy nhiên, việc xuất hiện khuẩn lạc trắng với mật độ rất cao ở các đĩa biến nạp và cả đĩa đối chứng không cho phép xác định đƣợc tỉ lệ biến nạp nào là thích hợp, đồng thời cho phép khẳng định nồng độ kháng sinh 60µg/ ml không đủ để chọn lọc thể biến nạp Biến nạp trong 60 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên Hình 4.4. Kết quả này tƣơng tự với kết quả biến nạp trong 90 giây. Nhƣ vậy, trong các quy trình biến nạp trên không có sự khác biệt lớn về nồng độ plasmid và mật độ vi khuẩn, cũng không có sự khác biệt lớn về thời gian biến nạp. Vì vậy, ở các lần biến nạp sau chúng tôi chọn sốc nhiệt trong 60 giây. Mặc khác, ở đĩa đối chứng mọc rất nhiều khuẩn lạc nhƣng chỉ toàn là khuẩn lạc trắng, còn ở các đĩa có trang vi khuẩn biến nạp thì có cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Điều này chứng tỏ nồng độ kháng sinh có trong môi trƣờng không đủ để loại những vi khuẩn không mong muốn. Với nhận định này, chúng tôi quyết định chọn lọc thể biến nạp với nồng độ kháng sinh là 100µg/ ml. 4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng. Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C. 46 Hình 4.6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3. Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1. Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 3 : 0.5. Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C. Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C. 47 Với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml, đĩa đối chứng không xuất hiện khuẩn lạc nào. Trên cơ sở này tiến hành đánh giá các tỉ lệ biến nạp. Kết quả chọn lọc thể biến nạp ở nồng độ kháng sinh 100µg/ ml (Hình 4.6, 4.7, 4.8) cho khuẩn lạc xanh với mật độ rất cao, điều này cho thấy đây là nồng độ phù hợp để chọn lọc các khuẩn lạc mong muốn. Biến nạp ở thể tích 30µl khả nạp và 3µl plasmid cho kết quả ở giữa đĩa chỉ toàn khuẩn lạc xanh và các khuẩn lạc trắng chỉ có ở xung quanh đĩa. Điều này có thể giải thích do trong quá trình làm thí nghiệm đã có những xảy ra làm cho một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh, thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa, do đó các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân huỷ vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng, tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen lacZ diễn ra chậm. Đối với các khuẩn lạc này khi quan sát kĩ sẽ thấy màu xanh nhạt Tổng số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 450, nhƣ vậy theo công thức tính hệ số biến nạp do Sambrook và cộng sự đƣa ra, chúng tôi tính đƣợc hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 3,073x10 3 CFU/ μg plasmid. Kết quả biến nạp ở thể tích 10µl khả nạp và 1µl plasmid xuất hiện cả khuẩn lạc xanh và trắng với mật độ tƣơng đƣơng nhau. Điều này chỉ có thể giải thích là do các tế bào bị đột biến kháng kháng sinh. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 150, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,9x10 3 CFU/ μg plasmid. Kết quả biến nạp ở thể tích 3µl khả nạp và 0.5µl plasmid chỉ thu đƣợc toàn khuẩn lac màu xanh, đây là kết quả tốt nhất trong các quy trình biến nạp mà chúng tôi đƣa ra. Theo chúng tôi thì tỉ lệ giữa khả nạp và plasmid trong quy trình này là phù hợp nhất và chúng tôi sẽ dựa vào tỉ lệ này để làm các bƣớc tiếp theo trong thí nghiệm. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 180, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,846x10 3 CFU/ μg plasmid. Nhƣ vậy, sau 3 lần lập lại thí nghiệm với các tỉ lệ biến nạp khác nhau, chúng tôi thu đƣợc hệ số biến nạp nằm trong khoảng từ 1,8-3,0x10 3 CFU/ μg plasmid. 4.3 Tách chiết DNA plasmid Chọn ở mỗi tỉ lệ biến nạp trong mục 4.2 năm khuẩn lạc cấy chuyền sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh 100μg/ml, nuôi cấy lắc 48 ở 37 0 C qua đêm, cả 15 ống nghiệm trên đều có sinh khối vi khuẩn.Tiến hành tách chiết plasmid, thu đƣợc kết quả nhƣ sau : Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% (lần 1). Mẫu số 1, 2, 3, 4, 5 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 30 :3 ; Mẫu số 6, 7, 8, 9, 10 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 10 :1 ; Mẫu số 11, 12, 13, 14, 15 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 3 :0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 20 phút. Trong 15 mẫu tách chiết, mẫu số 3, 5, 7, 15 mặc dù vi khuẩn phát triển đƣợc trên môi trƣờng có kháng sinh nhƣng không thu đƣợc plasmid. Kết quả bƣớc đầu chiết tách plasmid còn lẫn rất nhiều DNA của bộ gen. Các mẫu không thu đƣợc plasmid có thể do sai sót trong quá trình tách chiết plasmid. Chiết tách DNA plasmid còn lẫn DNA của bộ gen là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính. Qua kết quả tách chiết trên tính đƣợc tỉ lệ tế bào tiếp nhận plasmid là 11/15. Với nhận định trên chúng tôi tiến hành chiết tách plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.10. Kết quả chiết tách plasmid 5 mẫu, mẫu số 4 không thu đƣợc plasmid. Ở lần tách chiết này đã loại đƣợc DNA genome Tuy nhiên còn lẫn rất nhiều tạp chất, lỗi này có thể do khi thực hiện bƣớc 7 và bƣớc 8 trong quy trình tách chiết, chúng tôi đã để cho các tạp chất lẫn vào phần dịch nổi phía trên. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách chiết lần 3 với mong muốn xác nhận những nghi ngờ của mình. Kết quả tách chiết lần 3 (có chú ý khắc phục những sai sót khi thực hiện ở lần tách chiết thứ 1 và thứ 2) đƣợc thể hiện ở Hình 4.11. Tiến hành tách chiết plasmid 5 mẫu, cả 5 mẫu đều có plasmid. Trong sản phẩm thu đƣợc không còn lẫn tạp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 DNA genome DNA plasmid 3.0kb . 46 Hình 4 .6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3. Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1. Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp. bị khả nạp mà không cần xác định giá trị OD. 43 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60 µg/ ml. lệ biến nạp nào là thích hợp, đồng thời cho phép khẳng định nồng độ kháng sinh 60 µg/ ml không đủ để chọn lọc thể biến nạp Biến nạp trong 60 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 :