Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 8 pptx

57 Hình 4.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên plasmid tái tổ hợp. (1) đối chứng mẫu số 2.1 (sản phẩm PCR từ genome, đoạn DNA insert), (2) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 2.1 với cặp primer của chính đoạn gen đó (ITS4, ITS5), (3) leader 100bp, (4) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 1.5 với cặp primer T3, T7, (5)đối chứng mẫu số 1.5 (đoạn DNA insert). Mẫu số 2.1 : Sản phẩm PCR trên genome và trên plasmid có trọng lƣong phân tử băng nhau, chứng tỏ đã chèn đƣơc đoạn DNA kých thƣớc 580bp vào plasmid và biến nạp thành công vào vi khuẩn DH5α. Mẫu số 1.5 : Sản phẩm PCR trên plasmid có kých thƣớc lớn hơn sản phẩm PCR trên genome, kết quả trên band diện di cho thấy sản phẩm này có kých thƣớc tƣơng đƣơng với tổng kých thƣớc của đoạn DNA chèn và kých thƣớc của vùng poly cloning site trên plasmid. Điều này cho thấy phản ứng nối đã không gây ảnh hƣởng khả năng hoạt động của T3, T7 RNA polymerase promoter. Tuy nhiên, mức độ khuyếch đại của phản ứng này thấp, nguyên nhân có thể do bởi phản ứng PCR chƣa hoàn chỉnh 1 2 3 4 5 580bp 857bp 629bp 58 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển một đoạn DNA bất kỳ vào tế bào chủ DH5α. Quy trình này có thể sử dụng cho các thí nghiệm tạo dòng áp dụng trực tiếp tại phòng thí nghiêm. Các bƣớc chính trong quy trình là Chuẩn bị khả nạp Dịch tế bào chuẩn bị để làm khả nạp phải có mật độ tế bào từ 5 x 10 7 đến 10 8 và tiến hành theo quy trình sau : Bƣớc 1: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 2: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0 C. Bƣớc 3: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần. Bƣớc 4: Cho 1 ml CaCl 2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 5: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 4 0 c Bƣớc 6: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 7: Cho 150μl CaCl 2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên. Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -70 0 C. Biến nạp plasmid vào khả nạp Bƣớc 1: Hút 3µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Bƣớc 2: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42 0 C, giữ trong 90 giây. Bƣớc 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37 0 c trong 1 giờ. Bƣớc 5: Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Bƣớc 6: Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 37 0 C. 59 Quy trình tách chiết plasmid Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20 0 C. Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 20 0 C, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 20 0 C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 37 0 C trong 1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20 0 C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20 0 C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 20 0 C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0 C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. 5.2 Đề nghị Tiếp tục hoàn thiện quy trình theo điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm, chuyển đoạn DNA từ sản phẩm cắt vào tế bào, chuyển một gen hoàn chỉnh vào tế bào chủ và kiểm soát sự biểu hiện của của gen đó. 60 Nếu trong trƣờng hợp không đủ hoá chất để tách chiết plasmid theo quy trình sử dụng SDS - Kiềm thì nên tách chiết plasmid theo phƣơng pháp xử lý nhiệt gồm các bƣớc sau : Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20 0 c Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 20 0 c, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Hoà tan kết tủa trong 500μl TE, vortex để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 4: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dung dịch TE thu lấy kết tủa. Bƣớc 5: Hoà tan kết tủa trong 500 μl dung dịch STET đƣợc làm lạnh . Bƣớc 6: Thêm 30 – 50 μl dung dịch men lysozyme, vortex làm hoà tan đều. Bƣớc 7: Cho vào bồn nƣớc đƣợc đun sôi trong 1- 2 phút. Bƣớc 8: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0 C. Bƣớc 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorf mới. Bƣớc 10: Thêm 170 – 200 μl dung dịch ammonium acetate 7.5 M và thêm 550μl dung dịch isopropanol. Trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bƣớc 11: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0 C, thu lấy kết tủa. Bƣớc 12: Thêm 500μl ethanol 70% lạnh vào, ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0 C Bƣớc 13: Loại bỏ dịch nổi thu lấy kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 14: Hoà tan kết tủa trong TE với lƣợng thích hợp. Bƣớc 15 : Điện di kiểm tra kết quả tách chiết plasmid. 61 TÀI LYỆU THAM KHẢO Tài lyệu tiếng việt 1. Bùi Trang Việt, 2002, Bài giảng sinh học phân tử ( chƣơng trình cao học), NXB đại học quốc gia TPHCM. 2. Đinh Duy Kháng, 7-2005, Bài giảng gen cloning và chỉ thị phân tử, Tài lyệu lƣu hành nội bộ trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng,2002, Sinh học phân tử, NXB giáo dục. 4. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật 5. Trần Lynh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại học quốc gia TPHCM. Tài lyệu tiếng nƣớc ngoài. 1. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall. 2. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan. 3. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH. 4. Sambrook J, E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH. 5. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Enginereering Techniques. Các website 1. http://faculty.plattsbuggh.edu/donald-slysh/transformation.html 2. 12.http://www.mun.ca/Biochem/course/4103/topic/transrormation.html 3. 13.http://cc.suny.edu/faculty/ 4. 14.http://www.fermentas.com/catalog/kits/kittransformaid.html 5. 15.http://www.kings.edu/Biology/lux/bacterial.html 6. 16.http://fruitfly4.aecom.edu/labmanual/27.html 7. 17.http://core.eai.edu/biol/foruvellm/farwelebpage/Biotech3100/pvector.200.pfd 8. http://lybrary.thinkquest.org/19697/data/ovpc6b.html 9. http://www.web.books.com/mobio/free/ch9a4.html 62 10. http://www.personal.umd.umich.edu/~mpasson/474/cloning 11. http://www.unn.edu/biology/Bial395-s-05/lab4a.html 12. http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW4/ html 13. http://www.ornl.gov/sci/techresourses/human 14. http://www_biology.ucsd.edu/classes/bimm100.FACO/03cloning.html 15. http://bioprotocol.endlex.com/protocols/lygation.html 16. http://www.soton.ac.uk/~kpa/molecal/clone.html 17. http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/lazo/pcr_cloning.html 18. http://brahms.chem.uic.edu/~cgpage/protocol/cloning.html 63 PHỤ LỤC Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm  Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 121 0 c trong 20 phút  Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 121 0 c trong 20 phút.  Môi trƣờng LB + Ampicillyn Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 121 0 c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-45 0 c bổ sung Ampicillyn nồng độ cuối 60µg/ml, 100µg/ml  Môi trƣờng LB + Ampicillyn + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coly) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillyn, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch  Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid 64 Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40µl Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol trong TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0. Dung dịch STET (sodium chloride, Tris, EDTA, Triton) Sucrose 8% Triton X - 100 0.5% EDTA pH 8.0 50mM Tris- HCl pH 8.0 10mM Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) . 15.http://www.kings.edu/Biology/lux/bacterial.html 6. 16.http://fruitfly4.aecom.edu/labmanual/27.html 7. 17.http://core.eai.edu/biol/foruvellm/farwelebpage/Biotech3100/pvector.200.pfd 8. http://lybrary.thinkquest.org/19697/data/ovpc6b.html. Sambrook J, E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1 989 , Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH. 5. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Enginereering Techniques. Các website 1. http://faculty.plattsbuggh.edu/donald-slysh/transformation.html. 1 2 3 4 5 580 bp 85 7bp 629bp 58 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển một đoạn DNA bất kỳ vào tế bào chủ DH5α. Quy trình này có thể