25 Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillyn, X-gal, IPTG ) 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm Hóa chất dùng cho PCR (đƣợc cung cấp bởi công ty Bio-rad) iTaq polymerase MgCl 2 dNTP s PCR buffer Các loại hoá chất khác Tryptone Bacto yeast extract Natri chlorua Canxi chlorua X-gal IPTG Kháng sinh Ampicillyn Glucose Tris- HCl pH 8.0 EDTA Sodium dodecyl sulfat (SDS) Natri hydroxide Glacial acetic Potassium acetat Glycerol 70% Bromophenol blue Ethidiumbromide 3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC (Roche, Cat.No. 220 612) CCTAG G EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC (Roche, Cat.No. 667 145) CTA TAG Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT (Roche, Cat.No. 656 313) TTCGA A DNA T4 lygase (usb, Product No. 70005Y) do công ty Amersham cung cấp. DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) do công ty Bio-rad cung cấp. 26 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn. Nhân sinh khối, tách chiết plasmid,kiểm tra Màng tế bào hồi phục plasmid bắt đầu sao chép Nhiễm sắc thể + CaCl 2 Màng tế bào trở nên khả nạp + DNA plasmid sốc nhiệt ổn định tế bào 27 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra. Vi khuẩn Ecoly DH5α Khả nạp + CaCl 2 Plasmid Bluescript II SK (+/-) Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt Chiết tách plasmid Tinh sạch Đoạn DNA Cắt plasmid bằng EcoRV Blunt - end Tinh sạch Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng Chiết tách plasmid Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7 28 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD 600nm kết hợp với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng LB agar 3.3.3.1 Nguyên tắc Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan, thì sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm cho môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập đƣợc quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lƣợng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua việc đo OD ở các bƣớc sóng từ 550 – 610 nm. Trong trƣờng hợp này, phải thiết lập đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào kết hợp với phƣơng pháp đếm trực tiếp. 3.3.3.2 Cách tiến hành Cấy phân lập vi khuẩn E.coly DH5α từ ống gốc lên đĩa petri chứa môi trƣờng LB agar. Ủ ở 37 0 c từ 16-18 giờ Dùng que cấy bắt một khuẩn lạc (0.5-1mm) từ đĩa petri đã phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 37 0 C, 150 vòng/phút. Sau 3giờ nuôi cấy bắt đầu tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 600nm, sử dụng môi trƣờng LB lỏng để xây dựng đƣờng chuẩn, lặp lại sau mỗi giờ nuôi cấy. Ở mỗi thời điểm lấy dịch nuôi cấy để đo OD ta cũng tiến hành đếm khuẩn lạc tại thời điểm đó bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. Đếm khuẩn lạc Sơ đồ 3.4 Quy trình pha loãng dịch vi khuẩn Tiến hành pha loãng bậc 10 ở các nồng độ Chuẩn bị sẵn các eppendorf 1.5ml sạch chứa 900μl nƣớc 100μl dịch nuôi cấy 900μl nƣớc 29 Hút 100μl dịch vi khuẩn đang nuôi cấy cho vào eppendorf thứ nhất ta đƣợc nồng đô pha loãng 10 -1 , tiếp tục pha loãng theo sơ đồ đến nồng độ cần thiết. Chọn 3 nồng độ pha loãng lyên tiếp, thích hợp. Ở mỗi độ pha loãng hút 10μl cấy nhỏ giọt lên đĩa petri chứa môi trƣờng LB agar. Lập lại 3 lần. Ủ ở 37 0 c qua đêm và chọn nồng độ thích hợp nhất đếm số khuẩn lạc ở 3 giọt cấy. Cách tính Số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD bằng tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc chia 3 rồi nhân với độ pha loãng và nhân với 100 A = A : số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD (cfu/ml) 3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bƣớc 1: Bắt một khuẩn lạc đƣờng kýnh từ 2-3 mm từ đĩa phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trƣờng LB lỏng. Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc ở 37 0 C đến khi đạt đƣợc mật độ khoảng 10 8 tế bào/ml Bƣớc 3: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0 C. Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần. Bƣớc 6: Cho 1 ml CaCl 2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 4 0 C. Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150μl CaCl 2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -70 0 C. Khả nạp chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl 2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -70 o C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản số khuẩn lạc đếm đƣợc * độ pha loãng *1000 3 * 10 30 khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng. 3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Chúng tôi tiến hành biến nạp thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt, nồng độ khả nạp và plasmid. Nhằm xác định quy trình nào có hiệu quả nhất để phục vụ cho biến nạp plasmid tái tổ hợp. Mỗi quy trình lập lại với thời gian sốc nhiệt là 60 giây, 90 giây Quy trình 1 Hút 30µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 µl, thêm 3µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42 0 C, giữ trong 90 giây Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút Thêm 800µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37 0 c trong 1 giờ Hút 150ml dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh Ampicilyn nồng độ 50µg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 37 0 C. Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 2 Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42 0 C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37 0 C trong 1 giờ. Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 37 0 C. 31 Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 3 Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42 0 C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37 0 C trong 1 giờ. Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 37 0 C. Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. 3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp Nguyên tắc của chọn lọc khuẩn lạc mong muốn là dựa vào phản ứng tạo màu với X-gal trong môi trƣờng LB có sự hiện diện của kháng sinh Ampicillyn và IPTG. Sau khi ủ qua đêm trên đĩa petri sẽ xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và các khuẩn lạc màu trắng. Tiến hành đếm các khuẩn lạc màu xanh trên mỗi đĩa. Dùng tăm vô trùng bắt ở mỗi đĩa 10 khuẩn lạc màu xanh cho vào 10 ống nghiệm có chứa 5 ml môi trƣơng LB lỏng có kháng sinh nồng độ 60 µg/µl. Nuôi cấy lắc 150 vòng/phút qua đêm ở 37 0 c. Cách tính hệ số biến nạp theo Sambrook và cộng sự, 1989 : N = A x10 n x OV/PV N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl) 3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 3.3.7.1 Chiết tách plasmid 32 Có nhiều phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid nhƣ: Phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ cao, phƣơng pháp SDS – kiềm. Nhƣng chúng tôi chọn phƣơng pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng tế bào bị vỡ , dƣới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh đƣợc sự phân hủy của DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính. Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng. DNA của bộ gen có kých thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid. Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống. Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen. DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng. Phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20 0 C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 20 0 C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 20 0 C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 37 0 C trong1 giờ. . khuẩn E. coly DH5α và kiểm tra Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coly DH5α và kiểm tra. Vi khuẩn Ecoly DH5α Khả nạp. bào hồi phục plasmid bắt đầu sao chép Nhiễm sắc thể + CaCl 2 Màng tế bào trở nên khả nạp + DNA plasmid sốc nhiệt ổn định tế bào 27 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn. lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 2 Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 1.5µl DNA