Luân. văn : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α part 4 pps

Vi khuẩn Ecoly DH5α + CaCl2 Khả nạp Plasmid Bluescript II SK +/- Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt Chiết tách plasmid Tinh sạch Đoạn DNA Cắt plasmid bằng EcoRV Blunt - end Tinh

Môi trường LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar Ampicillyn, X-gal, IPTG )

3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm

Hóa chất dùng cho PCR (được cung cấp bởi công ty Bio-rad)

iTaq polymerase

MgCl2

dNTPs

PCR buffer

Các loại hoá chất khác

Tryptone

Bacto yeast extract

Natri chlorua

Canxi chlorua

X-gal

IPTG

Kháng sinh Ampicillyn

Glucose

Tris- HCl pH 8.0

EDTA Sodium dodecyl sulfat (SDS) Natri hydroxide

Glacial acetic Potassium acetat Glycerol 70%

Bromophenol blue Ethidiumbromide

3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm

BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC

(Roche, Cat.No 220 612) CCTAG G

EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC

(Roche, Cat.No 667 145) CTA TAG

Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT

(Roche, Cat.No 656 313) TTCGA A

DNA T4 lygase (usb, Product No 70005Y) do công ty Amersham cung cấp

DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) do công ty Bio-rad cung cấp

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Nhân sinh khối, tách chiết plasmid,kiểm tra

Màng tế bào hồi phục

plasmid bắt đầu sao chép

Nhiễm sắc thể

+ CaCl2

Màng tế bào trở nên khả nạp + DNA plasmid

sốc nhiệt

ổn định tế bào

3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra

Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra

Vi khuẩn Ecoly DH5α + CaCl2 Khả nạp

Plasmid Bluescript II SK (+/-)

Vi khuẩn mang plasmid Bluescript

Sốc nhiệt

Chiết tách plasmid

Tinh sạch

Đoạn DNA

Cắt plasmid bằng EcoRV

Blunt - end

Tinh sạch

Phản ứng nối

Biến nạp vào khả nạp

Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh

Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng

Chiết tách plasmid

Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7

100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl

3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD 600nm kết hợp với phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường LB agar

3.3.3.1 Nguyên tắc

Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan, thì sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do vậy có thể định lượng mật

độ tế bào một cách gián tiếp thông qua việc đo OD ở các bước sóng từ 550 – 610 nm Trong trường hợp này, phải thiết lập đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào kết hợp với phương pháp đếm trực tiếp

3.3.3.2 Cách tiến hành

Cấy phân lập vi khuẩn E.coly DH5α từ ống gốc lên đĩa petri chứa môi trường LB

agar Ủ ở 370c từ 16-18 giờ

Dùng que cấy bắt một khuẩn lạc (0.5-1mm) từ đĩa petri đã phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút

Sau 3giờ nuôi cấy bắt đầu tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm, sử dụng môi trường LB lỏng để xây dựng đường chuẩn, lặp lại sau mỗi giờ nuôi cấy

Ở mỗi thời điểm lấy dịch nuôi cấy để đo OD ta cũng tiến hành đếm khuẩn lạc tại thời điểm đó bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Đếm khuẩn lạc

Sơ đồ 3.4 Quy trình pha loãng dịch vi khuẩn

Tiến hành pha loãng bậc 10 ở các nồng độ

Chuẩn bị sẵn các eppendorf 1.5ml sạch chứa 900μl nước

100μl dịch nuôi cấy

900μl nước

Hút 100μl dịch vi khuẩn đang nuôi cấy cho vào eppendorf thứ nhất ta được nồng đô pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng theo sơ đồ đến nồng độ cần thiết

Chọn 3 nồng độ pha loãng lyên tiếp, thích hợp Ở mỗi độ pha loãng hút 10μl cấy nhỏ giọt lên đĩa petri chứa môi trường LB agar Lập lại 3 lần

Ủ ở 370c qua đêm và chọn nồng độ thích hợp nhất đếm số khuẩn lạc ở 3 giọt cấy

Cách tính

Số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD bằng tổng số khuẩn lạc đếm được chia 3 rồi nhân với độ pha loãng và nhân với 100

A =

A : số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD (cfu/ml)

3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Bước 1: Bắt một khuẩn lạc đường kýnh từ 2-3 mm từ đĩa phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trường LB lỏng

Bước 2: Nuôi cấy lắc ở 370C đến khi đạt được mật độ khoảng 108tế bào/ml

Bước 3: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong

10 phút

Bước 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C

Bước 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dưới Lập lại bước này 3 lần

Bước 6: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu được Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa

Bước 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40

C

Bước 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa Bước 9: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên

Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700

C

Khả nạp chuẩn bị theo phương pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó được bảo quản ở -70oC Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản

số khuẩn lạc đếm được * độ pha loãng *1000

3 * 10

khả nạp được lâu hơn Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng

3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng

phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Chúng tôi tiến hành biến nạp thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt, nồng độ khả nạp và plasmid Nhằm xác định quy trình nào có hiệu quả nhất

để phục vụ cho biến nạp plasmid tái tổ hợp

Mỗi quy trình lập lại với thời gian sốc nhiệt là 60 giây, 90 giây

Quy trình 1

Hút 30µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 µl, thêm 3µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

Thêm 800µl môi trương LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370c trong 1 giờ

Hút 150ml dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trương LB có chứa kháng sinh Ampicilyn nồng độ 50µg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường

Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt

Lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370

C

Lặp lại quy trình trên nhưng không cho DNA plasmid vào khả nạp để làm đối chứng

Quy trình 2

Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đươc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

Thêm 500µl môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ

Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trương LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường

Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt

Lặp lại quy trình trên nhưng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng

Quy trình 3

Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420

C, giữ trong 90 giây

Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

Thêm 200µl môi trương LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ

Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trương LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường

Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt

Lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370C

Lặp lại quy trình trên nhưng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng

3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp

Nguyên tắc của chọn lọc khuẩn lạc mong muốn là dựa vào phản ứng tạo màu với

X-gal trong môi trường LB có sự hiện diện của kháng sinh Ampicillyn và IPTG

Sau khi ủ qua đêm trên đĩa petri sẽ xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và các khuẩn lạc màu trắng Tiến hành đếm các khuẩn lạc màu xanh trên mỗi đĩa

Dùng tăm vô trùng bắt ở mỗi đĩa 10 khuẩn lạc màu xanh cho vào 10 ống nghiệm có chứa 5 ml môi trương LB lỏng có kháng sinh nồng độ 60 µg/µl

Nuôi cấy lắc 150 vòng/phút qua đêm ở 370

c

Cách tính hệ số biến nạp theo Sambrook và cộng sự, 1989 :

N = A x10n x OV/PV N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA

A: số khuẩn lạc đếm được trên môi trường chọn lọc

n: hệ số pha loãng

OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)

OP: thể tích dịch vi khuẩn được trải trên đĩa (µl)

3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra

Có nhiều phương pháp chiết tách DNA plasmid như: Phương pháp sử dụng nhiệt

độ cao, phương pháp SDS – kiềm Nhưng chúng tôi chọn phương pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này

Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng Sau khi màng tế bào bị vỡ , dưới tác dụng của SDS protein của tế bào

sẽ bị biến tính Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của DNAse Mặt khác, sự

bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ được phục hồi nhanh chóng DNA của bộ gen có kých thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống Như vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen DNA của plasmid được tủa dưới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng

Phương pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)

Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau

Bước 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200

C Bước 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tương ứng cho vào,

ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm

Bước3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết

Bước 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf

Bước 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200

C Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tương ứng

Bước 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu được 1µl RNAse, ủ ở 370C