65 Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,2μm Dung dịch kháng sinh Ampicillyn 100mg/ml Cân 100mg ampicillyn dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,45μm. Các loại buffer PCR buffer 10X Tris-HCl pH 8.4 200mM (NH 4 ) 2 SO 4 166mM MgCl 2 67mM DTT 100mM NP 40 0,1% Tween-20 0,1% Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl 2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl 2 10mM DTT 1mM Lygation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl 2 66mM DTT 100mM ATP 660μM 66 Hình 1: Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 67 Hình 2 : Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) 68 MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các hình viii Danh sách các bảng, biểu đồ và sơ đồ x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt Vấn Đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.3 Nội dung thực hiện 2 1.3.1 Phần 1 2 1.3.2 Phần 2 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU 3 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 3 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp 3 2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen 3 2.1.2.1 Vai trò 3 2.1.2.2 Ứng dụng 3 2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp 4 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly 5 2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo. 5 2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly 5 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp 7 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý 7 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học 7 2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp 8 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid 9 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 10 iii 69 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR 10 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 10 2.3.7 Điện di DNA 14 2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA 14 2.4.1 Plasmid 15 2.4.2 Nhiễm sắc thể virút 16 2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA 16 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn 16 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 19 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) 19 2.5.2.2 Terminal transferase 19 2.5.2.3 Các DNase 20 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. 20 2.5.4 Các enzym nối DNA 20 2.5.3.1 E.coly DNA lygase 20 2.5.3.2 T4 DNA lygase 21 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội 21 2.6.1 Với plasmid 21 2.6.2 Với DNA phage 21 2.7 Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận 21 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp 23 3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm 23 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm 23 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α 23 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) 23 3.2.1.3 Đoạn DNA 24 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 24 3.2.3 Các thiết bị máy móc 24 3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn 24 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm 25 iv 70 3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm 25 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 26 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra 27 3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD 600nm kết hợp với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 28 3.3.3.1 Nguyên tắc 28 3.3.3.2 Cách tiến hành 28 3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp 29 3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 30 3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp 31 3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 31 3.3.7.1 Chiết tách plasmid 31 3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid 33 3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose 34 3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR 34 3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR 35 3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) 36 3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp 37 3.3.12 Kiểm tra kết quả chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI và Hind III, thực hiện phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5) 38 PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 39 4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính 39 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 43 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml 43 4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml 45 4.3 Tách chiết DNA plasmid 47 4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV 50 4.5 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid đã cắt bằng enzym EcoRV 50 v 71 4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA 50 4.5.2 Tinh sạch plasmid 52 4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp 52 4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp 54 4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp 55 4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR 56 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Đề nghị 59 TÀI LYỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 63 vi 72 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly. 6 Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR. 10 Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning 15 Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn 18 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA. 36 Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy. 39 Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy. 39 Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây. 43 Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây. 44 Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng. 45 Hình 4.6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3. 46 Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1. 46 Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 3 : 0.5. 46 Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% (lần 1). 48 Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2). 49 Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3). 49 Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel agarose 0.8%. 50 Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX. 51 Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX. 51 Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX. 52 Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG. 53 viii . Các loại enzym dùng trong thí nghiệm 25 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 26 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coly DH5α và kiểm. 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 19 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) 19 2.5.2.2 Terminal transferase 19 2.5.2.3 Các DNase 20 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. 20 2.5.4 Các enzym nối DNA 20. primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5) 38 PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 39 4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính 39 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 43 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn