luận văn:Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC pdf

- 16 - - Định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao, tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng và có thể áp dụng định lượng ở

- 4 -

MỤC LỤC

PHẦN 1: TỔNG QUAN - 3 -

1.1 TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN - 7 -

1.1.1 Công thức cấu tạo - 7 -

1.1.2 Tính chất lý hóa - 7 -

1.1.3 Nguồn gốc - 7 -

1.1.4 Dược động học - 7 -

1.1.5 Tác dụng và cơ chế tác dụng - 8 -

1.1.6 Chỉ định - 8 -

1.1.7 Chống chỉ định - 9 -

1.1.8 Dạng bào chế và liều lượng - 9 -

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN - 9 -

1.2.1 Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh - 9 -

1.2.1.1 Phương pháp 1 [15] - 9 -

1.2.1.2 Phương pháp 2 [3] - 10 -

1.2.1.3 Phương pháp 3:[14], [20] - 10 -

1.2.2 Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS - 11 -

1.2.2.1 Phương pháp 1: [4] - 11 -

1.2.2.2 Phương pháp 2: [19] - 11 -

1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC - 12 -

1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] - 12 -

1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] - 12 -

1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] - 13 -

1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] - 13 -

1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] - 14 -

1.2.2.6 Phương pháp 6 [5] - 14 -

1.2.2.7 Phương pháp 7 [9] - 15 -

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) - 16 -

1.3.1 Nguyên tắc - 16 -

1.3.2 Cơ sở lý thuyết - 17 -

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC - 17 -

1.3.3.1 Hệ thống bơm - 17 -

1.3.3.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi - 17 -

1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu - 17 -

1.3.3.4 Cột sắc ký lỏng HPLC - 18 -

1.3.3.5 Detector trong HPLC - 18 -

1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết quả - 18 -

- 5 -

1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký - 19 -

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký - 21 -

1.3.5.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] - 21 -

1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18] - 22 -

1.3.5.3 Chọn đệm pH - 23 -

1.3.5.4 Tốc độ dòng - 23 -

1.3.6 Cách đánh giá pic - 23 -

1.3.7 Ứng dụng của HPLC - 24 -

1.3.7.1 Định tính và thử độ tinh khiết: - 24 -

1.3.7.2 Sắc ký điều chế: - 24 -

1.3.7.1 Định lượng: - 24 -

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 26 -

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM - 26 -

2.1.1 Nguyên vật liệu : - 26 -

2.1.1.1 Nguyên liệu và hoá chất: - 26 -

2.1.1.2 Dụng cụ: - 26 -

2.1.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu - 26 -

2.1.2.1 Phương pháp nghiên cứu - 26 -

2.1.2.2 Nội dung nghiên cứu - 27 -

2.2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 28 -

2.2.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC - 28 -

2.2.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký - 28 -

2.2.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: - 28 -

a Khảo sát chọn bước sóng thích hợp - 28 -

Hình 1: Phổ hấp thụ của dung dịch tobramycin 0,02% - 29 -

b Lựa chọn cột: - 29 -

c Lựa chọn đệm: - 29 -

d Lựa chọn pha động: - 30 -

e Lựa chọn tốc độ dòng - 30 -

đ Điều kiện sắc ký lựa chọn - 31 -

2.2.2 Qui trình định lượng - 31 -

2.2.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống - 32 -

2.2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng - 32 -

2.2.2.3 Điều kiện sắc ký - 33 -

2.2.2.4 Tính kết quả - 33 -

2.2.3 Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng - 34 -

2.2.4 Đánh giá phương pháp định lượng - 35 -

2.2.4.1 Tính tuyến tính - 35 -

- 6 -

2.2.4.2 Tính chính xác - 37 -

2.2.4.3 Tính đúng - 37 -

Bảng 6: Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp - 38 -

2.2.4.4 Tính đặc hiệu - 39 -

2.3 BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ - 40 -

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT - 43 -

3.1 KẾT LUẬN - 43 -

3.2 ĐỀ XUẤT - 43 -

- 7 -

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN

1.1.1 Công thức cấu tạo

- 8 -

tương Do phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não Thuốc đạt nồng độ cao trong vỏ thận Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều khi suy thận, thường dựa vào creatinin huyết thanh

để tránh độc tính Hiện nay, tobramycin được dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày như trước đây Đối

với các ca nặng (nhiễm Pseu aeruginosa ở người giảm neutrophile và các ca

suy thận) cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6]

1.1.5 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí Thuốc

không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí

Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận

Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn

các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin

Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom [2], [11]

1.1.6 Chỉ định

Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr (-)

- 9 -

Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm

khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp gây ra, tobramycin có thể dùng phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam

Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha -

Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc benzylpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ [2]

1.1.7 Chống chỉ định

Người có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, người nghe kém và người có bệnh thận [2]

1.1.8 Dạng bào chế và liều lượng

Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml (trẻ em) Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ

Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %

Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm

P aeruginosa đường hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa [11]

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN

1.2.1 Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh

- 10 -

pH sau khi tiệt trùng : 7,8 ± 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15]

- Môi trường định lượng:

pH sau khi tiệt trùng : 8,2 ± 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử

Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml;

- 11 -

- Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633

- Môi trường nuôi cấy : Môi trường đặc

- Dung dịch chuẩn

Cân chính xác một lượng tobramycin chuẩn, tương đương khoảng 25

mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5οC đến 15οC và sử dụng trong vòng 30 ngày Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực)

- Dung dich thử:

Cân chính xác một lượng tobramycin, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M,

pH 8 để được các dung dịch có nồng độ 8µg/ml và 2µg/ml (theo hiệu lực)

1.2.2 Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

1.2.2.1 Phương pháp 1: [4]

Cân một lượng tobramycin sulfat tương ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nước cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO4 Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 400C trong 60 phút

Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối chiếu tobramycin

Mẫu trắng tiến hành như mẫu thử nhưng không có tobramycin

Sau khi đun cách thuỷ ở 400C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bước sóng 425 nm, cuvet dày 1cm

1.2.2.2 Phương pháp 2: [19]

- 12 -

Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl3 Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645 nm Định luật Lambert-Beer được áp dụng trong khoảng nồng

- Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

- Detector UV: 365 nm

- Cột Purospher STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 µm, Merck)

- Pha động: Acetonitril - nước (50:50)

- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút

- Detector UV: 230 nm

- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 µg/ml trong nước

- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 700C

- Pha động B: Acetonitril

- Tiến hành sắc ký theo chương trình gradient dung môi như sau:

Thời gian (phút)

Pha động A (%)

Pha động B (%)

- Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong

100 ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút Thêm 1,5 ml

- 15 -

dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat

pH 10,4 lắc đều

- Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900

ml nước Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nước tới vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm (pha theo BP 2005)

1.2.2.7 Phương pháp 7 [9]

 Dung dịch thử

Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 20,0 ml Hòa tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml Thêm 0,5 ml thuốc thử X, đem đun cách thủy ở 80 0C trong 60 phút Thêm dung môi vừa

đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm

 Dung dịch chuẩn (đối chiếu)

Tiến hành tương tự như dung dịch thử nhưng thay tobramycin nguyên liệu bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu)

- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm

* Nhận xét: Qua các phương pháp định lượng nêu trên, chúng tôi nhận thấy:

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết bị phức tạp nhưng có nhược điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc hiệu do sự có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không cao

- 16 -

- Định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao, tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng và có thể áp dụng định lượng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nước Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là: Tính đặc hiệu chưa cao (sự

có mặt của chất khác có khả năng hấp thụ tử ngoại khả kiến như benzalkonium clorid, một chất bảo quản hay dùng, sẽ ảnh hưởng kết quả định lượng), hoặc phải dùng thuốc thử nhập ngoại để tạo dẫn chất

- Định lượng bằng phương pháp HPLC :

 Ưu điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng được hoạt chất

 Nhược điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền vì detector UV thường không dùng được mà thường phải tạo dẫn chất Phương pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích các hợp chất phân cực và hấp thụ UV Nhưng với các hợp chất hấp thụ

UV yếu như tobramycin thì thường phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc biệt đắt tiền

Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc thử tạo dẫn xuất như các phương pháp hiện nay với hi vọng có thể đưa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lượng các sản phẩm chứa tobramycin

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.3.1 Nguyên tắc

Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách

và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh

- 17 -

(trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân

bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi

ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in [8]

1.3.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ [8], [11]

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau:

1.3.3.1 Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột tách Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar)

1.3.3.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và đuổi khí hòa tan

1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột

- 18 -

Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động Mẫu thử (dạng lỏng hay dạng rắn) đều phải hoà tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi tiêm

1.3.3.5 Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV - VIS

Nguyên lý hoạt động của detector UV - VIS dựa trên nguyên lý hoạt động của phương pháp đo quang phổ hấp thụ Ngoài ra còn có detector khúc

xạ, huỳnh quang, điện hóa

1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết quả

Có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu dưới dạng pic [8], [14]

Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 1.1

Cột

Binh chứa pha động Bơm

Detector Bộ phận tự ghi

Van tiêm mẫu

- 19 -

Hình 1.1: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC

1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Hình 1.2: Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng

Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại

và ghi thành sắc ký đồ với các thông số:

* tR (Thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất phân tích được bơm vào cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cựu đại của nó

* t0 (Thời gian chết): thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc

ký

* tR’ (Thời gian lưu thực): tR’ = tR - t0

* W0.5 : Độ rộng của pic ở nửa chiều cao

W

b1 W R2

R2 t'

R1 t

o

- 20 -

Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng

số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi

1.3.4.1 Hệ số dung lượng k ’

[8],[14]

Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1 < k' < 8

k '

k

0 1 R

0 2 R 1

2

−

−

= (k2' > k1' ) [8], [14]

α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2

1.3.4.3 Độ phân giải (resolution)

Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc

ký Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:

− α

= +

−

= +

−

+ ' k

1 k ' w

w

B A

2 / 1 B 2 / 1

A , R B , R A

B

A , R B ,

4 N 18

, 1 2

AF = w1 / 20 [8], [14]

Trong đó:

W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Trong phép định lượng, yêu cầu: 0,9 ≤ AF ≤ 2 [1], [18], [22]

k

0

R 0

0 R 0

=

B R

t

B 2 / 1 R

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.3.5.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18]

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần Nó là một chất rắn xốp có kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3 - 10 µm, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500 m2/g

Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:

 Phải trơ và bền vững trong môi trường HPLC

* R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl được chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl - R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng (phenyl) Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên

bề mặt trở nên ít phân cực Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion

1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18]

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, hiệu lực tách của cột, độ phân giải

RS , độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp

là rất quan trọng

Yêu cầu của pha động:

 Phải trơ với pha tĩnh

 Hòa tan được chất cần phân tích

 Bền vững theo thời gian

 Có độ tinh khiết cao

 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

 Phù hợp với detector

 Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

- 23 -

Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform Các pha động này thường được bão hoà

Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

Bốn yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động:

 Bản chất của dung môi để chạy pha động

 Thành phần của các chất trong pha động

Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký [12], [18]

độ vừa, trung bình và cao