Xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-time PCR

Xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-time PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng – 2005 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Th.S NGUYỄN THÁI THỦY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng – 2005 ii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường Thầy Lê Đình Đơn tận tình hướng dẫn, nhận xét giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Thái Thủy hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em nhiều, cho em lời khuyên quý giá để hồn thành khóa luận Em xin gửi đến thầy lời biết ơn chân thành Thầy Phương, chị Kim Anh, anh Luân (công ty Bio-Rad) giúp đỡ em thực hành nắm vững phương pháp Real-Time PCR Em xin gởi lời cám ơn đến thầy Bùi Văn Lệ, anh Vũ, chị Liên, anh Nam với anh chị bạn làm việc phịng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (Lab B), trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh nhiệt tình hướng dẫn dành cho em tình cảm quý giá suốt trình thực khóa luận Con xin gửi lịng tri ân đến Ba, Mẹ, em Thành người thân gia đình ln ủng hộ, nâng đỡ dành cho tình thương sâu sắc Xin cảm ơn tất bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học K27 chia sẻ buồn vui hết lịng giúp đỡ, hỗ trợ tơi suốt năm tháng mái trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Xin chân thành cảm ơn bạn Khánh Đan động viên, giúp đỡ dành cho tơi tình cảm tốt đẹp Xin chân thành cảm ơn tất người Sinh viên Nguyễn Hữu Trưởng iii TÓM TẮT Nguyễn Hữu Trƣởng, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Đình Đơn Th.S Nguyễn Thái Thủy Đề tài thực từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa promoter 35S phương pháp Real-Time PCR Đánh giá khả định lượng hiệu phương pháp Định lượng số mẫu bắp thực phẩm có chứa bắp thị trường Tp Hồ Chí Minh phụ cận Đề tài có kết sau: Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen: - Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp thực phẩm có chứa bắp Quy trình đề nghị: dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein: phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol - Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa promoter 35S Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I Kết thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC - Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết sàng lọc dương tính, dựa promoter 35S Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman Kết đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả phát định lượng copy gen đích mẫu thí nghiệm, định lượng xác mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước - Khảo sát số mẫu sản phẩm cho thấy, thị trường Việt Nam có sản phẩm chuyển gen dạng thực phẩm thức ăn khác iv SUMMARY NGUYEN HUU TRUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, VietNam Aug 2005 ESTABLISHING A PROCESS OF GMOs (Genetically Modified Organisms) QUANTIFICATION BY REAL-TIME PCR METHOD Instructors: Le Dinh Don and Nguyen Thai Thuy Recently, GMO is a controversial problem in the world Because its advantages and disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its affects to environment and human health For this purpose, methods for GMOs detection and quantification in order to determine the percentage ratio of GMO presentation in food and feed need to be developed So, in this thesis, a process for GMO quantification will be researched and established by Real-Time PCR method, one of the most exactly methods for GMO quantification now Purpose: Establishing a process of GM maize quantification based on CaMV 35S promoter by Real-Time PCR method Evaluating quantification ability and efficiency of method Applying it for quantification some of food and feed derived from maize in Ho Chi Minh City Results: A process of GM maize quantification by Real-Time PCR method: - Step 1: DNA extraction: Cell wall destruction solution: CTAB 2% Protein denaturalization solution: phenol/chloroform DNA precipitation solution: Isopropanol - Step 2: GM maize screening based on 35S promoter Method: Real-Time PCR with SYBR Green I dye Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 8686,5oC) - Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman Quantification ability: Detection and quantification copy of p35S in a experiment template, exactly quantification a template which percentage ratio of GMO presentation has known - Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO in its ingredients Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been established and can be applied to many other species v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC vi CHỮ VIẾT TẮT xi DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BẢNG xiv PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.Đặt vấn đề 2.Mục đích yêu cầu 2.1.Mục đích .2 2.2.Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) Quá trình tạo sinh vật GMO 2.1.Quá trình 2.2.Promoter CaMV 35S 3.Ứng dụng lợi ích thực vật chuyển gen 3.1.Ứng dụng 3.1.1 Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] 3.1.2 Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17] 3.2.Tác động có lợi thực vật chuyển gen .8 4.Tình hình trồng chuyển gen giới 4.1.Tình hình bắp chuyển gen giới 11 5.Ảnh hƣởng bất lợi dƣ luận xã hội trồng biến đổi gen 12 5.1.Các rủi ro gặp [34] .12 5.2.Tác động có hại 12 5.2.1 Môi trường 13 5.2.2 Sức khoẻ người tiêu dùng 13 5.2.3 Các nghiên cứu dẫn chứng cụ thể 14 vi 5.3.Dư luận xã hội trồng biến đổi gen .14 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen giới 16 6.1.Quy định châu Âu [33]: 17 6.1.1 Nguyên tắc định lượng dựa DNA 18 6.1.2 Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen châu Âu 19 6.1.2.1 Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 19 6.1.2.2 Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen 19 Tình hình Việt Nam 21 7.1.Nghiên cứu phát triển sinh vật biến đổi gen 21 7.2.Vấn đề thương mại hóa kiểm soát sinh vật biến đổi gen 21 Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen 22 8.1.Phương pháp ELISA 23 8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] 23 8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR .24 8.3.1 Hóa chất định lượng 24 8.3.1.1 SYBR Green I 25 8.3.1.2 Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) 25 8.3.2 Công cụ phát 27 8.4.Nguyên tắc định lượng kĩ thuật Real-time PCR 28 8.4.1 Quan hệ định lượng 28 8.4.2 Thiết kế thí nghiệm 29 8.4.3 Phân tích liệu Real-time PCR 30 8.4.4 Tính tốn hàm lượng GMO 31 8.5.Mức độ chuyên biệt phát định lượng trồng biến đổi gen [9][44]32 8.6.Một số cơng trình nghiên cứu phát định lượng GMO dựa promoter 35S 34 8.6.1 Phát sàng lọc GMO dựa promoter 35S 34 8.6.2 Định lượng GMO đựa promoter 35S 35 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 36 1.Nội dung nghiên cứu 36 2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm 36 vii 2.1.Địa điểm thực thí nghiệm .36 2.2.Thời gian thực .36 3.Tiến trình thí nghiệm: 36 4.Vật liệu thí nghiệm 37 5.Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình ly trích DNA 38 5.1.Mục tiêu 38 5.2.Vật liệu 38 5.3.Phương pháp thực 38 5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích 41 6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 41 6.1.Mục tiêu 41 6.2.Nguyên tắc 41 6.3.Vật liệu thí nghiệm .42 6.4.Trang thiết bị 42 6.5.Phương pháp thực 43 6.5.1 Thành phần phản ứng PCR Real-Time PCR 43 6.5.2 Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại 43 6.5.3 Phát sản phẩm khuếch đại 44 6.5.4 Phân tích kết 45 7.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen 46 7.1.Mục tiêu 46 7.2.Nguyên tắc 46 7.3.Vật liệu thí nghiệm .46 7.4.Trang thiết bị 46 7.5.Phương pháp thực 46 7.5.1 Bố trí thí nghiệm 46 7.5.1.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S 47 7.5.1.2 Đánh giá kết định lượng 48 7.5.2 Thành phần phản ứng PCR 48 7.5.2.1 Đặc điểm 35S master mix 49 7.5.2.2 Đặc điểm SYBR Green I Supermix 49 7.5.3 Chương trình nhiệt thiết lập máy Real-Time PCR 49 viii 7.5.4 Cài đặt phần mềm điều khiển 50 7.5.5 Phân tích kết thí nghiệm 51 8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả định lƣợng phƣơng pháp Real-Time PCR 54 8.1.Mục tiêu 54 8.2.Nguyên tắc 54 8.3.Vật liệu thí nghiệm .54 8.4.Trang thiết bị 54 8.5.Hóa chất 54 8.5.1 Đặc điểm 35S corn-reference master mix 55 8.5.2 Đặc điểm chuẩn 35S gen tham chiếu (35S corn reference calibration DNA standards) 55 8.6.Phương pháp thực 55 8.6.1 Bố trí thí nghiệm 56 8.6.1.1 Độ nhạy phản ứng 56 8.6.1.2 Độ xác: 56 8.6.2 Thiết kế phản ứng định lượng 56 8.6.3 Thành phần phản ứng Real-Time PCR 57 8.6.4 Chương trình nhiệt thiết lập máy Real-Time PCR 57 8.6.5 Phân tích kết 58 9.Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát số mẫu thị trƣờng 58 9.1.Mục tiêu 58 9.2.Nguyên tắc 58 9.3.Vật liệu thí nghiệm .58 9.4.Trang thiết bị hóa chất .58 9.5.Phương pháp thực 59 9.5.1 Bố trí thí nghiệm 59 9.5.2 Thiết kế phản ứng định lượng 59 9.5.3 Thành phần phản ứng chương trình nhiệt thiết lập 59 9.5.4 Phân tích kết 59 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 ix 1.Khảo sát quy trình ly trích DNA 60 2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 63 2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống .63 2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green .65 3.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO 71 3.1.Xây dựng đường chuẩn: .71 3.2.Đánh giá kết định lượng 74 4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả định lƣợng phƣơng pháp Real-Time PCR 76 4.1.Độ nhạy phương pháp: 76 4.2.Độ xác phương pháp 78 5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 85 1.Kết luận 85 2.Đề nghị 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 92 x ... Thủy, em định chọn đề tài khoá luận tốt nghiệp là: Bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen phương pháp Real-Time PCR Mục đích yêu cầu Mục đích - Xây dựng quy trình định lượng. .. tắc định lượng dựa DNA 18 6.1.2 Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen châu Âu 19 6.1.2.1 Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 19 6.1.2.2 Quá trình định lượng sản phẩm biến. .. Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa promoter 35S phương pháp Real-Time PCR Đánh giá khả định lượng hiệu phương pháp Định lượng số mẫu bắp thực phẩm có chứa bắp