Xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-time PCR

Xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-time PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỮU TRƯỞNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Th.S NGUYỄN THÁI THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005

LỜI CẢM TẠ

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, nhận xét và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Thái Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều, cũng như đã cho em những lời khuyên quý giá để hoàn thành khóa luận Em xin gửi đến thầy lời biết ơn chân thành nhất

Thầy Phương, chị Kim Anh, anh Luân (công ty Bio-Rad) đã giúp đỡ em thực hành và nắm vững phương pháp Real-Time PCR

Em xin gởi lời cám ơn đến thầy Bùi Văn Lệ, anh Vũ, chị Liên, anh Nam cùng với các anh chị và các bạn đang làm việc tại phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (Lab B), trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn và dành cho em những tình cảm quý giá trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Con xin gửi lòng tri ân đến Ba, Mẹ, em Thành và những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất

Xin cảm ơn tất cả bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học K27 đã cùng tôi chia sẻ biết bao buồn vui cũng như đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt những năm tháng dưới mái trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Xin chân thành cảm ơn bạn Khánh Đan đã luôn động viên, giúp đỡ và dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người Sinh viên Nguyễn Hữu Trưởng

TÓM TẮT

Nguyễn Hữu Trưởng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Đình Đôn và Th.S Nguyễn Thái Thủy

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S bằng phương pháp Real-Time PCR Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của phương pháp Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp trên thị trường Tp Hồ Chí Minh và phụ cận

Đề tài đã có những kết quả sau:

Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen:

- Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp Quy trình đề nghị: dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein:

phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol

- Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I

Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC

- Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa trên promoter 35S Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman

Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát hiện và định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác một mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước

- Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam có sản phẩm chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau

Instructors: Le Dinh Don and Nguyen Thai Thuy

Recently, GMO is a controversial problem in the world Because its advantages and disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its affects to environment and human health For this purpose, methods for GMOs detection and quantification in order to determine the percentage ratio of GMO presentation in food and feed need to be developed So, in this thesis, a process for GMO quantification will be researched and established by Real-Time PCR method, one of the most exactly methods for GMO quantification now

Purpose: Establishing a process of GM maize quantification based on CaMV 35S

promoter by Real-Time PCR method Evaluating quantification ability and efficiency of method Applying it for quantification some of food and feed derived from maize in Ho Chi Minh City

Results: A process of GM maize quantification by Real-Time PCR method:

- Step 1: DNA extraction:

Cell wall destruction solution: CTAB 2%

Protein denaturalization solution: phenol/chloroform DNA precipitation solution: Isopropanol

- Step 2: GM maize screening based on 35S promoter Method: Real-Time PCR with SYBR Green I dye

Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 86- 86,5oC)

- Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman

Quantification ability: Detection and quantification 1 copy of p35S in a experiment template, exactly quantification a template which percentage ratio of GMO presentation has known

- Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO in its ingredients

Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been

established and can be applied to many other species

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) 3

2 Quá trình tạo sinh vật GMO 3

3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen 8

4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới 9

4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới 11

5.Ảnh hưởng bất lợi và dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 12

5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 14

6 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới 16

6.1.Quy định tại châu Âu [33]: 17

6.1.1 Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA 18

6.1.2 Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu 19

6.1.2.1 Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 19

6.1.2.2 Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen 19

7 Tình hình Việt Nam 21

7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen 21

7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen 21

8 Các phương pháp định lượng sản phẩm chuyển gen 22

8.4.3 Phân tích dữ liệu Real-time PCR 30

8.4.4 Tính toán hàm lượng GMO 31

8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen [9][44]328.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên promoter 35S .34

8.6.1 Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S 34

8.6.2 Định lượng GMO đựa trên promoter 35S 35

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 36

1.Nội dung nghiên cứu 36

2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm 36

2.2.Thời gian thực hiện 36

5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích 41

6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 41

6.5.2 Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại 43

6.5.3 Phát hiện sản phẩm khuếch đại 44

7.5.1.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S 47

7.5.1.2 Đánh giá kết quả định lượng 48

7.5.2 Thành phần phản ứng PCR 48

7.5.2.1 Đặc điểm 35S master mix 49

7.5.2.2 Đặc điểm SYBR Green I Supermix 49

7.5.4 Cài đặt phần mềm điều khiển 50

7.5.5 Phân tích kết quả thí nghiệm 51

8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR 54

8.5.1 Đặc điểm 35S và corn-reference master mix 55

8.5.2 Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference calibration DNA standards) 55

1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA 60

2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 63

2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống 63

2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green 65

3.Thí nghiệm 3: Xác định phương pháp định lượng GMO 71

3.1.Xây dựng đường chuẩn: 71

3.2.Đánh giá kết quả định lượng 74

4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR 76

4.1.Độ nhạy của phương pháp: 76

CHỮ VIẾT TẮT

CT : Threshold cycle

dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates

ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay FAO: Food and Agriculture Organization GMOs: Genetically modified organisms GMP: Genetically modified plant

PCR : Polymerase chain reaction QC-PCR : Quantitative competitive PCR

DANH MỤC HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Quy trình chuyển gen [17] 4

Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46] 5

Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16] 5

Hình 2.4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17] 9

Hình 2.5: Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu [20] 10

Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18] 10

Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19] 11

Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27] 15

Hình 2.9: Không yêu cầu dán nhãn [42] 19

Hình 2.10: Bắt buộc phải dán nhãn [42] 19

Hình 2.11: Quy trình kiểm soát GMO tại châu Âu [13] 20

Hình 2.12 : QC-PCR 23

Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] 25

Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43] 26

Hình 2.15: Máy Real-Time PCR [8] 27

Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14] 28

Hình 2.17: Đường chuẩn cho phản ứng định lượng [14] 30

Hình 4.1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích 60

Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm 61

Hình 4.3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phương pháp 1 64

Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng 65

Hình 4.5: Đồ thị DNA quantification của các mẫu thí nghiệm 66

Hình 4.6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng 67

Hình 4.7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm 67

Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phương pháp 71

Hình 4.9: Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu chuẩn 35S 72

Hình 4.10: Đồ thị Melt curve các mẫu chuẩn 35S của phương pháp 1 73

Hình 4.11: Đồ thị Melt curve của phương pháp SYBR Green I ở thí nghiệm 3 75

Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy 76

Hình 4.13: Đồ thị định lượng p35S của các mẫu thí nghiệm 78

Hình 4.14: Đường chuẩn phản ứng định lượng p35S 79

Hình 4.15: Đồ thị định lượng gen tham chiếu của các mẫu thí nghiệm 79

Hình 4.16: Đường chuẩn phản ứng định lượng gen tham chiếu 79

DANH MỤC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Một số giống bắp được cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) 11

Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen 17

Bảng 3.1: Mẫu thí nghiệm 38

Bảng 3.2: Các quy trình ly trích 39

Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Công ty Proligo) [31] 42

Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2 42

Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2 43

Bảng 3.6: Chương trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2 43

Bảng 3.7: Phương pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2 44

Bảng 3.8: Chương trình nhiệt phân tích Melt curve 44

Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29] 47

Bảng 3.10: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 3 48

Bảng 3.11: Chương trình nhiệt của 2 phương pháp 49

Bảng 3.12: Lượng lý thuyết (Số lượng phân tử) của hai chuẩn 55

Bảng 3.13: Xác định độ nhạy phương pháp Real-Time PCR 56

Bảng 3.14: Thành phần phản ứng Real-Time PCR trong thí nghiệm 4 57

Bảng 3.15: Chương trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR (mẫu dò Taqman) 57

Bảng 4.1: Kết quả đo OD 3 quy trình ly trích DNA 60

Bảng 4.2: Kết quả tách chiết DNA các mẫu 62

Bảng 4.3: Các mẫu ly trích đạt kết quả tốt 63

Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 1 64

Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc các mẫu đối chứng trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 65

Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc các mẫu thí nghiệm trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 66

Bảng 4.7: Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu thí nghiệm 68

Bảng 4.8: So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trong thí nghiệm 2 69

Bảng 4.9: Chu kỳ phát hiện mẫu chuẩn của 2 phương pháp 71

Bảng 4.10: Các thông số xây dựng đường chuẩn 72

Bảng 4.11: Kết quả thu nhận từ 2 phương pháp trong thí nghiệm 3 74

Bảng 4.12: Kết quả định lượng mẫu 1 copy 77

Bảng 4.13: Kết quả định lượng mẫu Bt 176 1% 78

Bảng 4.14: Các thông số kết quả của thí nghiệm 80

Bảng 4.15: Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm 81

Bảng 4.16: Độ lệch tiêu chuẩn chu kỳ phát hiện của mẫu (CT Standard Deviation) 81

Bảng 4.17: Kết quả định lượng các mẫu thí nghiệm (2 lần lặp lại) 82

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề

Hiện nay, cùng với xu thế hoà nhập vào nền kinh tế thế giới, việc xuất nhập khẩu các sản phẩm nông sản đã trở nên phổ biến ở nước ta Điều này giúp cho nguồn thực phẩm cung cấp trong nước trở nên phong phú hơn, cho phép người dân lựa chọn và sử dụng nhiều loại thực phẩm mới có chất lượng cao, phẩm chất tốt, góp phần nâng cao dinh dưỡng trong bữa ăn của người Việt Nam Bên cạnh đó, nông sản cũng là một mặt hàng xuất khẩu chính, đem lại nguồn thu ngoại tệ đáng kể cho nước ta trong thời gian qua Trong quá trình xuất nhập khẩu các mặt hàng này, các biện pháp quản lý cũng như các phương pháp giúp xác định nguồn gốc nông sản nhằm đảm bảo các chỉ tiêu an toàn về sức khỏe và môi trường là rất quan trọng Điều này xuất phát từ một thực tế là sự phát triển ngày càng cao của công nghệ sinh học và công nghệ gen cho phép ta có thể dễ dàng biến đổi, cải tạo vật chất di truyền sinh vật, bổ sung các tính trạng mới theo ý muốn nhằm mục đích làm cho cây trồng, vật nuôi ngày càng có phẩm chất và chất lượng tốt hơn Tuy nhiên việc các sinh vật biến đổi gen (GMOs) này có thể gây ra các tác động xấu đến môi trường và sức khoẻ người tiêu dùng khi sử dụng chúng hay không là việc ta không thể nào kiểm soát được Vì vậy, trên thế giới, đặc biệt là tại Châu Âu, chính phủ các nước đã triển khai nhiều biện pháp kĩ thuật nhằm phát hiện và định lượng được những biến đổi trên vật chất di truyền (DNA) cây trồng, vật nuôi do tác động của các kĩ thuật công nghệ sinh học Mục đích là kiểm soát và ngăn ngừa các tác động xấu có thể có của các sản phẩm biến đổi gen đồng thời cho phép người tiêu dùng lựa chọn sử dụng các nông sản truyền thống (không biến đổi vật chất di truyền) hay các nông sản đã được biến đổi di truyền Trong số các kĩ thuật đã được các nước trên thế giới ứng dụng, có thể nói Real-time PCR là một trong những kĩ thuật cho phép phát hiện và định lượng được những thay đổi trên DNA sinh vật một cách chính xác nhất Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rất rộng rãi trên thế giới và gần như là một qui trình bắt buộc phải thực hiện trong việc phát hiện và định lượng các sản phẩm GMO trước khi cấp phép lưu hành trên thị trường, đặc biệt là tại các quốc gia Châu Âu Do tác động của các qui định này, các sản phẩm nông nghiệp của nước ta trong tương lai khi tham gia vào thị trường thế giới, bắt buộc phải trải qua bước kiểm tra GMO

trước khi được cấp phép Thực tế này đòi hỏi nước ta phải sớm xây dựng được một qui trình kiểm tra, phát hiện và định lượng các sản phẩm GMO xuất nhập khẩu ở nước ta Mặc dù đây là một vấn đề còn mới mẻ nhưng thiết nghĩ điều này sẽ rất cần thiết trong tương lai một khi nước ta hoà nhập vào nền kinh tế toàn cầu, đặc biệt là Tổ chức Thương mại Thế giới (WTO) Vì lý do đó, được sự cho phép của thầy Lê Đình Đôn và

thầy Nguyễn Thái Thủy, em quyết định chọn đề tài khoá luận tốt nghiệp là: Bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-Time PCR

2 Mục đích và yêu cầu Mục đích

- Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên trình tự promoter 35S

- Định lượng promoter 35S trên một số sản phẩm bắp và thực phẩm có chứa bắp hiện diện trên thị trường

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism)

Vào thế kỷ 20, sinh học đã có những bước tiến vượt bậc trong việc nghiên cứu sinh học phân tử ở mức độ DNA và protein Các tiến bộ này đã được ứng dụng vào thực tiễn và phát triển thành một công nghệ mới, đó là công nghệ gen, bao gồm: các kỹ thuật tái tổ hợp DNA và chuyển nạp gen Chúng thật sự là những bước đột phá của nhân loại trong lĩnh vực sinh học hiện đại, mở ra những chân trời mới với những khám phá và ứng dụng vô tận cho cuộc sống và lợi ích của con người

Một trong các ứng dụng đó chính là việc tạo ra các sinh vật biến đổi gen genetically modified organism), đặc biệt là cây trồng biến đổi gen (GMP-genetically modified plant) Với các ưu điểm nổi bật, các giống thực vật này khi ra đời đã góp phần nâng cao chất lượng và sản lượng lương thực, thực phẩm, một vấn đề cấp bách của nhân loại

(GMO-Hiện nay, trên thế giới có nhiều định nghĩa khác nhau về sinh vật biến đổi gen (GMO) Tuy nhiên, hầu hết chúng được định nghĩa là những sinh vật mà vật chất di truyền của chúng đã được biến đổi theo những cách không xảy ra trong tự nhiên như các quá trình lai chéo hay biến đổi tự nhiên Đối với thực vật, thuật ngữ này được dùng để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã được chuyển nạp ổn định những gen hữu ích mới bằng các kĩ thuật chuyển nạp gen và trong đa số trường hợp các gen này được biểu hiện và tổng hợp ra các sản phẩm của chúng (protein) [33]

2 Quá trình tạo sinh vật GMO Quá trình cơ bản

Sinh vật biến đổi gen là sản phẩm của những tiến bộ khoa học kĩ thuật tiên tiến nhất của con người trong công nghệ sinh học thực vật Mặc dù các kĩ thuật tạo ra chúng khá đa dạng và phức tạp, quá trình vẫn có những bước tiến hành chung để đạt được kết quả cuối cùng Để thực hiện quá trình này, những vấn đề quan trọng về cơ chế sinh lý, sinh hóa, sự điều hòa và biểu hiện gen cũng như những sản phẩm do gen đó tạo ra cần phải được chú ý và nghiên cứu nhằm đảm bảo cho sự thành công của quá trình

Hình 2.1: Quy trình chuyển gen [17]

Các bước cơ bản bao gồm:

- Ly trích acid nucleic (DNA/RNA) - Dòng hóa gen

- Thiết kế gen cho quá trình chuyển gen - Chuyển gen

- Lai backcross

Đây thật sự là một quá trình khá phức tạp và tốn kém Thời gian cần thiết cho việc phát triển một giống cây trồng chuyển gen mới phụ thuộc vào gen mong muốn, giống thực vật, nguồn gen và sự phê chuẩn của cơ quan quản lý Nó kéo dài khoảng từ 6-15 năm trước khi một dòng lai chuyển gen mới được phép thương mại hóa trên thị trường [17]

Promoter CaMV 35S

Để tạo cây chuyển gen có hiệu quả cao trong sản xuất và thương mại, việc điều hòa sự biểu hiện gen hữu ích được chèn vào trong bộ gen của cây trồng rất quan trọng Điều này được thực hiện nhờ gắn vào gen hữu ích một promoter và terminator nhằm

sử dụng, tuy nhiên trong số đó promoter CaMV 35S được sử dụng nhiều nhất do một số ưu điểm nổi bật của nó và đây cũng là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài này [16]

Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46]

Vào đầu thập niên 80, GS Chua và các cộng sự tại trường Đại Học Rockefeller đã phân lập được một promoter cho phép phiên mã toàn bộ bộ gen của Cauliflower mosaic virus (CaMV) xâm nhiễm vào củ cải Promoter này được đặt tên là CaMV 35S promoter do hệ số lắng của toàn bộ bản sao promoter là 35S Nó là một promoter cơ bản (constitutive promoter) được sử dụng rộng rãi nhất cho nhiều ứng dụng Promoter 35S là một promoter cơ bản rất mạnh, có thể hoạt hóa phiên mã trong mọi loài thực vật và cho phép biểu hiện gen ở mức độ cao trong cây hai lá mầm Tuy nhiên, nó kém hiệu quả trong cây một lá mầm, đặc biệt là trong ngũ cốc Sự khác biệt này có lẽ do những khác biệt về chất lượng, số lượng các yếu tố điều hòa [16]

Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16]

Nhằm khắc phục khuyết điểm này, promoter 35S đã được cải tiến, nâng cao hiệu quả hoạt động bằng cách thêm vào các trình tự enhancer Trình tự này dài 162 bp, từ -208 bp đến -46 bp Các nghiên cứu cho thấy, hiệu quả hoạt động phiên mã gia tăng từ 3 đến 6 lần trên cây một lá mầm được chuyển nạp nhiều bản sao vùng enhancer [16]

Về sự liên quan của promoter 35S trong việc phát hiện GMO, theo GS.TS Phạm Thị Anh Thư, tại hội thảo “Giới thiệu về sinh vật chuyển gen” do hội các phòng thí nghiệm Việt Nam (VINATEST) tổ chức ngày 5/5/2005, cho biết 95% cây chuyển gen

tại châu Âu có mang promoter 35S (p35S) và/hoặc terminator nos (Tnos) kiểm soát

trình tự gen được chuyển vào trong cây chuyển gen Khi mẫu phân tích có một trong hai trình tự này thì mẫu đó 95% là có chuyển gen, ngược lại khi kết quả mẫu phân tích không có cả hai trình tự này thì ta cũng có thể kết luận mẫu 95% không có chuyển gen Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác cũng cho thấy, nếu chỉ phát hiện có promoter 35S thì 70% đó là sản phẩm chuyển gen Điều này chứng tỏ promoter 35S có thể được sử dụng làm mục tiêu cho việc phát hiện và định lượng sinh vật biến đổi gen do sự hiện diện ở mức độ cao của nó Hiện nay, promoter 35S đang thuộc bản quyền của Đại Học Rockefeller và công ty Monsanto (Mỹ) [9] [15] [16] [29]

3 Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen

Từ buổi ban đầu, thực vật chuyển gen được tạo ra nhằm phục vụ cho những lợi ích thiết thực và mục tiêu hết sức đa dạng của con người

Ứng dụng

Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17]

Các ứng dụng này chủ yếu tập trung vào việc giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng, tăng năng suất và biến đổi các đặc tính cho phù hợp với quá trình sản xuất thực phẩm Mục đích là nâng cao độ an toàn cho các loại thực phẩm mà con người sử dụng đồng thời tạo ra các loại thực phẩm có chất lượng ngày một tốt hơn Các ứng dụng chính bao gồm:

- Chống chịu thuốc diệt cỏ: Tính trạng được ứng dụng phổ biến nhất, giúp giảm lượng thuốc diệt cỏ sử dụng và tồn dư thuốc trong cây và môi trường [17]

- Kháng sâu bọ: Cho phép cây trồng kháng sâu bọ bằng cách tạo ra các chất độc giết chết côn trùng Được ứng dụng nhiều nhất là các gen tạo độc tố Bt

từ vi khuẩn Bacillus thringensis Ưu điểm của chúng là không gây ô nhiễm

môi trường, con người và động vật bậc cao [17]

- Cây trồng bất thụ đực: Giúp sản xuất các giống nông sản lai năng suất cao [17]

- Kháng bệnh: Mục tiêu của các giống cây trồng chuyển gen này là ngăn chặn sự phát sinh bệnh do virus và nấm trên cây trồng [17]

- Ngăn chặn sự chín sớm của trái cây: Kéo dài thời gian tồn trữ và phù hợp cho sản xuất thực phẩm [17]

- Các đặc tính chất béo được thay đổi: Ứng dụng chủ yếu cho tiêu dùng và chế biến thực phẩm Mục tiêu là tăng hàm lượng các loại acid béo không bão hòa đơn và giảm acid béo không bão hòa đa trong các loaị cây lấy dầu như

canola, đậu nành, hoa hướng dương [17]

- Cố định đạm: Ứng dụng cho các giống thực vật không có khả năng cố định đạm [17]

- Nâng cao giá trị dinh dưỡng : Mục tiêu là chuyển nạp các gene mã hóa các protein có chứa hàm lượng cao các amino acid thiết yếu: lysine, tyrosine, tryptophan vào cây trồng giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng của chúng [17] - Thực phẩm chức năng: Đây là một hướng nghiên cứu tuy còn khá mới mẻ

nhưng đã hứa hẹn thành công rực rỡ trong tương lai Mục tiêu là chuyển nạp gene biểu hiện các protein kháng nguyên chống lại một số bệnh như: viêm gan B, cúm… tạo ra các loại vaccine có thể ăn được (edible vaccine) Một hướng nghiên cứu khác là chuyển nạp gen sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp quý như: dược phẩm, chất dẻo Một ví dụ nổi tiếng của thực phẩm chức năng đó là gạo vàng (Golden rice) Đây là loại gạo có hàm lượng vitamin A được tăng cao bằng cách chuyển nạp 3 gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp carotene Các nhà khoa học hy vọng gạo vàng sẽ góp phần xoá bỏ các chứng bệnh mù do thiếu vitamin A gây ra tại các nước đang phát triển [17]

Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17]

- Hoa với nhiều màu sắc và kéo dài thời gian trưng bày

- Cây trồng kháng các yếu tố môi trường: Bên cạnh cây chuyển gen kháng tác nhân gây bệnh, các cơ chế kháng các tác nhân gây stress của môi trường như: chịu lạnh, chịu hạn, chịu muối và các ion kim loại nặng cũng được

- Cây trồng giúp chuyển hóa tại các vùng ô nhiễm

Như vậy, hiện nay các ứng dụng của thực vật chuyển gen là khá đa dạng và trong tương lai các ứng dụng này hứa hẹn sẽ được tiếp tục mở rộng hơn nữa [17] [24]

Tác động có lợi của thực vật chuyển gen

Với những ưu điểm nổi bật và ứng dụng khá đa dạng như trên, cây trồng chuyển gen đã đem lại một số lợi ích đối với nông nghiệp và đời sống con người:

Làm chủ năng suất: nâng cao độ tinh sạch của hạt giống giúp nâng cao năng suất

Cho phép canh tác trên những vùng đất trước đây không thể sử dụng - Môi trường:

Giảm dư lượng phân bón nhờ cố định đạm, giảm áp lực đất trồng Giảm sử dụng thuốc trừ sâu

Chỉ thị và chuyển hóa ô nhiễm Bảo vệ môi trường sinh thái - Sức khỏe con người:

Giảm các tác động độc hại do thuốc trừ sâu gây ra với sức khỏe

Tạo ra được các loại thực phẩm mới có chất lượng tốt hơn, có khả năng chữa bệnh phục vụ cho con người

Nâng cao dinh dưỡng cho con người

Những tác động có lợi này đã giúp cho cây trồng chuyển gen được sản xuất và thương mại hóa ngày càng rộng rãi trên thế giới [17] [24]

4 Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới

Lịch sử phát triển và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen là một lịch sử phát triển khá nhanh Từ một sản phẩm cà chua Flavr Savr biến đổi gen làm chậm quá trình chín được trồng và thương mại hạn chế tại Mỹ năm 1994, đến nay, cây trồng biến đổi gen đã được trồng và thương mại hóa tại nhiều quốc gia trên thế giới Chúng không ngừng được bổ sung các chủng loại, giống cây mới cũng như những tính trạng, chức năng hữu ích mới làm phong phú thêm bộ sưu tập cây trồng chuyển gen Đồng thời, việc ngày càng nhiều quốc gia trên thế giới cũng như số lượng người nông dân tham gia trồng trọt cây chuyển gen ngày càng tăng cho thấy một số tác động tích cực do chúng mang lại

Hình 2.4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17]

Hiện nay, theo số liệu mới nhất vào năm 2004, diện tích cây chuyển gen trên toàn thế giới ước đạt 81,0 triệu ha, tăng 13,3 triệu ha so với năm 2003 (67,7 triệu ha) Như vậy chỉ trong 9 năm, từ năm 1996 đến năm 2004, diện tích cây trồng chuyển gen đã tăng hơn 47 lần, từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên đến 81,0 triệu ha năm 2004 Trong thời gian này, tỷ lệ gia tăng diện tích trồng bao giờ cũng ở mức tăng hai chữ số hàng năm, riêng năm 2004 đã là 20%, cho thấy sự phát triển hết sức nhanh chóng diện tích cây chuyển gen trên thế giới Bên cạnh đó, số quốc gia tham gia trồng cũng như số lượng người nông dân tham gia cũng đã gia tăng hết sức nhanh chóng Từ những nước khởi xướng ban đầu là các quốc gia phát triển (Mỹ, Canada) với số lượng người trồng hạn chế, đến nay số quốc gia tham gia trồng cây chuyển gen đã lên đến 17 nước với 8,25 triệu nông dân (so với 7 triệu vào năm 2003) Con số này có sự góp mặt đông đảo các quốc gia đang phát triển trên thế giới (11 quốc gia đang phát triển và 6 quốc gia phát

trồng lớn (trên 50.000 ha) cũng đã tăng lên 14 nước, với 9 nước đang phát triển và 5 nước phát triển Sự tham gia ngày càng đông đảo của các quốc gia đang phát triển (Trung Quốc, Ấn Độ, Argentina, Brasil và Nam Phi), chiếm đến 34% tổng diện tích trồng với tỷ lệ tăng hàng năm cao hơn cả các quốc gia phát triển, đã có tác động mạnh mẽ đến tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới [3][4][21]

Hình 2.5: Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu [20]

Diện tích cây chuyển gen hiện nay tại các quốc gia trồng lớn như sau:

Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18]

Với tỷ lệ gia tăng rất nhanh, trong tương lai, cây trồng biến đổi gen có thể sẽ chiếm tỷ lệ lớn trong cơ cấu cây trồng hiện đại

Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19] Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới

Bảng 2.1: Một số giống bắp đƣợc cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) [41]

- MON810 - MON863 - NK 603 - GA 21

- NK 603 X MON 810 - GA21 X MON 810 - MON863 X MON603 - Bt176 maize

- Bt 11 - DAS1507

- T25

Kháng côn trùng Kháng sâu hại

Chống chịu thuốc diệt cỏ -

Chống chịu thuốc diệt cỏ và kháng sâu hại

- -

Bắp chuyển gen Bt và chống chịu thuốc diệt cỏ

- Pioneer

Bayer

Theo báo cáo năm 2004 thì hiện nay, diện tích trồng bắp chuyển gen là 19,3 triệu ha, chiếm 23% diện tích cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới Diện tích trồng

bắp đã liên tục tăng trưởng trong những năm gần đậy, đạt tỷ lệ 27% trong năm 2003 và 25% trong năm 2004 Dự đoán diện tích này sẽ tiếp tục tăng mạnh trong thời gian tới do nhu cầu về bắp đang ngày càng tăng và có nhiều giống bắp mới đã được cấp phép

Như vậy liệu trong tương lai, cây trồng biến đổi gen có thể thay thế các loại cây trồng truyền thống để phục vụ cho nhu cầu lương thực của con người hay không? Và có thật sự là cây trồng chuyển gen chỉ mang lại những hiệu quả và tác động có lợi “thần kỳ” hay không? [3] [21]

5 Ảnh hưởng bất lợi và dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen Các rủi ro có thể gặp [34]

Quả thật, sự phát triển của cây trồng chuyển gen được thể hiện qua những con số rất đáng kể Tuy nhiên, vấn đề nào cũng có mặt trái của nó Việc được trồng và thương mại hóa ngày càng tăng tại nhiều quốc gia trên thế giới không có nghĩa là các sinh vật biến đổi gen này hoàn toàn không có một rủi ro hay tác hại nào đối với môi trường và sức khỏe con người Theo nhiều nhà khoa học trên thế giới, những rủi ro và tác hại có thể có của thực vật chuyển gen có thể do những nguyên nhân sau:

- Gen chuyển nạp chèn vào vị trí ngẫu nhiên, phá vỡ trình tự gen hiện hữu - Thiếu kiểm soát thông thường đối với gen chuyển nạp dẫn đến các gen

chuyển nạp thường biểu hiện liên tục trong mọi tế bào, kể cả sau khi được mua bán và tiêu dùng

- Hầu hết gen có nhiều chức năng và tương tác chặt chẽ Vì vậy, làm sao ta có thể kiểm soát hết tất cả các tác dụng do gen chuyển nạp tạo ra

- Sự chuyển gen ngang: Trong công nghệ gen, các gen hữu ích chuyển nạp vào cây trồng thường kèm với các vật liệu di truyền có nguồn gốc từ vi khuẩn hay virus: vector, promoter, marker Điều này gây lo ngại rằng các gen chèn vào có thể thoát khỏi sinh vật biến đổi gen và chuyển nạp vào các vi sinh vật, thậm chí là tế bào động vật có vú, gây ra các tác hại không lường được đối với sức khỏe con người

Các khuyết điểm này có thể dẫn đến những tác động có hại đến môi trường và sức khoẻ con người được liệt kê ở phần sau đây:

Tác động có hại Môi trường

Sự chuyển gen từ các thực vật biến đổi gen cho các loài thực vật tự nhiên khác gây ra các biến đổi di truyền bất thường trên các loài thực vật này [34]

Tác động xấu đến các loài không mục tiêu: các loài thực vật chuyển gen kháng sâu hại có thể tác động xấu đến các loài sinh vật và côn trùng có lợi khác [34]

Gia tăng việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp: Trái với mong đợi, báo cáo năm 1999 tại Mỹ cho thấy, nông dân trồng đậu nành biến đổi gen Roundup Ready gia tăng sử dụng thuốc hóa học từ 2 đến 5 lần so với nông dân trồng đậu nành thông thường Trong năm 2001-2002, lượng thuốc hóa học sử dụng đã tăng 70 tỷ pound tại Mỹ Điều này gây ra lo ngại về dư lượng thuốc hóa học trong các sản phẩm nông nghiệp [12]

Sự hình thành “siêu cỏ dại”: các nghiên cứu cho thấy, các gen kháng thuốc diệt cỏ có thể phóng thích khỏi cây trồng biến đổi gen và chuyển vào các loại cây trồng, cỏ dại khác tạo nên một loại “siêu cỏ dại” có khả năng kháng một hay nhiều loại thuốc diệt cỏ Điều này sẽ gây ra rất nhiều khó khăn trong việc phòng trừ cỏ dại trong thời gian tới [34]

Sự hình thành “siêu côn trùng” kháng lại các tác nhân biến đổi gen gây độc được

tạo ra (Bt) Điều này có thể gây ra rất nhiều khó khăn trong việc phòng trừ sâu hại

[23][34]

Sức khoẻ người tiêu dùng

Các tác nhân dị ứng mới: Công nghệ gen cho phép biểu hiện các gen chuyển nạp bắt nguồn từ nhiều loại sinh vật khác loài: virus,vi khuẩn Các loại protein mới này có thể gây ra các triệu chứng dị ứng trên con người

Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Việc tạo ra cây trồng kháng thuốc trừ cỏ cho phép sử dụng thuốc trừ cỏ trên cây đang trong giai đoạn phát triển Điều này vốn bị cấm trước đây do người tiêu dùng có thể bị ảnh hưởng bởi dư lượng thuốc trừ cỏ trong thực phẩm họ sử dụng Điều không thể phủ nhận là tỷ lệ hồi chuyển từ dạng thuốc trừ cỏ bị phân hủy về dạng độc nguyên thủy đã lên đến 10% trong hệ tiêu hóa

Các gen kháng kháng sinh làm marker trong thực phẩm biến đổi gen có thể chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột gây ra những vấn đề nghiêm trọng với các tác nhân gây bệnh kháng kháng sinh

Tạo ra các loại chất độc mới do các tương tác không kiểm soát được giữa các sản phẩm biến đổi gen và các phần tử khác [24][34]

Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể

- Cà chua Flavr Savr: Gây ra những thương tổn cho chuột (7 trong số 40 con chuột thí nghiệm đã chết sau 15 ngày) Chúng đã bị cấm bán trên thị trường - Khoai tây biến đổi gen: thí nghiệm của Dr Arpad Pusztai (Viện nghiên cứu

Rowett) cho thấy thương tổn trong hệ tiêu hóa chuột khi ăn khoai tây biến đổi gen chứa gen sản xuất lectin Các con chuột này không bị ảnh hưởng khi chỉ ăn khoai tây không biến đổi gen hay ăn lectin

- Bắp biến đổi gen (Chardon LL): Trong nghiên cứu của công ty, số gà chết khi ăn bắp này gấp đôi số gà chết khi ăn thức ăn không biến đổi gen (10 con so với 5 con)

- Nghiên cứu của Đại học Newcastle về chuyển nạp gen: Kết quả cho thấy khi ăn thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen có hiện tượng gen chuyển nạp thoát ra và chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột

- L-tryptophan: Thực phẩm biến đổi gen bổ sung chất này đã gây ra 37 trường hợp tử vong và ít nhất 1500 trường hợp tàn tật tại Mỹ do một chất độc không xác định được Công ty sản xuất đã bồi thường 2 tỷ USD cho trên 2000 nạn nhân [34]

Dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen

Bên cạnh những ý kiến tranh cãi hết sức gay gắt của các nhà khoa học, dư luận xã hội về vấn đề cây trồng biến đổi gen cũng hết sức phức tạp do lương thực, thực phẩm là một vấn đề có tác động to lớn đối với đời sống con người Có nhiều ý kiến ủng hộ nhưng cũng không thiếu những ý kiến phản đối hết sức gay gắt

Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27]

Hiện nay, các Tổ chức bảo vệ môi trường (Greenpeace, Friends of the Earth…) và người dân tại nhiều quốc gia trên thế giới đã phản đối hết sức gay gắt cây trồng biến đổi gen và các công ty nông nghiệp Sự phản đối này bắt nguồn từ các nguyên nhân sau:

- Các tác động xấu tiềm năng do thực vật biến đổi gen gây ra cho môi trường và sức khoẻ con người

- Các công ty thiếu trách nhiệm trong việc nghiên cứu những ảnh hưởng của chúng lên con người

- Cây trồng biến đổi gen sẽ gây ra tình trạng lệ thuộc vào hạt giống và thuốc hóa học của các công ty nông nghiệp [27]

Tại châu Âu, những phản đối này đã dẫn đến việc thành lập những khu vực „Không GMO„ (GMO free zone) tại nhiều quốc gia châu Âu (22 khu vực vào năm 2003) và các công ty thực phẩm tại châu Âu đã tuyên bố không sử dụng sản phẩm biến đổi gen làm nguyên liệu thực phẩm Thái độ của người dân châu Âu cũng được thể hiện rõ qua cuộc thăm dò dư luận do Eurobarometer thực hiện vào tháng 12 năm 2001: - 94,6 % muốn có quyền lựa chọn sản phẩm truyền thống hay sản phẩm biến

đổi gen

- 85,9 % muốn được thông tin nhiều hơn trước khi sử dụng GMO - 70,9 % không muốn sử dụng thực phẩm biến đổi gen

Trước đó, một nghiên cứu vào năm 1996 cũng cho thấy:

- 74% công dân châu Âu ủng hộ việc dán nhãn thực phẩm biến đổi gen

- 53% tin rằng các biện pháp quản lý không đủ để bảo vệ người tiêu dùng khỏi các rủi ro do thực phẩm biến đổi gen mang lại

Các kết quả trên cho thấy người dân tại châu Âu và nhiều quốc gia trên thế giới đòi hỏi chính phủ phải có các biện pháp quản lý thích hợp các sản phẩm biến đổi gen vì lợi ích của cộng đồng [27][28]

6 Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới

Hiện nay, việc quản lý các sinh vật biến đổi gen trên toàn cầu được qui định bằng Nghị định thư An toàn sinh học Cartagena (Liên Hiệp Quốc ban hành và có hiệu lực từ ngày 11/9/2003) Đây là văn bản đầu tiên trên thế giới xác định các sinh vật biến đổi gen là khác biệt so với các sinh vật thông thường khác, vì vậy cần có các biện pháp quản lý riêng biệt Một trong những điểm chính của Nghị định là việc quản lý sự lưu hành của sinh vật biến đổi gen trên thế giới, qua đó kiểm soát việc phóng thích vào môi trường và thương mại hóa các sinh vật đặc biệt này Dù còn nhiều hạn chế, đây là một tiến bộ của thế giới trong việc đạt sự đồng thuận về vấn đề sinh vật biến đổi gen [26]

Bên cạnh Nghị định thư, các nước còn ban hành các văn bản quản lý vấn đề sinh vật biến đổi gen Hiện nay, qui định của các quốc gia trên thế giới rất đa dạng và khác biệt tùy theo tình hình thực tế tại mỗi nước Hầu hết các nước đều ban hành những quy định cụ thể nhằm quản lý việc xuất nhập khẩu và thương mại hóa các sản phẩm biến đổi gen Một điểm chính trong các quy định là yêu cầu dán nhãn các sản phẩm biến đổi gen được thương mại hóa Bên cạnh việc quản lý, quy định này còn giúp người tiêu dùng phân biệt được sản phẩm biến đổi gen với các sản phẩm truyền thống không biến đổi gen khác, qua đó cho phép họ lựa chọn việc sử dụng sản phẩm nào là thích hợp nhất Trong việc dán nhãn, điều quan trọng nhất là việc xác định mức ngưỡng Mức ngưỡng này biểu thị sự hiện diện của thành phần biến đổi gen (do ngẫu nhiên hay không thể loại bỏ được) trong một loại thực phẩm hay thức ăn được thương mại hóa Nếu thành phần biến đổi gen này vượt quá mức ngưỡng cho phép, sản phẩm đó phải được dán nhãn Tuy nhiên, mức ngưỡng quy định và yêu cầu dán nhãn rất khác biệt ở các nước Ta có thể điểm qua một số quốc gia sau đây:

Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen [10]

Quốc gia Qui định về dán nhãn

Mức ngƣỡng cho sự hiện diện vật liệu chuyển gen trong thực phẩm (%)

Úc & New

Nhìn vào bảng thống kê trên ta thấy, ngoại trừ 3 quốc gia Mỹ, Canada và Argentina là không bắt buộc dán nhãn sản phẩm biến đổi gen cũng như không quy định mức ngưỡng cụ thể, hầu hết các quốc gia trên thế giới đều có quy định cụ thể về mức ngưỡng và việc dán nhãn bắt buộc (còn có Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ, Nga, Phillipines, Ả rập Saudi, Đài Loan, Thái Lan…) Trong đó, khắt khe nhất là châu Âu [10]

Quy định tại châu Âu [33]:

Châu Âu là nơi đã ban hành những quy định sớm nhất và chặt chẽ nhất về vấn đề sinh vật biến đổi gen (từ năm 1990) nhằm bảo vệ người tiêu dùng và môi trường Hiện nay, các văn bản quy định hiện hành bao gồm:

- Chỉ thị 2001/18/EC (Directive 2001/18/EC) - Chỉ thị 98/81/EC (Council Directive 98/81/EC) - Quy định 258/97 (EC) (Regulation (EC) No 258/97) - Quy định 1829/2003 (EC) (Regulation (EC) 1829/2003) - Quy định 1830/2003 (EC) (Regulation (EC) 1830/2003)

Các văn bản này quản lý và quy định việc thử nghiệm và cấp phép thương mại các sinh vật biến đổi gen rất chặt chẽ, đặc biệt những mức ngưỡng mới, nhỏ hơn cho việc dán nhãn đã được qui định trong thời gian gần đây Mức ngưỡng 1% cũ cho tỷ lệ gen chuyển nạp của những sản phẩm GMO đã được cấp phép đã giảm xuống ở mức 0,9% Thêm vào đó, đối với những sản phẩm biến đổi gen chuẩn bị được cấp phép, tỷ lệ gen chuyển nạp được qui định là 0,5% Cộng đồng châu Âu xác định người tiêu dùng có quyền được thông tin và việc dán nhãn như là một công cụ để có sự lựa chọn chính xác Từ năm 1997, việc dán nhãn để thông báo sự hiện diện của GMO hay thực phẩm biến đổi gen là bắt buộc Vì những lý do đó, châu Âu xác định sự cần thiết phải phát triển các phương pháp phân tích Chúng không chỉ phát hiện sự hiện diện có thể xảy ra của GMO trong thực phẩm mà còn giúp xác định một sản phẩm biến đổi gen đặc biệt và định lượng hàm lượng của GMO trong những thành phần thực phẩm và thức ăn khác nhau

Nguyên tắc định lƣợng dựa trên DNA

Theo quy định châu Âu, những sản phẩm được phát hiện có thành phần biến đổi gen sẽ phải trải qua bước định lượng để xác định tỷ lệ phần trăm thành phần biến đổi gen hiện diện trong đó Tỷ lệ phần trăm được tính bằng cách chia số lượng trình tự đặc

trưng của GMO cho số lượng một gen đặc trưng của loài thực vật đó (ví dụ: gen lectin ở đậu nành; gen invertase, zein ở bắp) Công thức này có thể biểu diễn như sau:

GMO(%)= (số lượng trình tự GMO/số lượng gen đối chiếu) x 100

Việc dán nhãn không bắt buộc đối với những sản phẩm có chứa nguyên liệu từ GMO chiếm tỷ lệ không hơn 0,9% thành phần nguyên liệu đó Tất cả các thành phần (bột, dầu, bơ…) bắt nguồn từ một loài (ví dụ: bắp, đậu nành…) được gộp lại và xem là một thành phần đơn [42]

Ví dụ, hình 2.9 không yêu cầu phải dán nhãn do tỷ lệ bắp chuyển gen chỉ chiếm 0,6% trên tổng thành phần bắp, tương tự như đậu nành Tuy nhiên, trong hình 2.10 ta thấy tổng tỷ lệ phần trăm 2 loại bắp chuyển gen là Bt11 và Bt 176 là 0,6%+0,6% =1,2% lớn hơn mức ngưỡng 0,9% Vì vậy loại thực phẩm này bắt buộc phải dán nhãn

Hình 2.9: Không yêu cầu dán nhãn [42]

mẫu thí nghiệm Trong số này, promoter 35S và terminator nos là hai đối tượng được

kiểm tra nhiều nhất do chúng hiện diện phần lớn trong các sản phẩm biến đổi gen [31][32][37]

Quá trình định lƣợng sản phẩm biến đổi gen

Quá trình định lượng nhằm xác định chính xác tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một mẫu sản phẩm, đây là cơ sở cho việc áp dụng các quy định dán nhãn cho mẫu sản

phẩm Các đối tượng được định lượng có thể là p35S, tnos hay chính xác gen chuyển

nạp Việc định lượng p35S và tnos trong các mẫu sản phẩm hỗn hợp nhiều thành phần

có thể không chính xác do chúng hiện diện trong rất nhiều sản phẩm biến đổi gen khác nhau, do đó kết quả định lượng chỉ là kết quả tổng Vì vậy, việc định lượng thường được tiến hành trên những đối tượng riêng biệt cho mẫu sản phẩm đó, như: gen chuyển nạp, trình tự nối giữa promoter và gen chuyển nạp Tại châu Âu, gen chuyển nạp đã đăng ký và chưa đăng ký được áp dụng 2 mức ngưỡng khác nhau (0,9 % và 0,5%) [37][42]

Hình 2.11: Quy trình kiểm soát GMO tại châu Âu [13]

Như vậy, nhìn trên Hình 2.11 ta thấy quy trình quản lý và kiểm tra này được thực hiện khá hoàn chỉnh và chặt chẽ từ khâu đầu đến khâu cuối, áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm và thức ăn được sản xuất và xuất nhập khẩu tại châu Âu (ở đây chỉ là ví dụ ở bắp và đậu nành, hai loại nông sản chuyển gen chính) Điều này cũng đặt ra những thách thức và rào cản đối với nông sản của các nước khi muốn tham gia vào thị

trường rộng lớn này Đồng thời, xu hướng quản lý chặt chẽ các sản phẩm biến đổi gen ngày càng được chú trọng trên thế giới Đây là một vấn đề mà các quốc gia xuất khẩu nông sản chính, trong đó có Việt Nam cần phải quan tâm

7 Tình hình Việt Nam

Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen

Là một phần quan trọng trong chiến lược phát triển công nghệ sinh học của nước ta, chính phủ đã đầu tư khá lớn (1,5-2 triệu USD hàng năm) cho việc nghiên cứu phát triển các giống cây trồng biến đổi gen Các cơ quan tham gia nghiên cứu và phát triển có thể kể đến là: Viện Công nghệ sinh học, Viện Di truyền nông nghiệp, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long Các giống cây trồng đã được quan tâm nghiên cứu có thể kể đến như: gạo, bắp, đu đủ, bông vải, hoa và một số cây lấy gỗ khác Với sự đầu tư lớn và tập trung nghiên cứu, nước ta đã đạt được một số thành quả nhất định trong

chuyển gen: gạo, bắp mang gen Bt, đu đủ kháng virus Mặc dù các thành tựu còn khá

khiêm tốn, nhưng hứa hẹn khả năng ứng dụng to lớn trong tương lai [38]

Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen

Tại nước ta chính thức thì chưa có một loại cây trồng biến đổi gen nào được thương mại hóa Tuy nhiên, các giống nông sản được trồng hiện nay như: bắp, đậu nành, bông vải, đa phần là các giống nước ngoài Hầu hết chúng đều có năng suất cao, chất lượng tốt nhưng chúng cũng mang một số tính trạng nghi ngờ là chuyển gen như: kháng thuốc diệt cỏ, hạt giống không sử dụng được cho vụ sau Vấn đề là do chưa có một văn bản pháp luật kiểm soát chính thức nên vấn đề quản lý gặp rất nhiều khó khăn Mặc khác, do không có sự thông tin đầy đủ dẫn đến hiện tượng người nông dân trồng tràn lan các giống nông sản gây ra tình trạng lẫn lộn giữa các giống chuyển gen và không chuyển gen Đây là vấn đề nghiêm trọng, có thể gây ra các tác hại không lường được đối với môi trường và sức khỏe người tiêu dùng khi ta sử dụng các giống này Đồng thời, việc thiếu một văn bản pháp lý hoàn chỉnh cũng gây ra không ít khó khăn khi ta muốn xuất khẩu nông sản sang các nước khác, đặc biệt là thị trường châu Âu, vốn đòi hỏi rất khắt khe về vấn đề này

Nhận thức được điều đó, nước ta đã tích cực hợp tác với quốc tế trong vấn đề an toàn sinh học và xây dựng bộ luật riêng ở Việt Nam Vào tháng 2/2002, nước ta là một trong 10 nước tham gia vào dự án: “Xây dựng năng lực an toàn sinh học cho các giống cây trồng biến đổi di truyền (GM) tại châu Á” do chính phủ Nhật Bản tài trợ chính thông qua tổ chức Lương Nông Liên Hiệp Quốc (FAO) Đồng thời, vào năm 2003, nước ta cũng đã chính thức tham gia vào Nghị định thư An toàn sinh học Cartagena Từ năm 1999, nước ta cũng đã bắt đầu xây dựng quy chế nhằm kiểm soát, quản lý cây trồng biến đổi gen Tuy nhiên, đến năm 2004, quy chế này vẫn chưa hoàn thành Bên cạnh đó, nhằm phục vụ cho nhu cầu kiểm tra các sản phẩm biến đổi gen sản xuất và xuất khẩu, một số trung tâm nghiên cứu cũng đã trang bị các loại máy móc hiện đại (Real-time PCR) phục vụ cho việc định lượng GMO, như: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (Quatest3), Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm (số 2, Nguyễn Văn Thủ), ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh, ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Điều này cho thấy nhu cầu phát hiện và định lượng GMO đã xuất hiện ở nước ta xuất phát từ yêu cầu khắt khe của các đối tác nước ngoài trong việc nhập khẩu nông sản Việt Nam sản xuất Tình hình đó đòi hỏi việc tập trung nghiên cứu và phát triển các phương pháp xét nghiệm theo tiêu chuẩn quốc tế Vì vậy, Khóa luận tốt nghiệp này xuất phát từ yêu cầu đó [2][5][6]

8 Các phương pháp định lượng sản phẩm chuyển gen

Việc xác định mức ngưỡng cho các sản phẩm biến đổi gen đặt ra yêu cầu xây dựng các phương pháp định lượng thật chính xác làm cơ sở cho việc dán nhãn các sản phẩm này Hiện nay, các phương pháp này được chia thành 2 nhóm sau:

Nhóm 1: Phương pháp dựa trên việc khuếch đại nucleotide (PCR-based method)

- Quantitative competitive PCR (QC-PCR) - Real-time PCR

Nhóm 2: Phương pháp dựa trên protein (Protein-based method) - Kĩ thuật ELISA

Phương pháp ELISA

Kỹ thuật này sử dụng một kháng thể để phát hiện các protein mục tiêu Protein được liên kết chặt chẽ với một tấm plastic Kháng nguyên liên kết với kháng thể và tạo thành một phức hợp ổn định, có thể được hình dung là liên kết với một kháng thể thứ hai với một enzyme Thuận lợi của phương pháp này là có khả năng phân tích dựa vào đường chuẩn [24]

Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42]

Đây là kỹ thuật căn bản dựa trên sự đồng khuếch đại gen mục tiêu và một mẫu thứ hai – tác nhân cạnh tranh Sản phẩm khuếch đại sẽ có cường độ phát quang tương ứng với số lượng DNA được khuếch đại và chúng sẽ xuất hiện hai dãy khác nhau trên gel agarose với cường độ khác nhau Vì thế, các dãy thu được có thể xác định được số lượng ban đầu của DNA mục tiêu Phương pháp này có khả năng phát hiện một cách đơn giản và bán định lượng được sản phẩm biến đổi gen trong thực phẩm [42]

Hình 2.12 : QC-PCR

Tuy vậy, hai phương pháp này đều có ưu khuyết điểm riêng Kỹ thuật ELISA có thể cho phép định lượng sự hiện diện sản phẩm biến đổi gen với tỷ lệ từ 0,3% đến 5%, tuy nhiên khuyết điểm lớn nhất của nó là kĩ thuật này chỉ áp dụng được cho các mẫu sản phẩm thô, chưa chế biến do protein có thể bị biến tính ở nhiệt độ cao Nghiên cứu cho thấy kĩ thuật này chỉ có hiệu quả khi mẫu sản phẩm chế biến ở nhiệt độ nhỏ hơn 65oC trong thời gian dưới 60 phút, đây là giới hạn giữ cho protein không bị biến tính Tuy nhiên, đối tượng chính của việc định lượng lại là các sản phẩm thực phẩm và thức ăn đã chế biến Hầu hết chúng đều trải qua quá trình chế biến với nhiệt độ cao trong thời gian khá dài (đặc biệt là các sản phẩm tinh luyện) nhằm diệt khuẩn và giữ chất lượng sản phẩm Chính điều này đã hạn chế khá lớn phạm vi áp dụng của kĩ thuật

qua quá trình chế biến khắc nghiệt, giúp cho việc định lượng chúng Trong các kĩ thuật định lượng bằng PCR, kĩ thuật QC-PCR xuất hiện từ sớm, tuy nhiên chúng mang nhiều khuyết điểm như độ chính xác không cao, khó khăn trong thiết kế Trong khi đó, kĩ thuật Real-time PCR với các ưu điểm là độ chính xác cao, có thể xác định sự hiện diện GMO trong thực phẩm ở tỷ lệ thấp, đồng thời kĩ thuật này được tiến hành khá đơn giản, trong thời gian ngắn Những ưu điểm này giúp Real-time PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới [42]

Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR

Real-Time PCR được xem là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm Khác với việc định lượng khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng số lượng DNA ngay khi phản ứng đang xảy ra (đây là ý nghĩa của từ ”Real-Time”) Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất định Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỷ lệ thuận với mỗi chu kỳ khuếch đại thành công của phản ứng Real-Time PCR Như vậy, bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng Và sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu

Hiệu quả của kỹ thuật Real-Time PCR dựa trên cả hóa chất dùng để định lượng và kiểm soát phản ứng khuếch đại và công cụ để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang [42]

Hóa chất định lƣợng

Có nhiều loại hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real-Time PCR cho việc định lượng DNA Chúng có thể chia thành 2 loại chính:

- Thuốc nhuộm xen giữa DNA: ethidium bromide, SYBR Green I

- Mẫu dò lai: Taqman, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular Beacons, Scorpions và Taqman Minor Groove Binder

SYBR Green I

Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45]

Thuốc nhuộm SYBR Green I gắn với DNA mạch đôi, mà không gắn với DNA mạch đơn Kết quả là tín hiệu huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 488 nm và 254 nm; bước sóng phát quang 560 nm) được gia tăng rất nhiều (khoảng 800 đến 1000 lần) Khi phản ứng PCR bắt đầu, sự gia tăng số lượng trình tự DNA mới được tổng hợp sẽ làm tăng lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra Một điểm hạn chế của việc định lượng bằng SYBR Green I là hóa chất này liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi Vì vậy, mọi trình tự DNA mạch đôi trong phản ứng đều được định lượng, cho dù đó là sản phẩm PCR không đặc hiệu hay primer-dimer Để giải quyết vấn đề này, việc phân tích một đường cong nhiệt độ nóng chảy cần được thực hiện Khi chu kỳ cuối kết thúc, sản phẩm khuếch đại được nung biến tính thành mạch đơn từ từ và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận Do mỗi chuỗi DNA mạch đôi đều có một nhiệt độ nóng chảy khác nhau, ta có thể xác định các thành phần có nhiệt độ nóng chảy khác nhau trong phản ứng và do đó, có thể loại bỏ các kết quả không đặc hiệu khi định lượng [42]

Mẫu dò phân hủy (Taqman probe)

Vấn đề về sự đặc hiệu của phản ứng định lượng đã được giải quyết bằng cách sử dụng các mẫu dò có trình tự đặc hiệu gắn với chất phát quang được thiết kế bên trong cặp mồi của phản ứng PCR Quá trình liên kết và phân hủy của các mẫu dò này

thường không gây trở ngại cho việc khuếch đại DNA Có nhiều cách khác nhau, tuy nhiên ta sẽ tìm hiểu một phương pháp khá đơn giản Đó là mẫu dò Taqman

Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43]

Phương pháp Taqman dựa trên khả năng 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA

Polymerase để cắt đứt một mẫu dò trong phản ứng PCR Taqman thông thường là một chuỗi oligonucleotide dài khoảng 20-30 base (thường nó có nhiệt độ nóng chảy cao hơn 10oC so với nhiệt độ nóng chảy của mồi) có gắn thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở đầu 5‟ và một thuốc nhuộm hấp thu ở đầu 3‟ Do đầu 3‟ bị khóa, mẫu dò không thể được kéo dài như một mồi Trong phản ứng PCR, với sự hiện diện của gen đích, mẫu dò liên kết đặc hiệu ở giữa hai mồi xuôi và ngược Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, thuốc nhuộm hấp thu ở gần thuốc nhuộm phát huỳnh quang làm cho tín hiệu huỳnh quang bị triệt tiêu chủ yếu do hiệu ứng chuyển năng lượng kiểu Forster Khi phản ứng PCR xảy

ra, hoạt động 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA Polymerase sẽ phá hủy trình tự mẫu dò

khi và chỉ khi mẫu dò này liên kết với gen đích Lúc này, thuốc nhuộm phát huỳnh quang sẽ cách xa thuốc nhuộm hấp thu và chúng sẽ phát quang Vì vậy, lượng DNA được tích lũy sẽ được phát hiện qua sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang Quá trình này xảy ra trong mỗi chu kỳ và không gây cản trở việc khuếch đại DNA Trong phương pháp này, mẫu dò Taqman phóng thích chất phát quang cộng thêm vào chất phát quang đã được phóng thích trong các chu kỳ trước đó Vì vậy lượng tín hiệu huỳnh quang gia tăng rất nhiều sau mỗi chu kỳ Phương pháp này sử dụng các chương