Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007

Sinh viên thực hiện: MAI MINH MẪN

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 09/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

BSTY NGUYỄN KIÊN CƯỜNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007

iii

LỜI CẢM TẠ

Con xin gửi đến Ba Má lòng thành kính ghi ơn Con kính chúc Ba Má sức khỏe, con sẽ luôn phấn đấu để trở thành người có ích cho xã hội để không phụ công dưỡng dục của Ba Má

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

* Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ

Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các quý thầy cô đã tận tụy truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

* ThS Hồ Thị Nga, BSTY Nguyễn Kiên Cường, đã trực tiếp hướng dẫn và

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

* PGS.TS Trần Thị Dân, KS Nguyễn Văn Út đã giúp đỡ cũng như động viên

lúc tôi gặp khó khăn

* TS Dương Nguyên Khang cùng các thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo

mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt đề tài

* Thầy Đinh Xuân Phát, Cô Quách Tuyết Anh đã dành thời gian quý báu để

cung cấp cho tôi những tài liệu, kinh nghiệm quý báu

* Cùng toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt

thời gian học tập tại trường

Sinh viên thực hiện

MAI MINH MẪN

iv

TÓM TẮT

MAI MINH MẪN, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

“BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ

TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ”

Giáo viên hướng dẫn: ThS Hồ Thị Nga

BSTY Nguyễn Kiên Cường

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh trên đối tượng thỏ

Nhiễm sắc thể là yếu tố ảnh hưởng đến sự di truyền của một giống loài Xây dựng được kiểu nhân của một loài là bước đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế di truyền của loài đó Phương pháp hiệu quả nhất trong nghiên cứu kiểu nhân là nuôi cấy tế bào bạch cầu của máu và nhuộm

Máu thỏ nuôi cấy với hai liều lượng là 0,4 ml và 1 ml trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung một số chất giúp cho sự sinh trưởng và phát triển tế bào như huyết thanh phôi bò (FBS), Pokeweed (lectin), kháng sinh antimycotic – antibiotic Mẫu máu được nuôi cấy chủ yếu bằng chai Rough trong 72 giờ ở 37 0C trong tủ ấm CO2.Sau 72 giờ, cho thêm 40 µl colcemid vào môi trường và ủ theo ba mức thời gian 20 phút, 40 phút và 60 phút trước khi xử lý để nhuộm Bên cạnh đó ống nghiệm 15 ml cũng được sử dụng để nuôi cấy thử nghiệm

Kết quả cho thấy khi nuôi cấy 1ml máu thỏ với môi trường RPMI 1640 trong 72 giờ ở 37 0C và ủ với colcemid trong thời gian 60 phút thì thu được tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhiều nhất Ngoài ra, khi nuôi cấy máu thỏ với ống nghiệm 15 ml vẫn thu được các tế bào ở giai đoạn trung kỳ Mặc dù vậy, chúng tôi vẫn chưa xây dựng được kiểu nhân (karyotype) của bộ nhiễm sắc thể thỏ do nhiễm sắc thể chưa trãi đều khi nhuộm

v

SUMMARY

MAI MINH MAN, Nong Lam University, August 2007

“THE INITIAL STEP OF SETTING UP STAINING RABBIT PERIPHERAL BLOOD CHROMOSOME PROCESS”

Supervisors

HO THI NGA, MSc

NGUYEN KIEN CUONG, DMV

A study was carried out on rabbit chromosome at physiology laboratory of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University Ho Chi Minh City

Chromosome is an element which affects the species genetics Setting up karyotype of species is the initial step of researching extendedly into species’ genetic mechanism The most effective researching karyotype method is that culturing and staining lymphocyte

Rabbit peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured with two dosages, 0,4 ml and 1 ml It was cultured in RPMI 1640 medium which supplements some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), pokeweed (lectin), antimycotic – antibiotic

Blood cell was cultured primarily in Rough vase for 72 hours at 37 0C In addition, 15 ml falcon tubes were also used to culture After 72 hours, we added colcemid to medium and incubate in 20 min, 40 min and 60 min before the cell was fixed

The best result was that culturing 1 ml rabbit peripheral blood and incubating with colcemid in 60 min Besides, the cells also grew and divided when they were cultured in 15 ml falcon tubes So that, we could replace Rough vase with 15 ml falcon tubes in culturing blood leukocytes However, we haven’t established rabbit karyotype yet because chromosome didn’t spread on slides

2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể ……….6

2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể 8

2.3 Chu Kỳ sống của tế bào 9

2.3.1 Gian kỳ 9

2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân 11

2.3.2.2 Các kỳ của phân bào 12

2.4 Sơ lược các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể 14

2.4.1 Kỹ thuật splash 14

2.4.2 Kỹ thuật squash 16

2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ 16

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.6.1 Phương pháp lấy máu thỏ 24

3.6.1.1 Phương pháp lấy máu tim 24

3.6.1.2 Phương pháp lấy máu động mạch tai 24

3.6.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào máu 25

viii

3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể 26

3.6.3.1 Kỹ thuật trãi đều nhiễm sắc thể 26

3.6.3.1 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa 27

3.7 Xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid 28

4.2 Kết quả nhuộm theo lượng máu nuôi cấy 29

4.3 Kết quả nuôi cấy thử nghiệm trên ống ly tâm 15ml 31

4.4 Một số nguyên nhân ảnh hưởng tới kết nuôi cấy và nhuộm 35

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleotide ARN Acid ribonucleotide Ctv Cộng tác viên IU International unit FBS Fetal bovine serum NST Nhiễm sắc thể PHA Phytohemaglutinin PBS Phosphate buffer saline

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Số lượng nhiễm sắc thể của một số loài 5

Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thể 17

Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu 22

Bảng 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid 28

Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lượng máu nuôi cấy 30

Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml 32

Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể 8

Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào 9

Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm 13

Hình 2.7 Kiểu nhân tế bào thỏ đực 19

Hình 3.1 Phương pháp lấy máu động mạch tai 25

Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu 26

Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa 33

Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ 33

Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu 34

Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chưa vỡ 36

Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đều trên phiến kính 37

Có thể nói hơn 100 năm qua, chưa có một cấu trúc sinh học nào như NST đã được nhiều phòng thí nghiệm, nhiều nhà nghiên cứu, nhiều phương tiện kỹ thuật và kinh phí để nghiên cứu Mục đích cuối cùng là làm sáng tỏ cấu trúc phân tử, siêu vi thể cũng như cơ chế hoạt động của chúng trong tế bào Một trong những kỹ thuật nghiên cứu NST rất cổ điển nhưng rất hiệu quả đó là phương pháp nhuộm

Với phương pháp nhuộm, chúng ta có thể nghiên cứu được kiểu nhân (karyotype) của một loài nào đó Mà việc sử dụng bảng đồ kiểu nhân có tầm quan trọng trong nghiên cứu di truyền tế bào, trong y học lâm sàng chẩn đoán bệnh di truyền, bệnh ung thư, trong phân loại học cũng như trong công tác chọn giống cây trồng và vật nuôi Do đó tìm ra một quy trình nhuộm NST tối ưu để nghiên cứu kiểu nhân trong tế bào là điều rất cần thiết

Xuất phát từ nhu cầu thực tế, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm cùng với sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi

Thú Y, chúng tôi thực hiện đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ”, để tạo cơ sở cho việc xây dựng kiểu nhân hoàn chỉnh

của thỏ, góp phần ứng dụng cho những nghiên cứu sau này

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu

Xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu trong máu thỏ

1.2.2 Yêu cầu

- Thu nhận và nuôi cấy tế bào bạch cầu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ - Thử nghiệm quy trình nhuộm ở các mức thời gian ủ khác nhau - Thử nghiệm quy trình nhuộm với lƣợng máu nuôi cấy khác nhau - Thử nghiệm nuôi cấy tế bào máu thỏ trên ống nghiệm 15 ml

2.1.1 Phân loài

־ Bộ gặm nhấm: Rodentia ־ Lớp: Lagomorpha ־ Loài: Orgctolagus ־ Họ thỏ: Leporides

2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý

־ Thân nhiệt: 39,50C (biến động từ 30 – 410C) ־ Nhịp tim: 120 - 160 lần/phút

־ Tần số hô hấp: 60 - 90 lần/phút

־ Nhiệt độ môi trường thích hợp khoảng: 20 – 250C

2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ

Lượng máu của thỏ chiếm khoảng 5,5% so với trọng lượng cơ thể Thành phần máu gồm huyết tương và tế bào máu Huyết tương chiếm 60% thể tích, gồm huyết thanh và chất sinh sợi huyết Huyết tương có vai trò vận chuyển chất hữu cơ và vô cơ trong cơ thể (Dương Nguyên Khang, 2006)

Máu có ba loại tế bào là hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu Số lượng hồng cầu khoảng từ 6 – 6,5 triệu trong 1 mm3

máu, chiếm hơn 90% tế bào máu Hồng cầu có vai trò vận chuyển O2 và CO2, điều hòa pH

Số lượng tiểu cầu khoảng 300.000 trong 1 mm3 máu Tiểu cầu khi vỡ sẽ sinh ra enzyme thrombokinase có tác dụng làm đông máu Khi nuôi cấy tế bào máu, người ta dùng heparin để kháng lại cơ chế đông máu Heparin có trong đại thực bào của gan, phổi và bạch cầu ưa base, chúng không gây độc đối với tế bào

Bạch cầu giữ nhiệm vụ bảo vệ cơ thể, số lượng bạch cầu ở thỏ khoảng 7.600 trong 1mm3 máu (Trịnh Văn Thịnh, 1978) Bạch cầu gồm hai nhóm: bạch cầu có hạt và bạch cầu không hạt Bạch cầu có hạt gồm: trung tính, acid và base Bạch cầu không hạt gồm: đơn nhân lớn và lympho Trong đó, bạch cầu lympho có khả

năng phân chia nhanh và nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro (Eldridge, 1985)

2.2 Nhiễm sắc thể 2.2.1 Khái niệm

Nhiễm sắc thể (NST) là những cấu trúc hiển vi trong nhân tế bào, cấu tạo chủ yếu từ DNA và protein histon, có khả năng tự nhân đôi và biến đổi hình thái cấu trúc theo qui luật trong các quá trình phân bào

Nhiễm sắc thể tồn tại trong nhân tế bào soma thành từng cặp đồng dạng, trong đó một NST có nguồn gốc từ bố và một có nguồn gốc từ mẹ Trong các tế bào bình thường mỗi NST gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), còn trong các giao tử NST

đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử Mỗi loài bình thường có bộ NST lưỡng bội (2n)

đặc trưng về số lượng, hình thái, cấu trúc và ổn định tương đối qua các thế hệ Kiểu nhân (karyotype) là thuật ngữ dùng chỉ số lượng và hình dạng của các NST chuyên biệt cho mỗi loài

Tuy nhiên, các mô khác nhau của cùng một cơ thể có sự biến đổi hình dạng và kích thước NST để thích nghi với chức năng của một giai đoạn phát triển (Nguyễn Như Hiền, 2005)

Bảng 1.1 Số lượng nhiễm sắc thể của một số loài (Eldridge, 1985)

Thỏ (Oryctolagus cuniculus) 2n = 44

Chó (Canis familiaris) 2n = 78

Bộ đơn bội (haploid) ký hiệu là n, đặc trưng cho các tế bào, cơ thể đơn

bội và các tế bào sinh dục trưởng thành ở loài sinh sản hữu tính

Bộ lưỡng bội (diploid) ký hiệu 2n, đặc trưng cho các tế bào và cơ thể

lưỡng bội Bộ lưỡng bội được hình thành do sự kết hợp hai bộ đơn bội

Bộ đa bội (polyploid) đặc trưng cho tế bào và cơ thể đa bội Số NST

được tăng lên theo bội số của n khởi nguyên

2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể

2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể

a) Nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính

Trong bộ lưỡng bội (2n) thường tồn tại nhiều cặp tương đồng giống nhau về

hình dạng, kích thước được gọi là NST thường (autosome) Ngoài ra còn có 1 cặp NST trong đó 2 thành viên khác nhau về hình dạng, kích thước hoặc trạng thái hoạt động được gọi là NST giới tính (sex chromosome)

Centromere chia NST thành 2 vế, chiều của 2 vế phụ thuộc vào vị trí centromere Người ta thành lập chỉ số centromere (centromere index – Ic) để xác định vị trí của centromere và các kiểu hình NST

P: chiều dài vế ngắn Q: chiều dài vế dài

Theo Eldridge (1985), nhiễm sắc thể có các kiểu hình sau:

־ Acrocentric có centromere ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc ־ Telocentric có centromere ở ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể ־ Subtelocentric có centromere nằm gần điểm tận cùng nhiễm sắc thể ־ Submetacentric có centromere ở gần chính giữa (Q > P)

־ Metacentric có centromere ở chính giữa chia 2 vế bằng nhau (P = Q) Có một số tranh luận khoa học về kiểu hình nhiễm sắc thể Người ta tự hỏi telocentric có thật hay không Một số nghiên cứu chứng minh rằng telocentric thật sự tồn tại, centromere của telocentric có dính một lượng rất nhỏ chất nhiễm sắc mà chúng ta khó xác định được

־ Ngăn cản không cho enzyme deoxiribonuclease phân giải đầu tận cùng của phân tử ADN

־ Ngăn cản không cho NST trong bộ kết dính nhau

־ Tạo thuận lợi cho tái bản ADN ở phần đầu cuối của phân tử

Telomere có cấu trúc và thành phần đặc thù gồm những đoạn lặp nucleotid, tuy khác nhau ở các loài nhưng thường thể hiện theo phương thức 5’ – T1-4 A0-1 G1-8– 3’ Ví dụ ở người cũng như động vật có xương sống có đoạn lặp lại là TTAGGG,

ở thực vật arabidopsis thaliana có đoạn lặp lại là TTTAGGG

2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể a) Sợi nucleosome

Trong nhiễm sắc thể, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn nhiều cấp, được gọi là sợi nhiễm sắc Sợi nhiễm sắc cơ bản có đường kính 11 nm, là chuỗi hạt cườm, được gọi là sợi nucleosome Mỗi hạt cườm là một nucleosome có kích thước 11 nm dạng khúc giò gồm lõi được cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2 H2A, 2 H2B, 2 H3, và 2 H4), sợi xoắn kép ADN cuốn xung quanh lõi histon với 1,75 vòng (chứa khoảng 146 cặp nucleotid) Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép ADN dài khoảng 60 nucleotid

Các sợi nucleosome gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H1, mỗi cuộn gồm sáu nucleosome, để tạo thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đường kính 30nm, được gọi là sợi solenoid

b) Các cấp độ cấu trúc nhiễm sắc thể

Sợi solenoid sẽ gấp khúc tạo nên các vòng bên (looped domains) chứa khoảng 20.000 – 80.000 cặp nucleotid và có kích thước khoảng 300nm Các sợi 300 nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700nm đến 1400nm tức là các nhiễm sắc tử Ngoài protein histon, trong NST còn có nhiều protein axit có vai trò điều hòa hoạt động của gen

Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể

(Nguồn http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/chromosome.jpg)

2.3 Chu kỳ sống của tế bào

Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào được hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thức sự phân bào hình thành tế bào mới Người ta chia chu kỳ tế bào ra hai thời kỳ chính: gian kỳ (interphase), kỳ phân bào (mitosis) Thời gian của một chu kỳ sống của tế bào động vật rất dài, từ 20 đến 40 giờ

Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào

(Nguồn http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/cycle.jpg)

2.3.1 Gian kỳ

Trong gian kỳ tế bào thực hiện các chức năng trao đổi chất, các hoạt động sống khác nhau như tổng hợp các ARN (acid ribonucleotide) và ADN, protein và các enzyme chuẩn bị cho sự phân bào Tùy theo đặc điểm chức năng người ta chia tế bào gian kỳ ra làm ba giai đoạn hay pha liên tiếp nhau: giai đoạn G1 (gap 1), giai đoạn S (synthesis) và giai đoạn G2 (gap 2) Thời gian tế bào ở giai đoạn gian kỳ rất dài, chiếm hơn 90% thời gian chu kỳ sống của tế bào Thời gian này tùy thuộc vào thời gian của 3 pha G1 + S + G2, đặc biệt tùy thuộc vào G1 Vì ở các tế bào khác nhau thì thời gian G1 là rất khác nhau, còn giai đoạn S và G2 tương đối ổn định (Eldridge, 1985)

Ví dụ ở tế bào chuột, thời gian ở G1 là 9,5 giờ, S 7,5 giờ, G2 là 1 giờ và thời gian ở kỳ phân bào 45,5 phút Vậy thời gian tế bào chuột ở giai đoạn gian kỳ chiếm hơn 95% thời gian của một chu kỳ sống ở tế bào chuột

2.3.1.1 Pha G1

Pha G1 tiếp ngay sau phân bào, là pha đầu tiên của tế bào con Thời gian của G1 kéo dài từ ngay sau khi tế bào tạo thành do phân bào, cho đến khi bắt đầu pha S là pha tổng hợp ADN

Vào cuối pha G1 có một thời điểm được gọi là điểm hạn định (restriction point), điểm R Nếu tế bào vượt qua điểm R, chúng tiếp tục đi vào pha S Trong nuôi cấy tế bào, tế bào có vượt qua điểm hạn định hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện một trường Nhân tố điều chỉnh thời điểm R là hệ protein phức tạp trong đó có các cyclin và kinase Đối với các tế bào biệt hóa thì tế bào không vượt qua R mà đi vào quá trình biệt hóa tế bào

2.3.1.2 Pha S

Pha S là pha tiếp theo pha G1, được gọi là pha tổng hợp ADN vì chính trong pha này xảy ra sự tái bản ADN và nhân đôi số lượng NST của tế bào Vào cuối pha G1, tế bào tổng hợp một loại protein đặc trưng là cylin A và nhanh chóng tích lũy trong nhân tế bào Protein cyclin A cùng với enzyme kinase sẽ xúc tiến sự tái bản ADN Protein cyclin A tác động cho tới cuối pha S thì biến mất Thời gian kéo dài của pha S ở đa số tế bào nhân thực tương đối ổn định từ 6 – 8 giờ

2.3.1.2 Pha G2

Tiếp theo S là pha G2, thời gian của G2 ngắn từ 1 – 4 giờ Trong pha G2, các ARN và protein được tổng hợp chuẩn bị cho sự phân bào Cuối pha G2 một protein được tổng hợp là cyclin b được tích lũy trong nhân cho đến tiền kỳ phân bào Cyclin b hoạt hóa enzyme kinase tạo thành các vi ống tubulin hình thành các thoi phân bào

2.3.1.2 Phân bào

Tiếp theo pha G2 là pha M (mitosis) thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành hai tế bào con Sự phân bào là phương thức sinh sản của tế bào, và là phương thức tế bào mẹ truyền thông tin di truyền chứa DNA cho hai tế bào con Người ta phân biệt bốn dạng phân bào sau: nguyên phân, giảm phân, trực phân, nội phân

2.3.2 Nguyên phân

2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân

Nguyên phân hay còn được gọi là phân bào nguyên nhiễm, xảy ra trong pha M của chu trình tế bào, tiếp ngay sau pha G2 Qua M, tế bào mẹ sau khi đã đi qua pha S sẽ tạo hai tế bào con, mỗi tế bào con mang bộ máy di truyền giống hệt tế bào mẹ Hiện tượng này được phát hiện đầu tiên bởi Strasburger và Flemming từ những năm 1882, khi quan sát thấy các cấu trúc sợi nên đặt tên là phân bào có tơ (Nguyễn như hiền, 2005)

2.3.2.2 Các kỳ của phân bào a) Tiền kỳ (prophase)

Tiền kỳ được tiếp theo sau pha G2 của gian kỳ Rất khó phân biệt một cách chính xác điểm chuyển tiếp này, các hiện tượng đặc trưng cho tiền kỳ là:

Hình thành nhiễm sắc thể: chất nhiễm sắc ở gian kỳ bao gồm các sợi nhiễm sắc đã được nhân đôi qua pha S, trở nên xoắn và cô đặc lại, hình thành các NST thấy rõ dưới kính hiển vi thường, mà số lượng, hình thái đặc trưng cho loài

Màng hạch nhân có nhiều thay đổi: hạch nhân giảm thể tích, phân rã và biến mất Màng nhân đứt thành nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào bé phân tán trong tế bào chất

Hình thành bộ máy phân bào: qua pha S, trung tử nhân đôi tạo thành 2 đôi trung tử con, do sự hoạt hóa của các chất quanh trung tử, các đơn hợp tubulin trong tế bào hợp tạo thành các vi ống tubulin Các vi ống phóng xạ quanh trung tử tạo thành sao phân bào, hai sao di chuyển về hai cực của tế bào Giữa hai sao, các vi ống phát triển sắp xếp thành hệ thống ống có dạng hình thoi, được gọi là thoi phân bào hay thoi vô sắc Cấu tạo nên thoi có hai dạng vi ống: vi ống cực và vi ống tâm động Đến cuối tiền kỳ, khi màng nhân biến mất thì bộ máy thoi với hai sao được hình thành

Tiền kỳ chiếm thời gian nhiều nhất trong kỳ nguyên phân Ở tế bào động vật, tiền kỳ chiếm hơn 50 % thời gian trong giai đoạn tế bào phân chia (Eldridge, 1985)

b) Trung kỳ sớm (prometaphase)

Bắt đầu khi màng nhân tiêu biến thành các bong bóng nhỏ phân tán trong tế bào chất quanh thoi phân bào Khi vùng nhân biến mất thì thoi vô sắc di chuyển chiếm ngay vị trí trung tâm Lúc này centromere được phân hóa thành 2 cấu trúc được gọi là tâm động có kích thước khoảng 1 µm Thông qua tâm động, NST được đính với các sợi tâm động của thoi

c) Trung kỳ (metaphase)

Đối với tế bào động vật, thời gian tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất ngắn, chỉ kéo dài từ năm đến bảy phút (Eldridge, 1985) Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể xoắn, cô đặc, co ngắn tối đa và sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo nên tấm trung kỳ Tấm trung kỳ nằm thẳng góc với trục dọc của thoi Đây cũng là thời điểm có thể quan sát hình dạng, số lượng NST rõ nhất Vì thế người ta thường tập trung vào giai đoạn này để nghiên cứu kiểu nhân hay đặc điểm NST của mỗi loài

d) Hậu kỳ (anaphase)

Nhiễm sắc thể tách đôi và rời khỏi nhau tạo thành hai NST con độc lập Nhiễm sắc thể con di chuyển về 2 cực nhờ sự co ngắn của sợi tâm động, phối hợp với sự kéo dài của các sợi cực và hẹp lại của thoi

e) Mạt kỳ (telophase)

Trong kỳ này, các NST con đã di chuyển đến hai cực, giãn xoắn, dài ra và biến dạng thành chất nhiễm sắc Hạch nhân được tái tạo, hình thành 2 nhân con trong khối tế bào chất chung

Quá trình phân chia tế bào chất của tế bào bắt đầu từ cuối hậu kỳ hoặc đầu mạt kỳ và diễn ra suốt mạt kỳ Sự phân chia này bắt đầu bởi sự hình thành một eo thắt, được cấu tạo bởi các vòng vi sợi actin nằm giữa hai nhân con Khi vòng vi sợi actin co rút kéo theo phần màng sinh chất lõm thắt vào trung tâm, và khi màng nối với nhau sẽ phân tách tế bào chất thành 2 nửa, mỗi nửa chứa một nhân con Mặt phẳng phân cắt tế bào chất thẳng góc với trục của thoi phân bào

Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm

(Nguồn http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/mitosis/c12x5mitosis-collage.jpg)

2.4 Sơ lược các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể

Cơ chế chung của việc nghiên cứu kiểu nhân là giải phóng NST ở các tế bào, mô ở giai đoạn trung kỳ Sau đó tiến hành nhuộm để quan sát hình thái, cấu trúc, số lượng cũng như những băng vạch trên nhiễm sắc thể Có hai kỹ thuật dựa trên cơ chế này để nghiên cứu NST là kỹ thuật splash và kỹ thuật squash

2.4.1 Kỹ thuật splash

Kỹ thuật này đã được ứng dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể từ rất lâu Cơ chế của kỹ thuật này theo đúng theo tên gọi của nó là “splash” có nghĩa là “bắn” hay “văng” Với kỹ thuật này, màng tế bào sẽ bị phá hủy, những giọt dịch chứa nhân của tế bào sẽ được cho rơi từ một độ cao thích hợp lên một mặt phẳng, nhờ điều này mà nhiễm sắc thể bị bắn ra khỏi nhân và trải đều trên phiến kính Ta có thể tiến hành nhuộm và quan sát nhiễm sắc thể Kỹ thuật này đơn giản, đáng tin cậy và được ứng dụng trên các nguồn tế bào như:

a) Tế bào in vivo

Kỹ thuật splash được ứng dụng kỹ thuật được thực hiện đầu tiên ở các mô,

tế bào phân chia nhanh trong in vivo để nghiên cứu về NST Những mô, tế bào có

thể sử dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể ngay như: rễ ở thực vật, hay tủy xương, tế bào lách, biểu mô ruột ở động vật hữu nhũ, lưỡng cư và chim (Herbert, 1993) Những mẫu mô này được ngâm trong những hỗn hợp dung môi như metanol – acid acetic để cố định mẫu, sau đó mẫu được nhuộm và bảo quản bởi một lớp papain Tuy nhiên phương pháp này chỉ thực hiện được trên những loài có số lượng NST thấp, đối với những loài như gia cầm có số lượng nhiều thì không có kết quả chính xác

b) Tế bào nuôi cấy in vitro

Khắc phục nhược điểm của những tế bào in vivo, kỹ thuật trên sử dùng nguồn tế bào đã được nuôi cấy in vitro để thay thế Năm 1885, Roux là người báo cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào in vitro, hơn 100 năm qua thuật ngữ “nuôi cấy tế

bào” vẫn được dùng, mặc dù lĩnh vực này đã được mở rộng từ thập niên 1950 khi các nhà khoa học đã sử dụng những tế bào nuôi cấy rời (Eldridge, 1985)

Những mẫu mô như tim, da, gan, thận, phổi thường được sử dụng nuôi cấy để nghiên cứu kiểu nhân, vì tế bào của những mẫu mô này có thể phát triển và phân chia mà không cần các tác nhân kích thích đặc biệt (Herbert, 1993) Bên cạnh đó, người ta còn nuôi cấy nang noãn hay phôi nang (blastocyst) để nghiên cứu kiểu nhân (Eldridge, 1985) Tuy nhiên phương pháp này vẫn có một số nhược điểm là: sự phân chia của tế bào rất chậm và thời gian nuôi cấy tế bào thường theo quy trình dài ngày từ một đến ba tuần Bên cạnh đó các mô trên cơ thể rất khó trong việc bảo quản cũng như nuôi cấy tế bào, do các tế bào của mô này đòi hỏi phải có môi trường sinh khiết như trong cơ thể và tế bào phải bám dính trên một gián thể mới tồn tại và phát triển được

c) Tế bào bạch cầu

Cho tới năm 1960, tế bào bạch cầu chưa được dùng để nghiên cứu NST Vì người ta cho rằng tế bào bạch cầu, đặc biệt là tế bào lympho không thể phân chia khi đã đi vào dòng máu trong cơ thể Năm 1960, Novell vô tình phát hiện ra Phytohemagllutinin (PHA) là tác nhân kích thích tế bào bạch cầu phân bào Nó

được chiết xuất từ cây đậu đỏ phaseolus vulgaris Ông đặt tên phytohemaglutinin là

do “phyto” nghĩa là thực vật, “hem” thuộc về máu và “agllutinin” có nghĩa là kết dính (Eldridge, 1985) Đặc tính của nó là có khả năng làm lắng tụ hồng cầu, nhờ đó mà tế bào bạch cầu được tách ra Chính vì điều này mà làm tế bào bạch cầu, và chủ yếu là tế bào lympho có khả năng phân chia (Herbert, 1993) Ngày nay, người ta có thể sử dụng Pokeweed có thể thay thế cho PHA trong nuôi cấy tế bào bạch cầu Tuy nhiên khả năng tác dụng của nó yếu hơn PHA Pokeweed chỉ áp dụng cho những loại máu đòi hỏi nồng độ PHA thấp

Việc phát hiện ra PHA là một bước tiến lớn trong việc nghiên cứu NST, vì tế bào bạch cầu có những ưu điểm vượt trội so những dòng tế bào trước đây Thời gian phát triển của tế bào rất ngắn từ 48 đến 72 giờ, bạch cầu dể tồn tại trong môi trường nuôi cấy và có khả phát triển tốt trong môi trường huyền phù Do đó tế bào bạch cầu được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu NST của các loài vật nuôi như: heo, bò, dê, cừu, gà…