Bước đầu xây dựng qui trình nhuộm nhiễm sắc thể ở tế bào vi tảo biển SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6

Khóa luận tốt nghiệp 2015 KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP “ Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội BUỚC ĐÀU XÂY DỤNG QUI TRÌNH NHUỘM NHIÊM SẮC THẾ Ĩ TÉ BÀO VI TẢO BIÉN SCHIZOCHYTR1UM MANGROVE1 PQ6 Người hướng dẫn : PGS.TS Đặng Diễm Hồng Sinh viên thực : Đồn Thị Hà Thu Lớp : KS.CNSH 11-04 Khóa luận tốt nghiệp 2015 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp vừa qua, em nhận hướng dẫn, giúp đỡ tận tình Ban lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học Ban giám hiệu trường Viện Đại học Mờ Em xin gửi lời cám ơn sâu sac lòng biết ơn tới PGS TS Đặng Diềm Hồng- Trường phịng Cơng nghệ Táo, Viện Công nghệ sinh học Đồng thời em xin gứi lời câm ơn tới NCS Lưu Thị Tâm học viên cao học Hoàng Thị Quỳnh Phạm Văn Nhất - cán trực tiếp hướng dẫn em làm đề tài tập thê cán cứa phòng- người giúp đờ, hướng dần cm làm thực nghiệm suốt trình thực tập tốt nghiệp Em xin gữi lời cám ơn tới tập giảng viên cùa Khoa Công nghệ Sinh học- Viện Đại học Mớ dạy dỗ em suốt q trình học tập, giúp em có kiến thức sở chuyên ngành làm tảng cho nghiên cứu sau Cuối cùng, em xin bày tó lịng biết ơn sâu sắc với gia đình, bạn bè động viên, tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập vừa qua Hà Nội ngày 22 tháng năm 2015 Đoàn Thị Hà Thu Đồn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 ii Khóa luận tốt nghiệp 2015 MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỪ VIẾT TÁT V DANH MỤC BÀNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỚ ĐÀU CHƯƠNG I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIÓI THIỆU CHUNG VỀ TÁO VÀ VI TÁO 1.1.1 Khái niệm chung tảo, vi tảo biến 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Sinh sàn, sinh dưỡng tào 1.1.4 Sinh trướng cúa tâo 1.1.5 Vai trò vi tảo 1.2.1 Khái niệm 12 1.2.2 Hình thái kích thước 12 1.2.3 Số lượng nhiễm sắc 13 Illi vicii yìệh Đặỉ liộc Mở Hâ Nọi 1.2 Cấu trúc cùa nhiễm sắc thể 1.3 CHU KỲ SỐNG CÙA TÉ BÀO 16 13 1.3.1 Gian kỳ 17 1.3.2 Phân bào 18 1.4 SO LƯỢC CÁC KỸ THUẬT ĐƯỢC DỪNG TRONG NGHIÊN cứu VÈ NHIÊM SẤC THÊ 19 1.4.1 Kỹ thuật splash 19 1.4.2 Kỹ thuật squash 21 1.4.3 Tình hình nghiên cứu nhiễm sác thể tảo 22 1.5 GIỚI THIỆU CHUNG VÈ VI TẢO BIÉN SCHIZOCHYTRIUM MANGROVE! PQ6 24 1.5.1 VỊ trí phân loại Schizochytrium 25 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Schizochytrium 25 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 VẶT LIỆU VÀ HÓA CHÁT 28 Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 Ui Khóa luận tốt nghiệp 2.1.1 2.1.2 2.2 2015 Vật liệu 28 Hóa chất thiết bị 28 PHƯƠNG PHÁP 29 2.2.1 Qui trình cố định mầu 29 2.2.2 Qui trình nhược trương mẫu 30 2.2.3 Qui trình nhuộm mẫu với acetocarmine 1% 30 2.2.4 Qui trình nhuộm mẫu với giêmsa 4% 30 2.2.5 2.3 Qui trình nhuộm mầu với thuốc nhuộm DAPI 31 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 32 2.3.1 Thí nghiệm 1: Kháo sát số lần nhược trương với KC1 0,075 M 32 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát điều kiện ly tâm lên khả năngvỡ màng tế bào tảo 32 2.3.3 Thí nghiệm nhuộm NST với loại thuốc nhuộm 32 2.4 CHÍ TIÊU QUAN SÁT 32 2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 32 CHƯƠNG III: KÉT QUẢ VÀ THÁO LUẬN 33 3.1 ẢNH HƯỞNỢỊẹýẠ Ị#IS$ỆT QUẢ NHUỘM TÉ BÀO TÁO s MANGROVE! PQ6 33 3.2 ÁNH HƯỚNG CÚA TÓC Độ LY TÂM LÊN KẾT QUẢ NHUỘM TÉ BÀO TÀO s MANGROVE! PQ6 34 3.3 NHUỘM NHIẺM SẮC THÉ TÀO MANGROVE! PQ6 VỚI THUÓC NHUỘM ACETOCARMINE 1% 35 3.4 NHUỘM MẦU BẰNG THUỐC NHUỘM GIÊMSA 4% 38 3.5 NHUỘM NHIÉM SẮC THÉ BÁNG THUÓC NHUỘM DAPI 39 3.6 MỘT SÓ NGUYÊN NHÂN ẢNH HƯƠNG TỚI KÉT NHUỘM MÀU 40 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 KẾT LUẬN 43 K1ÉN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHAO 44 TÀI LIỆU THAM KHAO TIẾNG VIỆT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 44 TÀI LIỆU THAM KHAO TRANG WEB 48 Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 iv Khóa luận tốt nghiệp 2015 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN: axít dexyribonucleotide DHA: axít docosahexaenoic DPA: axít docopentaenoic EPA: axít eicosapentaenoic NLSH: nhiên liệu sinh học NST: nhiễm sắc thể PHA: phytohcmagllutinin PUFAs: axít béo khơng bão hịa đa nối đơi ARN: axil ribonucleotide SKK: sinh khối khô TLK: trọng lượng khô VTM: vitamin Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 Khóa luận tốt nghiệp 2015 DANH MỤC BẢNG Báng I: số lượng nhiễm sắc loài Báng 2: Ảnh hường tốc độ ly tâm lên kết quà nhuộm mẫu Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 vi Khóa luận tốt nghiệp 2015 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Năm pha sinh trường cúa tâo Hình 2: Nhiễm sắc thể Hình 3: cấu trúc nhiễm sắc Hình 4: cấu trúc siêu vi cùa nhiễm sắc thề Hình 5: Chu kỳ tế bào Hình 6: Khuẩn lạc chi Schizochytrium Hình 7: Hình ánh tế bào s mangrovei lần nhược trương khác Hình 8: Nhuộm nhân tào s mangrovei PQ6 với thuốc nhuộm acetocarmine 1% thời gian khác Hình 9: Nhuộm nhân tào s mangrovei PQ6 với thuốc nhuộm acetocarmine 1% có bố sung thêm NaOH 2,5% Hình 10: số lượng nhân cúa táo s mangrovei PQ6 bat màu với thuốc nhuộm acetocarmine 1% Hình 11: Nhân NST cua tao ntangrovei PQ6 nhuộm thuốc nhuộm giêmsa 4% Hình 12: Nhuộm NST cúa táo s mangrove! PQ6 với thuốc nhuộm DAP1 (độ phóng đại ánh 500X) Hình 13: Ánh minh họa tế bào thời điếm nuôi cấy khác nhuộm mầu giêmsa 4% Hình 14: Ánh minh họa mầu bị nhiễm vi khuẩn nhuộm NST s mangrove! PQ6 bang thuốc nhuộm giêmsa 4% Hình 15: Ánh minh họa te bào s mangrove! PQ6 không bị vỡ màng tế bào nhuộm với thuốc nhuộm giêmsa 4% Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 vii Khóa luận tốt nghiệp 2015 MỞ ĐÀU Te bào đơn vị tổ chức bàn cúa thể sống Trong tế bào có chứa bào quan nhân Nhân tế bào cấu thành bắt buộc cúa tế bào eukaryote, nhân có chứa nhiễm sac the (NST), cấu trúc mang vật chất di truyền ADN (axít deoxyribonucleotide) cúa tế bào Nhiễm sắc thể quan sát bới Nageli năm 1842 đến năm 1888, NST Waldeyer đặt tên “chromosome” (“chromo" có nghĩa bắt màu nhuộm “some” nghĩa thề) (Elderige, 1985) Nhiễm sắc thể đóng vai trị quan trọng di truyền loài, yếu tố định cho tiến hóa hay suy thối cúa giống nịi Có thề nói 100 năm qua, chưa có cấu trúc sinh học NST thu hút nhiều phịng thí nghiệm, nhiều nhà nghiên cứu sứ dụng nhiều phương tiện kỹ thuật tiêu tốn nhiều kinh phí đế nghiên cứu Mục đích cuối làm sáng tó cấu trúc phân tử, siêu vi the chế hoạt động chúng tế bào Một kỹ thuật nghiên cứu NST rat cổ điền hiệu phương pháp nhuộm NST Te bào loài sịnh vật khác có NST khác nhau, đặc trưng số lượng hình thái cho lồi Với phương pháp nhuộm, có thề nghiên cứu số lượng hình thái NST lồi Do đó, tìm quy trình nhuộm NST tối ưu để nghiên cứu so lượng hình thái cùa đặc trưng cho lồi rat cần thiết Vi táo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 phân lập huyện đâo Phú Quốc- Kiên Giang năm 2006-2008 Đây lồi vi tảo có tiềm ứng dụng cao chúng có thích nghi rộng với thay đối cúa điều kiện nuôi nhiệt độ, pH, độ mặn; sàn xuất sinh khối cao, hàm lượng lipit lớn (70 % sinh khối khơ sinh khối tào giàu axít béo khơng bão hịa đa nối đơi đặc biệt axít docosahexaenoic (DHA, C22:6w-3; chiếm đến 20 - 50 % so với axít béo tống số) Cho đến nay, sinh khối tào ứng dụng nhiều lĩnh vực sừ dụng trực tiếp sinh khối tảo tươi làm thức ăn tươi sống cho đối dượng nuôi thúy sàn, làm nguyên liệu để sàn suất thực phâm chức năng, tách chiết chất có hoạt tính sinh học cao EPA (axít eicosapentaenoic C20:5w-3), DHA DPA (axít docopentaenoic, C22:5(0-6) làm Đồn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 Khóa luận tốt nghiệp 2015 nguyên liệu sản xuất dầu sinh học hay tách chiết squalene - chất có hoạt tính chống oxi hóa cao để làm mỹ phấn Một hướng ứng dụng khác nghiên cứu thành công sán xuất biodiesel từ sinh khối Mặc dù chủng vi tảo ứng dụng nhiêu lĩnh vực nêu nghiên cứu di truyền (như kích thước hệ gen, số lượng, hình thái cấu trúc NST) cúa loài tâo khác thuộc cà chi Schizochytrium chưa nghiên cứu că giới Việt Nam Vì vậy, chúng tơi mong muốn thực đề tài nghiên cứu “Bước đầu xây dựng qui trình nhuộm nhiễm sắc tế bào vi tảo biến dị dưõng Schizochytrium inangrovei PQ6” nham xác định số lượng hình thái nhiễm sac the (karyotype) cúa tào Mục đích đề tài nghiên cứu cúa chúng tơi sau: +/ Tìm qui trình nhuộm nhiễm sắc thể tối ưu cho loài vi tào biền dị dưỡng s mangrovei PQ6 +/ Xác định số lượng hình thái nhiễm sắc thể (karyotype) tào Cơng việc nghiên cứu thực phịng Công nghệ Táo, Viện Công nghệ sinh học thu^c Ỵịiệp Hận lâọrKhoa hỊọ^ỵ^-.CỘng nghệ yj|t,Nam Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 Khóa luận tốt nghiệp 2015 CHƯƠNG I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TẢO VÀ VI TẢO Khái niệm chung v'ê tảo, vi tảo biển 1.1.1 Tảo (Algae) thực vật bậc thấp (thực vật có bào tử, thề khơng phân chia thành thân, rề lá) Trong tế bào táo có chứa diệp lục chúng sống yếu nước [5] Vi táo (Microalgae) tất cà loài tảo có kích thước hiển vi tức muốn quan sát dược chúng phái sừ dụng kính hiến vi Trong số khống 50.000 lồi tào giới vi táo chiếm khoảng 2/3 Vai trò quan trọng vi tảo thể qua trình quang hợp hap thụ CƠ2, cung cấp O? cho sinh vật khác trái đất khép kín vịng tuần hồn vật chất làm tăng tốc độ quay vịng cúa chu trình [6] Tào có mặt khắp nơi trái đất, từ đình núi cao đáy biến sâu chí độ sâu khống 200 m đáy biển nước biển Những loài tào sống thủy vực gọi táo phù du (phytoplankton) đtrợc gọi là' táo đáy (Phytobento.s) Dạng tảo cộng sinh với nấm thành Địa y dạng phân bo rộng rãi nhiều loài dược khai thác dùng làm dược phẩm, nước hoa phẩm nhuộm mục đích kinh tế khác (hiện biết tới 20.000 loài Địa y thuộc 400 chi khác nhau) 1.1.2 Phân loại Căn vào màu sắc, có mặt chất dự trữ, thành phần vó, cấu tạo nhân tế bào người ta chia tào thành ngành khác Vi táo yếu thuộc chi ngành sau: - Ngành Cholorophyta (Tão lục): Các Pediastrum, Closterium, chi Staurastrum, Coelastruin, Dunaliella, Dyctyosphaerium, Chlainydomonas, Scenedesmus, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella - Ngành Heterokontophyta (Táo lông roi lệch): Các chi Melosừa, Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium, ỉsochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 Khóa luận tốt nghiệp 2015 hành nhược trương 2-3 lan thời gian ngán tốt nhược trương I lần thời gian dài Hình Hình ảnh tế bào tão s mangrovei PQ6 õcác lần nhược trương khác A: Nhược trương I lần; 3.2 B: Nhược trương lần; C: Nhược trương lần ẢNH HƯỚNG CỦA Tốc ĐỘ LY TÂM LÊN KẾT QUẢ NHUỘM TẾ BÀO TẢO s MANGROVEIPQ6 Ket ve ảnh hường tốc độ ly tâm lên kết nhuộm tế bào tào s học Mơ Ị_|à Nội mangrove! Băng Ảnh hưởng tốc độ ly tâm lên kết quà nhuộm mẫu Tốc độ ly tâm Nhược trưoiig lần Te bào khó lăng bước cố định carnoy nên phái tăng thời gian ly 800 rpm tâm, thu tế bào, tế bào có kích thước to tế bào bị phá màng 50 - 60% Tể bào khó lắng bước cố định carnoy, tăng thời gian ly tâm, thu 1000 rpm te bào, tế bào bị phá màng 50 - 60% Một số nhân tế bào bị Nhược trưong lần Te bào khó lắng bước cố định carnoy nên tăng thời gian ly tâm thu tế bào tế bào có kích thước lớn, tế bào bị phá màng 60 - 70% Te bào khó lang bước cố định carnoy nên tăng thời gian ly tâm, thu tế bào tế bào bị phá màng 70 - 80 % Một số nhân tế bào bị văng văng Tề bào lẳng nhiều, you tề 1200 rpm bào có kích thước trung bình Te bào bị phá màng 50 - 60%, nhân bị văng nhiều Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 Chú yếu tế bào có kích thước trung bình, tế bào bị phá màng 70 - 80 %, nhân bị văng ngồi nhiều 34 Khóa luận tốt nghiệp 1500 rpm 2015 Dễ lắng, có thêm nhiều tế bào Dè lăng, có thêm nhiêu tê bào lăng láng Te bào bị phá màng 50 - Tế bào bị phá màng 70 - 80 %, nhân bị 60%, nhân bị văng nhiều văng nhiều Không quan sát Không quan sát NST NST Tề bào dễ lẳng, có thêm nhiều tế bào lẳng Te bào bị phá 2000 rpm màng 60% nhân bị văng ngồi tồn Khơng quan sát Rất dễ lắng, ly tâm phút, có thêm nhiều tế bào lắng Te bào bị phá màng 70 - 80 %, nhân bị văng tồn Khơng quan sát NST NST Kết q thu được chi bàng cho tháy: Khi tăng tốc độ ly tâm mầu trình nhược trương mẫu thu phân đoạn tế bào có kích thước khác Ờ tốc độ ly tâm thấp 800 rpm tế bào thu chù yếu dạng tế bào có kích thước lớn Khi nhược trương với KC1 0,075 M, te bào bị vỡ màng nhân chiếm tý lệ cao 60 - 80% Nhân nằm bên danh giới te bào Khi tăng tốc độ ly tâm trình nhược trương mẫu lên 1000 - 2000 rpm số lượng tế bào bị vờ màng không tăng nhân cứa tế bào bị phá màng bị văng ngồi nhiều nên soi mầu kính hiến vi không quan sát thấy nhân tế bào tảo Do đó, tốc độ ly tâm mẫu thích hợp trình nhược trương 800 rpm Ớ tốc độ ly tâm này, phần trăm tế bào bị phá vỡ màng chiếm 60 - 80% nhân te bào vần định khu ranh giới bên tế bào 3.3 NHUỘM NHIỄM SẮC THÊ’ TÁO s MANGROVE! PQ6 VỚI THUỐC NHUỘM ACETOCARMINE 1% Chúng tiến hành nhuộm NST tào s mangrovei PQ6 với thuốc nhuộm acetocarmine 1% Ket nghiên cứu thu được trình trình bày hình Đồn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 35 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Nhuộm acetocarmine 1% ngày Táo ngày Tảo ngày Táo ngày Tảo ngày Tào ngày Nhuộm acetocarmine 1% ngày Tảo ngày Táo ngày Hình Nhuộm nhân tảo s mangroveỉ PQ6 vói thuốc nhuộm acetocarmine 1% õ' Thư viện Việní&ạ^ọc^ơ^rà Nội Kết thu được chi hình cho thấy: Các mầu tâo nhuộm thời gian lâu với thuốc nhuộm, bắt màu vào vùng nhân tốt Có khác biệt rõ rệt hình ánh mẫu nhuộm theo ngày Ở mẫu nhuộm ngày cho hình ảnh đẹp, rõ ràng, sắc nét Ờ ngày nuôi khác, thuốc nhuộm bắt màu vào nhân không rõ ràng Tuy nhiên, quan sát nhân cua tế bào táo, chưa quan sát NST cùa tảo Chúng tiến hành bổ sung thêm NaOH 2,5 % đề tăng bắt màu cúa thuốc nhuộm vào vật chất di truyền Ânh hường cúa thời gian bổ sung NaOH 2,5% vào thuốc nhuộm acetocarmine 1% lên bắt màu cúa nhân tế bào táo s mangrovei PQ6 dược trình bày hình Khi bố sung thêm dung dịch NaOH 2.5% vào thuốc nhuộm acetocarmine 1% thời gian khác nhau: 30 phút, 1, 2, 3, Sau đó, rữa mẫu với hồn hợp axít ethanol: axít axetic (98:2 v/v) làm tiêu bán nhuộm Ket quà nghiên cứu thu cho thấy việc bố sung thêm NaOH 2,5 % vào thuốc nhuộm làm Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 36 Khóa luận tốt nghiệp 2015 rút ngắn thời gian bắt màu với thuốc nhuộm mẫu, tăng độ tương phán vùng bắt màu với thuốc nhuộm Do vậy, nhân tế bào dễ quan sát Như vậy, qui trình nhuộm nhân tối ưu táo mangrovei PQ6 mầu tào ni cấy ngày, sau mẫu cố định dung dịch paraformandehyt 4% ngày Tiếp đó, tế bào sau cố định dược nhuộm với thuốc nhuộm acetocarmine 1% có bố sung thêm dung dịch NaOH 2,5% thời gian rữa mẫu bang hỗn hợp axít ethanol: axil axetic (98:2 v/v) cho hình ánh đẹp, nhìn rõ nhân, độ tương phán cao phan nhuộm không nhuộm Hình Nhuộm nhân ẹiịạ tảo S mạngrovei PQ6 vói thuốc nhuộm acetocarhiitie %.Co bo Sling them Nat )H 2,5%' II3 N Ọ1 Trong trình nhuộm nhân tế bào táo với thuốc nhuộm acetocarmine 1%, quan sát số lượng nhân cùa tào bắt màu với thuốc nhuộm thay đổi từ 1, 2, 4, tùy thuộc vào giai đoạn sinh trường tào Hình 10 minh họa số lượng nhân bat màu với thuốc nhuộm acetocarmine 1% quan sát điều kiện thí nghiệm cùa chúng tơi nhân Hình 10 Số lưọng nhân cùa tảo s mangrovei PQ6 bắt màu với thuốc nhuộm acetocarmine 1% Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 37 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Ket nghiên cứu thu tương đong với kết công bố Honda cs (1998) [23] nhuộm nhân cùa táo Schizochytrium limacinum với thuốc nhuộm DAPI Tào s limacinum có tượng đa nhân, số lượng nhân tế bào thay đồi phụ thuộc vào giai đoạn sinh trường cùa tảo Te bào sinh dưỡng phân chia liên tục không phân chia màng tế bào hình thành cụm tế bào đa nhân chứa 16 nhân Túi động bào từ phát triền chứa 30 động bào từ, mồi bào từ chi có nhân Như vậy, kết quà cung cấp sở khoa học đế khăng định xác lồi tảo chúng tơi sứ dụng nghiên cứu thuộc chi Schizochytriunt 3.4 NHUỘM MẨU BẰNG THUỐC NHUỘM GIÊMSA 4% Khi nhuộm tế bào tảo với thuốc nhuộm acetocarmine 1% chi quan sát nhân số lượng nhân tào s mangrovei PQ6, không quan sát NST cùa tảo Do vậy, tiến hành nhuộm thừ mẫu táo với thuốc nhuộm giêmsa - thuốc nhuộm bat màu hồng với vật chất di truyền Ket quà nhuộm mẫu tế bào tào s PQ6 lỴÓị thược nhuộm giêmsa 4% trình bày hình 11 Hình 11 Nhân NST táo s mangrovei PQ6 nhuộm thuốc nhuộm giêmsa 4% Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 38 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Ket thu được chi hình 11 cho thấy: Với qui trình nhuộm NST với thuốc nhuộm giêmsa 4% cho kết tốt Màng tế bào bị vỡ hoàn toàn, nhân tế bào bắt màu hồng đậm, số lượng nhân thay đổi tùy trạng thái tế bào (1, 2, 4, nhân quan sát được) Chúng quan sát điềm bắt màu hồng, có dạng hình que dấu phẩy số tế bào Tuy nhiên, số lượng tế bào quan sát dạng chưa có tính lặp lại Do vậy, tạm kết luận tào có số lượng NST (n= 3) 3.5 NHUỘM NHIỄM SẮC THÊ BẰNG THUỐC NHUỘM DAPI Do NST cùa tào nhỏ có hình dạng tương đồng nên khó quan sát kính hiến vi quang học nhuộm tế bào bang thuốc nhuộm thơng thường Do đe tăng tính đặc hiệu cho NST tiếp tục sử dụng thuốc nhuộm DAPI - chat gắn vào sợi ADN phát huỳnh quang bước sóng 390 nm DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết mạnh mẽ với vùng giàu AT ADN Nó sử dụng rộng rãi kính hiển vi huỳnh quang Do thuốc nhuộm DAPI qua màng tế bào nguyên vẹn nên sừ dụng đề nhuộm màu cà tế bào sống cố dịnh Tuy nhiên, tế bào sqng, chat qua màng hiệu hiệu nhuộm Ket quà nhuộm NST cúa tão s mangrovei PQ6 với thuốc nhuộm DAPI soi kính hiến vi huỳnh quang trình bày hình 12 Hình 12 Nhuộm NST tào s mangrovei PỌ6 vói thuốc nhuộm DAPI (Độ phóng đại ảnh 500X) Đồn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 39 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Kết thu được trình bày hình 12 cho chúng tơi thấy số lượng mẫu có bội số điếm bắt màu với DAPI phát huỳnh quang chiếm tới 80% tống số mẫu quan sát Tuy nhiên, ảnh quang học mờ, tế bào bị tan vón cụm lại nên so lượng tế bào cụ thế/ mẫu chúng tơi khơng quan sát Ngồi ra, chúng tơi quan sát thấy số mẫu bát màu DAPI phát huỳnh quang 2, 4, 5, 10 điếm sáng mẫu quan sát Như vậy, số lượng điếm sáng bắt màu với thuốc nhuộm DAPI phát huỳnh quang mẫu tảo s mangrovei PQ6 chưa có tính logic Tuy nhiên, kết hợp với kết quà nhuộm tế bào với thuốc nhuộm giêmsa 4% quan sát kính hiển vi quang học, chúng tơi tạm kết luận rang tảo s mangrovei PQ6 có nhiễm sac thể (n = 3) 3.6 MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN ẢNH HƯỞNG TỚI KÊT NHUỘM MẪU Chúng chưa thể xác định xác số lượng NST xây dựng kiều nhân (karyotype) vi tảo biến dị dưỡng mangrovei PQ6 chưa thu nhiều tiêu giai đoạn metaphase số lượng NST thu dao động phương pháp nhuộm khác Kết q nhuộm khơng tốt có thề số yếu tố sau: Thư vịện yjện Đại họC yQ |_Ịà Nội a Thời điếm lấy mẫu Việc chọn lựa thời điếm lấy mầu ảnh hưởng lớn đến kết nhuộm Thời gian lấy mẫu dạng tế bào (động bào tử, amip hay tế bào sinh dưỡng hình cầu) tuồi tế bào (sau 2, 3, ngày nuôi cấy) ánh hướng tới số lượng mẫu thu giai đoạn metaphase - giai đoạn NST cuộn xoắn cực đại tập trung mặt phăng xích đạo giai đoạn này, NST quan sát rõ Trong thí nghiệm chúng tơi, tiêu bàn thu giai đoạn thấp, chưa quan sát dược rõ NST tào Hưn nữa, chọn không dũng thời diem lấy mầu anh hướng đến trình nhuộm tế bào có thành phan khác gây nhiễu hình ánh quan sát minh họa hình 13 Đồn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 40 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Hình 13 Ảnh minh họa tế hào ỡcác thịi điểm ni cấy khác nhuộm mẫu giêm sa 4% b Thao tác ni cấy phịng thí nghiệm Tủ cấy dụng cụ thao tác phải chiếu tia uv trước mồi lần thực hiện, lất dụng cụ phải khứ trùng cấn thận trước mang vào phòng cấy lú cấy vô trùng Việc nuôi cay mẫu phải đảm báo vơ trùng mẫu bị nhiễm (ví dụ vi khuần) nhuộm NST cúa tào bị nhầm lẫn với vi khn vi khuân có bát màu dặc trưng với thuốc nhuộm (Hình 14) Hình 14 Ânh minh họa mẫu bị nhiễm vi khuẩn nhuộm NST mangrove! PQ6 thuốc nhuộm giêm sa 4% c Thời gian nhược trương mầu Chúng tiến hành nhược trương mầu với dung dịch KC1 0.075M 30 phút Với thời gian này, nhận thấy số tế bào màng nhân cịn NST khơng thể bung khơng trài lam kính (Hình 15) Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 41 Khóa luận tốt nghiệp 2015 Hình 15 Ánh minh họa tế bào tảo s mangrove! PQ6 không bị võ’ màng tế bào nhuộm vói thuốc nhuộm giêmsa 4% d Thiết bị thí nghiệm Độ phóng đại kính hiển vi độ phân giải cùa máy ánh yếu tố ảnh hướng lớn đến kết quà Ban đầu chúng tơi chụp hình bang máy kỹ thuật số, hình thu mờ khó nhận dạng nhiễm sắc thể Khi chuyển sang chụp máy ành có gắn trực tiếp lên kính hiến vi ảnh đẹp có the quan sát nhiễm sac rõ Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Đồn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 42 Khóa luận tốt nghiệp 2015 KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết trình bày nêu cho phép xin rút số kết luận sau: 1/ Để quan sát nhân tế bào tâo s mangrovei PQ6 với độ tương phán cao sứ dụng mầu táo sau ngày nuôi, cố định mầu với dung dịch carnoy lần nhuộm với thuốc nhuộm acetocarmine 1% có bỗ sung dung dịch NaOH 2,5% thời gian Sau nhuộm 45 phút với thuốc nhuộm, mẫu hồn hợp ethanol: axít axetic (tý lệ 98: v/v) 2/ Tảo s mangrove! PQ6 có tượng đa nhân, số lượng nhân tảo thay đối từ 1,2, 4, phụ thuộc vào giai đoạn phát triền tào 3/ Với qui trình nhuộm tào s mangrove! PQ6 thích hợp: nhược trương bang dung dịch KC1 0.075M ống fancol với thời gian 30 phút Sau mẫu cố định dung dịch carnoy nhuộm nhiễm sắc the cùa tảo thuốc nhuộm giêmsa 4% thuốc nhuộm DAPI nhuộm nhiễm sac thể cùa tào Tuy nhiên, số lượng nhiễm sắc thể thu ciia tảo có khác chưa mang tính qui luật tỷ lệ thành công thấp chưa đù sở đề kết luận số lượng nhiễm sắc xác chùng PQ6 KIÊN NGHỊ Qua kết nghiên cứu thu dược nêu trên, xin dưa số kiến nghị cho nghiên cứu sau: ■ Khào sát thêm thời gian ngâm colcemid đoi với tế bào tào mangrove! PQ6 đổ thu số lượng tế bào dừng pha metaphase nhiều ■ Tiếp tục nhuộm tế bào táo với thuốc nhuộm DAPI đế thu liệu khoa học số lượng nhiễm sắc thế, từ tiến hành phân tích thống kê đê thu kết xác số lượng nhiễm sac cúa lồi tảo s mangrove! PQ6, từ xác định karyotype táo ■ Sử dụng phương pháp điện di xung điện trường đế xác định số lượng nhiễm sắc thể tào s mangrove! PQ6 Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 43 Khóa luận tốt nghiệp 2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIÊNG VIỆT I Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Ngọc Mai, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng (2009) Nghiên cứu số đặc điêm sinh học chúng vi tào biền dị dưỡng giàu DHA Schizochytrium sp TB17 phân lập từ vùng rừng ngập mặn Diêm Điền, Thái Bình Báo cáo khoa học hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, Công nghệ sinh học phục vụ Nông - Lâm nghiệp Thủy sán Công nghiệp, Y- dược bão vệ môi trường, Thái Nguyên NXB Thái Nguyên 492 - 496 Nguyễn Như Hiền (2005) Sinh học phân tứ tế bào ca sở khoa học cùa công nghệ sinh học NXB GD, Hà Tây 133-192 Đặng Diễm Hồng, Hồng Lan Anh, Ngơ Hồi Thu (2008) Phân lập vi tảo biến dị dưỡng Schizochytrium giàu DHA vùng biển Huyện đảo Phú Quốc Tạp chí sinh học 30(2): 50-55 Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền Phạm Hồng Sơn (2006) Sứ dụng rong biên Việt Nam ngn thực phàm chức năng, thc phân bón Kỹ yếu 2006-Viện Công nghệ Sinh 'hợc-yiện khơạ họè Công nghệ Việt Nam NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ 241-243 Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phước Hiền (1999) Công nghệ sinh học vi tào NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Ngô Ke Sưong, Nguyễn Thị Quý, Nguyễn Văn Hòa (1994) Ket quã bước đầu nghiên cứu tào lam cố định nitơ Tạp chí sinh học, 16(3): 50-54 Ngơ Hồi Thu, Hồng Lan Anh, Đặng Diềm Hồng (2010) Nghiên cứu ứng dụng sinh khối vi táo biển Schizochytrium mangrovei PQ6 sứ dụng cho thức ăn tươi tu hài ngao (Lutraria Rhynchcana Jones) Tạp chí sinh học, 32(4): 83-88 Dưong Đức Tiến Võ Văn Chi (1978) Phân loại học thực vật- thực vật bậc thấp NXB ĐH THCN Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Allen MB (1959) Studies with Cyanidium caldarium, an anomalously pigmented chiorophyte Arch Microbiol, 32: 270-277 Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 44 Khóa luận tốt nghiệp 2015 10 Bonner JT, Frascella EB (1953) Variations in cell size during the development of the slime mold Dictyostelium discoideum Biol Bull, 104: 297-300 11 Booth (1971) Occurrence and distribution of some zoosporic fungi from soil of Hibben and Moresby Islands, Queen Charlotte Islands Can J Bol, 49: 951-965 12 Borowitzka MA (1995) Microalgae as source of pharmaceuticals and other biologically active compounds J Appl Algol, 7: 3-15 13 Bourre GM, Durrand G Pascal G, Youyou A (1989) Brain cell and tissue recovery in rats made deficient in n-3 fatty acids by alteration of dietary fat J Nut., 119: 15-22 14 Cohen D Finkel A, Sussman M (1976) On the role in larviculture of Macrobrachium rosenbergii Aquaculture, 8:199-207 15 Critchley T, Ohno M (1998) Seaweed resources of the Wrold JICA, Yokosuka 16 Eldridge FE (1985) Laboratory Producers for chromosome studies Cytogenetic of liverstock 93-112 17 Fritz L, Triemer RE (1983) An ultra-structural study of mitosis in a marine dinoflagellate: Proppceptrum minimum J.^Ppotqzpql,30: 437-444 18 Fujimura T, Okamoto H (1972) Notes on progress made in developing a mas culturing technique for Marcrobachium rosenbergii in Hawaii Coastal Aquaculture in the Indo-Pacific Region, 313-27 l9 Gaertner A (1977) Revision of the Thraustochytriaceae (lower marine fungi) I Ulkenia nov gen., with description of three new species Veroff Inst Meeresforsch Bremerh, 16:139-157 20 Gross w (1999) Revision of comparative traits for the acido- and thermophilic red algae Cyanidium and Galdieria Enigmatic Microorganisms and Life in Extreme Enviroments, 437-446 21 Herbert CM, Jennifer MV (1983) Working with animal chromosome nd ed Books, 290 pages 22 Hitoshi K Hiroshi Y, Jun T (1967) The Number of Chromosomes in some Species of Porphyra Bull Fac Fish., Hokkaido Univ., XVIII, Đoàn Thị Hà Thu - Lớp: KS.CNSH 11-04 45 Khóa luận tốt nghiệp 2015 23 Honda D Yokochi T, Nakahara T, Erata M Higashihara T (1998) Schizochytrium limacinum sp nov., a new thraustochytrid from a mangrove area in the west Pacific Ocean Mycol Res, 102: 439-448 24 Hong DD, Hoang LA, Ngo HT (2011) Study on biological characteristics of heterotrophic marine microalga - Schizochytrium mangrovei PQ6 isolated from Phu Quoc Island, Kien Giang Province, Vietnam Journal of Phycology, 47(4): 944-954 (SCI, IF= 2,071) 25 Lewis TE Nicols PD, Mckeekin TA (1999) The biotechnological potential of thraustochytridỏ' Mar Biotechnol, 1: 580-587 26 Loeblich AR Hedberg MF (1976) Desmokont mitosis: involvement of several microtubule containing channels Botanica Mar, 19: 255-256 27 Maddox MB, Sandifer PA, Manzi JJ (1977) Algal supplement enhancement of Macrobrachium rosenbergii (de Man) larviculture Proc Wld Mariculture Soc, 8:207-223 28 Malecha SR (1983) Commercial seed production of the freshwater prawn, MacrơbrachinuỊn^ỵ>s^hffgự,\ iy Hawaii CRC Hapdl?ool