Bài viết này nghiên cứu tiến hành trên 58 mẫu máu cuống rốn trẻ sơ sinh được xác định phơi nhiễm asen trước sinh. Mẫu máu được nuôi cấy bạch cầu lympho trong 72 giờ, làm tiêu bản nhiễm sắc thể (NST) và vi nhân, nhuộm Giemsa và phân tích.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 BẤT THƢỜNG NHIỄM SẮC THỂ Ở TẾ BÀO MÁU DÂY RỐN TRẺ SƠ SINH PHƠI NHIỄM ASEN TRƢỚC SINH Trần Văn Khoa*; Nguyễn Khắc Hải**; Ngô Trường Giang* Nguyễn Thị Thanh Nga*; Nguyễn Thị Việt Hà* TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành 58 mẫu máu cuống rốn trẻ sơ sinh xác định phơi nhiễm asen trước sinh Mẫu máu nuôi cấy bạch cầu lympho 72 giờ, làm tiêu nhiễm sắc thể (NST) vi nhân, nhuộm Giemsa phân tích Kết cho thấy, nhóm nghiên cứu tần số bất thường NST 1,10% tần số vi nhân 0,57% Trong đó, nhóm chứng tần số tương ứng 0,56% 0,11% Ở trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh có tần số vi nhân bất thường NST tế bào bạch cầu máu cuống rốn cao so với nhóm chứng (p < 0,05) Tần số bất thường NST nhóm phơi nhiễm cao nhóm chứng, song khác biệt hai nhóm chưa có ý nghĩa thống kê * Từ khoá: Phơi nhiễm asen trước sinh; Bất thường NST CHROMOSOME ABERRATIONS IN CORD BLOOD CELLS OF INFANTS PRENATALLY EXPOSURED WITH ARSENIC SUMMARY The study was carried out on 58 cordblood samples from infants prenatally exposured with arsenic Blood cells were cultured for 72 hours and chromosome and micronucleus slides were made and analyzed The results showed that chromosome aberration frequency was 1.10% and micronucleus frequency was 0.57% in exposured group Meanwhile the frequencies were 0.56% and 0.11% respectivly in the control group Micronuleus frequency in arsenic prenatal exposured group is higher than that in comparision with control group (p < 0.05) Chromosome aberration frequency was not statistically significal difference between the two groups * Key words: Prenatal arsenic exposure; Chromosome aberrations ĐẶT VẤN ĐỀ Đã từ lâu, asen cho tác nhân gây biến đổi di truyền mức độ tế bào phân tử Có nhiều kỹ thuật khác đánh giá bất thường di truyền Trên giới, có nhiều cơng trình nghiên cứu biến đổi NST người lớn tiếp xúc với asen cho thấy có biến đổi liên quan [1, 6] Tuy nhiªn, nghiên cứu biến đổi NST trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh hạn chế Đặc biệt Việt Nam, chưa có nghiên cứu biến đổi di truyền tế bào trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh Vì vậy, tiến hành nghiên cứu nhằm: Ứng dụng số kỹ thuật di truyền tế bào đánh giá bất thường di truyền trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh * Học viện Quân y ** Viện Y học Lao động Vệ sinh môi trường Người phản hồi: (Corresponding): Trần Văn Khoa (tranvankhoa@yahoo.com) Ngày nhận bài: 21/12/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 3/1/2014 Ngày báo đăng: 20/1/2014 43 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 58 mẫu máu cuống rốn trẻ sơ sinh lấy từ sản phụ Hà Nam từ tháng - 2013 đến 10 - 2013 Những đối tượng xét nghiệm định lượng asen nước tiểu trước mang thai phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Khoa Xét nghiệm Phân tích kỹ thuật cao, Viện Y học Lao ®éng cho thấy nồng độ asen cao (> 60 µg/l) Mẫu đối chứng lựa chọn từ thai phụ khu vực, nồng độ asen nước tiểu thấp Lấy mẫu máu lấy vào xylanh vơ khuẩn, có chất chống đơng heparin, vận chuyển vòng 24 Học viện Quân y trước nuôi cấy Phƣơng pháp nghiên cứu * Nuôi cấy tế bào bạch cầu máu ngoại vi: Đối tượng nghiên cứu lấy ml máu tĩnh mạch, chống đông heparin giọt máu tồn phần (0,5 ml) ni cấy ống nuôi cấy tủ ấm 370C, 5% CO2 72 Mỗi ống gồm ml môi trường RPMI-1640 (Gibco), ml huyết bào thai B (Gibco), chất kích thích phân bào (PHA) 100 μl nồng độ 0,24 mg/ml, kháng sinh (antibiotic antimycotinic) 100X (Gifco) * Thu hoạch mẫu làm tiêu NST: Nhỏ 30 μl colcemid nồng độ 10 μg/ ml/mẫu trước thu hoạch 45 phút Thu hoạch mẫu, làm tiêu NST: ly tâm ống mẫu 1.500 vòng/phút/10 phút, hút bỏ dịch nổi, nhược trương ml dung dịch KCl 0,4%, cố định ml dung dịch carnoy I:3 (3 methanol gốc/1 axít acetic) x lần Cuối cùng, ly tâm 1.500 vòng/phút/10 phút, hút bỏ dịch nổi, giữ lại phần cặn lắng khoảng 200 - 250 µl để nhỏ từ - tiêu bản/mẫu, để khô tiêu bản, nhuộm Giemsa 10% đệm phosphat/6 - phút Phân tích NST: phân tích kính hiển vi quang học độ phóng đại 1.000X Xác định bất thường NST: đa bội, NST hai tâm động (dic), NST hình vòng (r = ring), đoạn đứt không tâm (af = acentric fragment), gap, isogap, trao đổi nhiễm sắc tử, chấm kép (minus) Phân tích ≥ 100 cụm kỳ (metaphase)/mẫu Xử lý thống kê phần mềm Medcalc * Thu hoạch mẫu, làm tiêu vi nhân (MN): Nhỏ 30 µl cytochalasin B (6 µg/1 mẫu) thứ 44 trước thu hoạch Sau đó, tiếp tục ủ mẫu tủ ấm 370C Giờ thứ 72, lấy mẫu, chuyển sang ống ly tâm đáy nhọn, ly tâm 800 vòng/phút/6 phút Hút loại bỏ dịch bên trên, giữ lại khoảng ml mẫu cặn, trộn nhẹ Cho ml KCl 0,075 M/ống falcon mới, trộn nhẹ, thêm giọt formaldehyde 37%, trộn nhẹ Để nhiệt độ phòng - phút Thêm ml carnoy I trộn nhẹ (tiền cố định) Ly tâm 800 vòng/phút/6 phút, sau đó, hút bỏ dịch bên trên, giữ lại khoảng ml cặn Cố định: nhỏ giọt, giọt, giọt carnoy I lên thành ống, trộn nhẹ sau lần nhỏ Sau cho thêm carnoy I vào cho đủ ml/mẫu, trộn nhẹ, để tủ lạnh 20 phút Ly tâm mẫu 800 vòng/phút/6 phút Loại bỏ dịch bên trên, giữ lại ml cặn Lặp lại bước (rửa carnoy I) - lần, cuối ly tâm, hút bỏ dịch nổi, giữ lại khoảng 200 250 µl mẫu cặn để nhỏ từ - tiêu bản/mẫu [3] Nhỏ tiêu bản: nhỏ 2, giọt khoảng 70 µl mặt lam phẳng, để khơ tự nhiên Bảo quản tiêu tủ ấm 370C, tránh ẩm, bụi Nhuộm Giemsa 10%/5 - 10 phút, rửa nước cất, để khơ Chỉ tiêu phân tích vi nhân theo tiêu chí Heddle (1976) [2]: phân tích kính hiển vi quang học, độ phóng đại 400X; phân tích tế bào bạch cầu hai nhân; tế bào có màng bào tương bao quanh rõ riêng biệt với tế bào khác; tế bào có hai nhân khơng chồng lên nhau; đường kính vi nhân > 1/3 đường kính nhân Tính tần số vi nhân chung cho mẫu nghiên cứu 45 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tỷ lệ bất thƣờng NST Trong số 58 mẫu máu cuống rốn trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh, thu kết bất thường NST sau: Bảng 1: Tổn thương NST nhóm nghiên cứu nhóm chứng NHĨM SỐ TẾ BÀO BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC NHIỄM SẮC TỬ gap đứt gap Trao đổi nhiễm BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC NHIỄM SẮC THỂ Đứt minus dic tri R TỔNG BẤT THƯỜNG MEAN (%) SD* sắc tử 0 0 0 0,56 1,01 51 1 0 63 1,1 0,37 900/9 5800/58 Chứng Nghiên cứu p 0,26 Tần số tổn thương NST/100 tế bào nhóm trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh cao so với nhóm chứng, khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tần số vi nhân Bảng 2: Tần số vi nhân nhóm nghiên cứu nhóm chứng NHĨM (sè tÕ bµo) HÂN VI Nhóm nghiên cứu (29.000/58) 27 Nhóm chứng (4.500/9) VI NHÂN VI NHÂN TỔNG TẦN SỐ (%) 33 0,57 0,56 p 0,02 0 0,11 0,33 (*: Tần số: số tổn thương trung bình/500 tế bào/mẫu) Tần số vi nhân nhóm nghiên cứu cao nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 1: Đoạn đứt khơng tâm mẫu HT09 Hình 2: Một vi nhân mẫu HT03 46 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 Karen Harrington CS (1999) nghiên cứu ảnh hưởng phơi nhiễm asen lên NST tế bào bạch cầu máu ngoại vi Antofagasta, Chile Trong nghiên cứu này, tiến hành phân tích 120 công nhân làm việc nhà máy mạ, cách Bắc Antofagasta vài dặm, Chile Lấy tế bào máu ngoại vi ni cấy, sau phân tích metaphase, phân tích 50 - 200 metaphase/mẫu Kết cho thấy người làm việc lâu năm bị phơi nhiễm asen cao có tần số biến đổi NST lớn có ý nghĩa so với công nhân làm việc bị phơi nhiễm asen thấp (p < 0,05) [4] Mahata CS (2003) (tại tây Bengal, Ấn Độ) sử dụng kỹ thuật nhuộm đặc Giemsa NST, thấy tần số bất thường NST nhóm phơi nhiễm asen 8,08%, nhóm chứng 1,96% [5] Sujata DC, 2008 (tây Bengal, Ấn Độ) sử dụng kỹ thuật đánh giá tổn thương NST nhóm có tổn thương da asen nhóm khơng tổn thương da [9] Pritha Ghosha CS cho thấy bất thường NST sử dụng làm thị đánh giá nguy ung thư người bị nhiễm asen [7] Về mối liên quan bất thường NST vi nhân có nhiều nghiên cứu chứng minh [0] Kỹ thuật di truyền tế bào kỹ thuật phân tích nhanh, gián tiếp đánh giá bất thường NST Trong nghiên cứu sử dụng hai kỹ thuật đồng thời KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, rút nhận xét kết luận sau: Nghiên cứu phát bất thường NST nhóm đối tượng gồm 58 mẫu máu cuống rốn trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh, phát thấy tần số vi nhân nhóm trở sơ sinh có phơi nhiễm asen trước sinh cao nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Tỷ lệ bất thường NST chung 1,10%, cao nhóm chứng, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Nghiên cứu tiếp tục với cỡ mẫu nghiên cứu lớn TÀI LIỆU THAM KHẢO Basu A, J Mahata, AK Roy, JN Sarkar, G Poddar, AKNandy, PK Dutta et al Enhanced frequency of micronuclei in individuals exposed to arsenic through drinking water in West Bengal, India, Muta Res 2002, 516, pp.29-40 Countryman PI, Heddle JA The production of micronuclei from chromosome aberrations in irradiated cultures of human lymphocytes Mutation Research.1976, 41, pp.321-332 Fenech M, Morley AA Measurement of micronuclei in lymphocytes Mutation Research 1985, 147, pp.29-36 Karen Harrington-Brock a, Marta Cabrera b, Deborah D Collard a, Carolyn L Doerr a, Rob McConnell c, Martha M Moore a, Hernan Sandoval d, James C Fuscoe a Effects of arsenic exposure on the frequency of HPRTmutant lymphocytes in a population of copper roasters in Antofagasta, Chile: a pilot study Mutation Research 1999, 431, pp.247-257 Mahata J et al A chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in individuals exposed to arsenic through drinking water in West Bengal, India Mutation Research 2003, 534, pp.133-143 Martinez V, A Creus, W Venegas, A Arroyo, JP Beck, TW Gebel, J Surralles, R Marcos Micronuclei assessment in buccal cells of people environmentally exposed to arsenic in northern Chile Toxicol Lett 2005, 155, pp.319-327 Pritha Ghosha Increased chromosome aberration frequencies in the Bowen's patients compared to non-cancerous skin lesions individuals exposed to arsenic Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 2007, 632 (15), Iss1-2, August, pp.104-110 Savage JRK Some comments on the relationship between chromosomal aberrations and MN Clinical Cytogenetics Bulletin 1988, 2, pp.32-34 Sujata De Chaudhuri Arsenic-induced health effects and genetic damage in keratotic individuals: Involvement of p53 arginine variant and chromosomal aberrations in arsenic susceptibility Mutation Research 2008, 659, pp.118-125 47 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 ... mẫu máu cuống rốn trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh, phát thấy tần số vi nhân nhóm trở sơ sinh có phơi nhiễm asen trước sinh cao nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Tỷ lệ bất thường. .. Tỷ lệ bất thƣờng NST Trong số 58 mẫu máu cuống rốn trẻ sơ sinh phơi nhiễm asen trước sinh, thu kết bất thường NST sau: Bảng 1: Tổn thương NST nhóm nghiên cứu nhóm chứng NHĨM SỐ TẾ BÀO BẤT THƯỜNG... NHĨM SỐ TẾ BÀO BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC NHIỄM SẮC TỬ gap đứt gap Trao đổi nhiễm BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC NHIỄM SẮC THỂ Đứt minus dic tri R TỔNG BẤT THƯỜNG MEAN (%) SD* sắc tử 0 0 0 0,56 1,01 51 1 0 63