Xây dựng quy trình Real-Time PCR phát hiện bệnh do vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra trên Tôm.pdf

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NG I YEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP XÂY DựNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN BỆNH DO VI BÀO TỬ TRÙNG Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) GÂY RA TRÊN TÔM Sinh viên thực : Đỗ Thị Như Thảo Mã số sinh viên : 1511542399 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dần : ThS Giang cẩm Tú ThS N Phạm Trúc Phương TP HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TẤT THÀNH CỘNG HÒA XÀ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc oOo - - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Đồ Thị Như Thảo MSSV: 1511542399 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 15DSH1B Đầu đề luận văn: Xây dựng quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaeì (EHP) gây tôm Mục tiêu - Xây dựng thành công quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây tôm Nội dung: - Thiết kế mồi probe đặc hiệu đề phát EHP - Xây dựng tối ưu hóa quy trình Real-time PCR - Thử nghiệm quy trình Real-time PCR tối ưu phát bệnh vi bào tử trùng EHP 20 mầu tơm ngồi thị trường Thời gian thực hiện: tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Người hướng dần chính: ThS Nguyễn Phạm Trúc Phương Người hướng dẫn phụ: ThS Giang cẩm Tú Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng năm20 Bộ MÔN CÁN Bộ HƯỚNG DẢN LỜI CẢM ƠN Đe hoàn thành đề tài này, xin cám ơn đến cha mẹ bên cạnh ủng hộ, chăm lo, động viên, hồ trợ cho từ vật chất đến tinh thần Em xin chân thành cảm ơn đến thầy cô giảng viên khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, trực tiếp giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu cho em học trường Em xin cám ơn Ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu Phát triến Nông nghiệp - Khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao - Phịng Sinh học phân tử tạo điều kiện tốt để em có thời gian học tập làm khóa luận Đây kinh nghiệm quý báu cho em để bước vào môi trường làm việc sau tốt Bên cạnh đó, em xin cám ơn đến Giang cấm Tú cô Nguyền Phạm Trúc Phương, người trực tiếp tận tình hướng dần, xem xét, chia sẻ kinh nghiệm quý báu cung cấp kiến thức cần thiết giúp đỡ em hồn thành khóa luận cách tốt Cùng với anh chị làm việc trung tâm nghiên cứu đà nhiệt tình giúp đỡ, dạy em nhiều điều thời gian làm đề tài Cám ơn tập the lóp 15DSH1B ln bên cạnh hồ trợ, giúp đỡ q trình hồn thành khóa luận Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình làm khóa luận tốt nghiệp em khơng tránh khởi sơ sót, kính mong nhận lời góp ý từ Q thầy đế khóa luận hồn thiện Cuối em xin kính chúc Ọ thầy dồi sức khỏe thành công nghiệp cao quý Em xin chân thành cám ơn! ĐỒ Thị Như Thảo Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT iv SUMMARY V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG BIẾU vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ ix CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ni trồng thủy sản Việt Nam năm 2018 1.2 Sơ lược bệnh vi bào tử trùng tôm 1.2.1 Vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei 1.2.2 Tình hình bệnh thủy sản vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei 1.2.3 Phương pháp phát vi bào tử trùng 1.3 Kỹ thuật Real-time PCR 1.3.1 Giới thiệu 1.3.2 Nguyên tắc hoạt động 1.3.3 Phản ứng Real-time PCR 1.4 Thiết kế mồi 1.4.1 Khái niệm mồi 1.4.2 Các loại mồi 10 1.4.3 Ý nghía lựa chọn mồi 10 1.4.4 Các tiêu chí thiết kế mồi 11 1.5 Kỳ thuật điện di 13 1.6 Tình hình nghiên cứu nước 13 1.6.1 Tình hình nước 13 ii 1.6.2 Tình hình giới 14 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN cứu 16 2.1 Nơi thực 16 2.1.1 Vật liệu 16 2.1.2 Bảo quản 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Thiết kế mồi probe 16 2.3.2 Xây dựng tối ưu hóa quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây tôm 19 2.3.3 Khảo sát thông số kỳ thuật 22 2.3.4 Thử nghiệm quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây tôm với mẫu tơm ngồi thị trường 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Mồi, probe đặc hiệu để phát EHP kiểm tra độ đặc hiệu 25 3.1.1 Mồi, probe đặc hiệu để phát EHP 25 3.1.2 Độ đặc hiệu phản ứng với tác nhân khác 28 3.2 Quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây tôm 29 3.2.1 Độ hoạt động thực tế mồi probe 29 3.2.2 Tối ưu hóa quy trình Real-time PCR 31 3.2.3 Độ nhạy kỳ thuật 34 3.3 Thử nghiệm quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) với mầu tôm thị trường 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 41 iii TÓM TẤT Đe tài: “Xây dựng quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây tôm” thực từ tháng 2/2019 đến tháng 8/2019 phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Tp.HCM Với mục tiêu xây dựng thành công quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây tôm Đe tài có ba nội dung: Thiết ke moi , probe đặc hiệu đe phát EHP dựa trình tự amplicon SWP; Xây dựng tối ưu hóa quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei Thử nghiệm quy trình Real­ time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây tơm với mầu tơm ngồi thị trường Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Thiết kế thành công mồi probe dựa trình tự amplicon SWP Tối ưu hóa quy trình Real-time PCR Áp dụng thành cơng việc sử dụng kit Exgene TM Tissue DNA/RNA Tiến hành Real-time PCR với 20 sản phàm ly trích DNA từ mầu tôm thu IV SUMMARY Topic “Development of Real-time PCR procedure to detect disease caused by Enterocytozoon hepatopenaei microsporidian (EHP) germs on shrimp” was made from 2/2019 to 8/2019 in Molecular biology Lab, Research and Development center for High-tech Agriculture in Ho Chi Minh city Target of topic successfully development Real-time PCR process to detect disease caused by Enterocytozoon hepatopenaei microsporidian (EHP) germs on shrimp The topic has three contents: Design specific primers, specific probe to detect EHP based on the SWP amplicon sequence; Develop and optimize Real-time PCR process to detect disease caused by Enterocytozoon hepatopenaei microsporidian and Test of Real-time PCR to detect disease caused by Enterocytozoon hepatopenaei microsporidian (EHP) on shrimp with samples shirmp out of the market The results achieved after months of study: Successfully designed specific primers, specific probe based on the SWP amplicon sequence Optimize Real-time PCR process Successfully applied the use of Exgene TM Tissue DNA/RNA kit Conduct Real-time PCR with 20 DNA extract products from shrimp samples V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH • Hình 1.1 Mơ gan tụy bị nhiễm EHP Hình 1.2 Bào tử trưởng thành gan tụy tôm sú Hình 1.3 Kỳ thuật Real-time PCR - huỳnh quang Hình 1.4 Kỳ thuật PCR - probe Hình 3.1 Ket kiểm tra mức độ giống moi SWP-1F 26 Hình 3.2 Kết kiềm tra mức độ giống mồi SWP-1R probe 27 Hình 3.3 Độ đặc hiệu cặp mồi probe SWP-1 phần mềm Annhyb 4.946 28 Hình 3.4 Biểu đồ khuếch đại tín hiệu huỳnh quang khảo sát độ đặc hiệu 29 Hình 3.5 Kết PCR khuếch đại DNA cặp mồi SWP1F/SWP1R 30 Hình 3.6 Khả hoạt động thực tế probe với cặp moi SWP 30 VI DANH MỤC • BẢNG BIÉU Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi cho phản ứng Real-time PCR 17 Bảng 2.2 Trình tự amplicon SWP 17 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt PCR 18 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng Real-time PCR 19 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt cho Real-time PCR 19 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng Real-time PCR tối ưu hóa Taqman probe 20 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho Real-time PCR tối ưu hóa Taqman probe 20 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng Real-time PCR tối ưu hóa Taqman probe 21 Bảng 2.10 Chu trình nhiệt cho Real-time PCR tối ưu hóa Taqman probe 21 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng Real-time PCR tối ưu hóa Taqman probe 22 Bảng 2.12 Chu trình nhiệt cho Real-time PCR tối ưu hóa Taqman probe 22 Bảng 3.1 Kiểm tra đặc tính mồi probe 25 Bảng 3.2 Kết tối ưu nồng độ mồi sWP-1F sWP-1R 31 Bảng 3.3 Kết tối ưu nồng độ probe SWP-1 32 Bảng 3.4 Ket tối ưu nhiệt độ bắt cặp 33 Bảng 3.5 Ket tối ưu thời gian bắt cặp moi 34 Bảng 3.6 Giá trị chu kì ngưỡng phản ứng Real-time PCR với nong độ DNA plasmid pha loãng 34 Bảng 3.7 Ket đo OD cùa 20 mầu tơm ngồi thị trường 36 Bảng 3.8 Ket chạy quy trình 20 mẫu tơm ly trích 37 vii DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT EHP : Enterocytozoon hepatoenaei ssu rRNA : RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ (Small subnit ribosomal RNA) TEM : Kính hiến vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope) BHQ : Quencher phát WSSV : Bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus) YHD : Bệnh đầu vàng (Yellow head disease) MBV : Bệnh còi (Monodon baculovirus) BMN : Bệnh virus hoại tủ tuyến ruột (Baculovirus migut gland necrosis) HPV : Bệnh Parvovirus gan tụy (Hepatopancreatic parovirus) SWP : Gen protein thành bào tử AHPND : Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease) IHHNV : Bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biêu mô (Hypothermal and hematopoietic necrosis virus) Vlll ... văn: Xây dựng quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaeì (EHP) gây tôm Mục tiêu - Xây dựng thành công quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon. .. phát EHP dựa trình tự amplicon SWP; Xây dựng tối ưu hóa quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei Thử nghiệm quy trình Real­ time PCR phát bệnh vi bào tử trùng. .. nhân trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Xây dựng quy trình Real-time PCR phát bệnh vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây tôm.” Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng thành cơng quy trình phát bệnh