Xây dựng quy trình phát hiện ký sinh trùng perkinsus olseni trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp pcr

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH VIỆN KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ CAO NTT NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGUYEN TAT THANH KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÂY DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG Perkinsus olseni TRÊN NHUYỄN THẺ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GVHD: ThS GIANG CẨM TÚ ThS NGUYỄN PHẠM TRÚC PHƯƠNG SVTH: LÊKHẢVY MSSV: 1811545662 LỚP : 18DSH1A TP HCM, tháng năm 2022 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn em xin gửi đến Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trung tâm nghiên cứu phát triển nông nghiệp công nghệ cao TP HCM đà tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gởi lời cảm ơn chân thành tới giảng viên hướng dần ThS Giang cấm Tú ThS Nguyền Phạm Trúc Phương người hướng dần trực tiếp em thời gian qua, tận tình dạy hướng dần em thực hành thí nghiệm hồn thành luận văn Em chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Công nghệ sinh học đà truyền đạt cho em tảng kiến thức cần thiết, hướng thơng tin bổ ích cho em đạt mục đích học tập Em muốn cảm ơn anh chị phịng thí nghiệm Trung tâm, anh chị Khoa bạn bè lớp giúp đỡ em khoảng thời gian qua Cuối cùng, vô biết ơn cơng lao dưỡng dục cha mẹ, tình u thương gia đình dành cho Và sau cùng, em xin kính chúc Q thầy Khoa Cơng nghệ sinh học dồi sức khỏe, niềm tin đe tiếp tục sứ mệnh trồng người Và em chúc tất người sức khỏe hồn thành khóa luận cách thành công, suôn sẻ Sinh viên Lê Khả Vy NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN 1/ Trình độ lý luận: 2/ Kỳ nghề nghiệp: 3/ Nội dung báo cáo: 4/ Hình thức báo cáo: Điểm: TP HCM, ngày thảng năm 2022 (ký ghi rõ họ tên) ii NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN 1/ Trình độ lý luận: 2/ Kỳ nghề nghiệp: 3/ Nội dung báo cáo: 4/ Hình thức báo cáo: Điểm: TP HCM, ngày thảng năm 2022 (ký ghi rõ họ tên) MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẦN II NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN III MỤC LỤC IV DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU VI DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VII KÝ HIỆU CÁC CỤM TÙ VIẾT TẤT VIII LỜI MỞ ĐÀU CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược bệnh ký sinh trùng Perkinsus oỉseni nhuyễn thề hai mảnh vỏ 1.2 Tình hình ni nhuyễn thể Việt Nam năm 2020 1.3 Tình hình bệnh nhuyễn the ký sinh trùng Perkinsus oỉseni Việt Nam 1.4 Các phương pháp phát ký sinh trùng Perkinsus olseni .6 1.5 Giới thiệu kỳ thuật PCR 1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 10 1.7 Kỹ thuật điện di 12 1.8 Tình hình nghiên cứu Perkinsus olseni gây bệnh nhuyễn thể 15 1.8.1 Các nghiên cứu nước 15 1.8.2 Các nghiên cứu nước 16 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 2.1 Địa điểm thời gian thực 19 2.2 Đối tượng nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.4 Nội dung phương pháp thực 19 2.4.1 Ly trích DNA 19 iv 2.4.2 Chọn lọc mồi cho phản ứng PCR 21 2.4.3 Xây dựng tối ưu hóa quy trình PCR phát ký sinh trùng Perkinsus olseni nhuyễn the hai mảnh vỏ giống Hàu (Crassostrea), Ngao (Meretrix) 24 2.4.4 Xác định thơng số kỳ thuật qui trình PCR điện di phát Perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ giống Hàu (Crassostrea), Ngao (Meretrix) TI 2.4.5 Bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phưong pháp PCR điện di phát Perkinsus olsenỉ mầu nhuyễn thể hai mảnh vỏ (nghêu) bệnh 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Ket kiểm tra độ hoạt động thực tế moi 28 3.2 Ket kiểm tra độ đặc hiệu mồi 28 3.3 Ket tối ưu hóa phản ứng PCR 30 3.3.1 Ket tối ưu nồng độ moi 30 3.3.2 Ket tối ưu nhiệt độ gắn moi 32 3.3.3 Ket tối ưu thời gian gắn mồi 33 3.4 Xác định thơng số kỳ thuật qui trình PCR điện di phát Perkỉnsus oỉseni nhuyễn the hai mảnh vỏ giống Hàu (Crassostrea), Ngao (Meretrix) 34 3.4.1 Ket độ đặc hiệu kỳ thuật 34 3.4.2 Kết độ nhạy kỳ thuật 35 3.5 Ket đánh giá quy trình PCR phát Perkỉnsus olseni mẫu thực tế 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 Kết luận 39 Đe nghị .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 V DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU Bảng 2.1 Danh sách thiết bị sử dụng 19 Bảng 2 Danh sách hóa chất sử dụng 19 Bảng Trình tự cặp mồi (Theo TCVN) 21 Bảng Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng Tỉ lệ tối ưu nồng độ moi xuôi mồi ngược cho PCR phát Perkinsus olseni 24 Bảng Các thành phần phản ứng PCR với nồng độ mồi 100 nM 25 Bảng Thành phần phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi bao gồm 25 Bảng Chương trình nhiệt tối ưu nhiệt độ gắn moi phản ứng PCR phát Perkinsus olseni 26 Bảng 2.10 Chuơng trình nhiệt tối ưu thời gian gắn mồi cho phản ứng PCR phát Perkinsus olsenỉ 26 Bảng 2.11 Bảng thích cho hình 3.3 31 Bảng 3.1 Ket đánh giá độ đặc hiệu phân tích qui trình PCR điện di phát ký sinh trùng Perkinsus olseni nhuyễn hai mảnh vỏ 34 Bảng Ket đánh giá độ nhạy phân tích qui trình PCR điện di phát ký sinh trùng Perkinsus olsenỉ nhuyễn the hai mảnh vô 36 Bảng 3 Ket đánh giá quy trình PCR Perkinsus oỉseni mẫu thực tế 37 VI DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 p olseni nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) ngao (Ruditapes sp.) (mũi tên) (nguồn: http://www.semapesca.cl- truy cập ngày 9/6/2022) Hình Hình minh họa phương pháp điện di gel ngang (Nguồn BioRender) 14 Hình 3.1 Ket kiếm tra độ hoạt động thực tế cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R 28 Hình Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R 29 Hình 3 Kết tối ưu nồng độ mồi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R.31 Hình 3.4 Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R 32 Hình 3.5 Ket tối ưu thời gian gắn mồi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R 33 Hình Ket điện di đánh giá độ đặc hiệu kỳ thuật qui trình PCR điện di phát Perkinsus olseni nhuyễn the hai mảnh vỏ 35 Hình Ket đánh giá giới hạn phát quy trình PCR điện di phát Perkinsus olseni nhuyễn the hai mảnh vỏ 36 Hình Hình điện di kết khảo sát mầu nghêu thực địa phương pháp PCR với cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R 38 vii KÝ HIỆU CÁC CỤM TÙ VIẾT TÁT AHPND Bệnh hoại tử gan tụy câp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) EHP Bệnh vi bào tử trùng (Microsporidian) ký sinh trùng Enterocytozoon hepatopenaei IHHNV Virus gây hoại tử quan tạo máu quan tạo lập biếu mô (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) M Mầu đối chứng NEC Chứng âm tách chiết (Negative Extraction Control) NTC Chứng âm (No Template Control) OIE Tố chức Thú y Thế giới (World Organisation of Animal Health) PCR Phản ứng chuồi polymerase (Polemerase Chain Reaction) TAE Đệm Tromethamine - Acetate - Axit etylendiamintetraaxetic TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam WSSV Bệnh đốm trắng virus (White Spot Syndrome Virus) VUI LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam có lợi với đường bờ biến dài 3260 km với mạng lưới sông ngịi dày đặc (2360 sơng dài 10 km) nên có tiềm lớn ni lồi nhuyễn thể hai mảnh vỏ Diện tích ni nhuyễn the nước ta khoảng 52930 ha, ni sò, ngao, hàu, trai coi thưong phàm Việt Nam bước mở rộng diện tích quy mơ Tuy nhiên với phát triển nghề nuôi, dịch bệnh đối tượng xuất bùng phát mạnh Hiện tượng vật ni giảm sinh sản, chậm phát triền chí noi lên cát, mở vỏ chết hàng loạt nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni mối lo ngại đáng quan tâm, gây ảnh hưởng lón đến hoạt động trì nghề sinh kế cộng đong ngư dân địa phương Perkinsus loài ký sinh trùng chủ yếu lây nhiễm cho loài nhuyễn the, số có Perkinsus olseni tác nhân gây thiệt hại diện rộng cho loài nhuyễn thể hoang dã, nhuyễn thể nuôi tồn giới nói chung Việt Nam nói riêng, p olseni To chức Thú y Thế giới (OIE) liệt vào danh sách đối tượng gây bệnh cần ý chúng nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong hàng loạt quần the vật chủ hệ thống quản lý chưa phù hợp, chưa có biện pháp phòng tránh bệnh dẫn đến việc người dân không đủ sản lượng tiêu thụ gây thất thu nghiêm trọng Vậy, vấn đề đặt phải tìm giải pháp để phát sớm nguồn bệnh từ có biện pháp phịng ngừa lây lan Ngày nay, với vai trị phát triển ngành cơng nghệ sinh học, đặc biệt tân tiến kỳ thuật sinh học phân tử, nối bật kỳ thuật PCR góp phần nhận diện nhanh chóng trước tác nhân gây bệnh cách xác với chi phí hợp lý, phịng ngừa dịch lây lan kiểm soát chất lượng tốt Nghiên cứu phát bệnh nhuyễn thể cần quan tâm phát triển sâu Với ý nghĩa đó, đề tài “Xây dựng quy trình phát ký sinh trùng Perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp PCR” thực nhằm hướng đến mục tiêu: Xây dựng thành cơng quy trình phát ký sinh trùng Perkinsus olsetũ nhuyễn thể sò, ngao, hàu, trai phương pháp PCR Quy trình cung cấp cơng cụ phát nhanh, xác bệnh p 2.4.4 Xác định thông số kỹ thuật qui trình PCR điện di phát Perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ giống Hàu (Crassostrea), Ngao (Meretrix) Độ đặc hiệu kỳ thuật khả phát phân biệt dịch mầu cần phân tích mục tiêu với dịch mầu không mục tiêu, bao gồm thành phần có chất Thực phản ứng PCR tối ưu mầu DNA gen loại vi khuẩn thường gặp môi trường nuôi thủy sản để kiểm tra khả bắt cặp đặc hiệu với Perkinsus olseni khả khơng bắt cặp trình tự khơng Perkinsus olseni Độ nhạy kỳ thuật đánh giá qua so LOD (limit of detection), giới hạn lượng dịch mầu phân tích có chất đặc trưng cho kết dương tính tối thiểu 95% lần lặp lại Sử dụng mức nồng độ amplicon, nồng độ thấp phải âm tính hồn tồn, nồng độ cao phải dương tính hồn tồn Tống hợp kết sử dụng phép thống kê Kaber-Spearman đe tính LOD50 theo công thức FDA (FDA-Food and Drug Administration) công bố Thực lặp lại lần lặp lại cho mồi nong độ 2.4.5 Bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát Perkinsus olseni mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ (nghêu) bệnh Các mẫu nghêu tươi thực địa thu thập từ khu chợ, vựa hải sản, siêu thị Thành Phố Hồ Chí Minh cố định cồn 95 °C trước tiến hành thực nghiệm sau 27 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ket kiểm tra độ hoạt động thực tế cũa mồi Mục đích thí nghiệm kiểm tra khả bắt cặp khuếch đại cặp moi với trình tự DNA ký sinh sùng Perkỉnsus olseni Phản ứng tiến hành sau: Sử dụng DNA mẫu chứng dương với o7 copies tổng hợp Integrated DNA Technologies (IDT) DNA mầu chứng dương ly trích từ mầu bệnh nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni cung cấp từ công ty TNHH Đảm bảo Chất lượng Việt Nam (AOV) Pol Po2 Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,5% Ket sản phẩm PCR đối chứng với thang DNA chuẩn kích thước 0,1-10 kbp Ket hình 3.1 cho thấy band cùa sản PCR từ chứng dương Perkinsus olseni lên sáng, rõ, có kích thước 450 bp phù hợp với kích thước trình tự gen mục tiêu Từ cho kết luận cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R hoạt động thực tế M L 450 bp 450 bp Hình Kết kiểm tra độ hoạt động thực tế cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R Giếng l:đẩi chứng âm (-); Giếng 2, 3, 4: DNA từ mẫu chứng dương IO7 copies; Giếng 5,6: chứng dương Perkinsus olesin Pol, Po2; M: thang DNA 3.2 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi Mục đích thí nghiệm để kiểm tra khả bắt cặp khuếch đại cặp mồi với chủng Perkinsus olseni Sau có cặp mồi PolsITS-140F/PolsITS-600R 28 theo công bố TCVN , thực PCR đế kiếm tra độ đặc hiệu mồi dựa thành phần phản ứng với mẫu đối chứng duơng (Plasmid DNA chứa trình tự mục tiêu đuợc chèn vào) cùa Perkinsus olsenỉ, Perkinsus marinus mầu chứng dương tác nhân gây bệnh có môi trường nuôi trồng thủy sản virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (IHHNV) Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,5% Kết sản phẩm PCR đối chứng với thang DNA chuẩn kích thước 0,1-10 kbp 450 bp J Hình Kết kiếm tra độ đặc hiệu cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R M: Thang DNA; Giếng 1: đối chứng âm (-); Giếng 2: Chứng dương IHHNV; Giếng 3: Chứng dương WSSV; Giếng 4: Chứng dương Perkinsus marinus; Giếng 5: Chứng dương Perkinsus olesin Kết sản phẩm điện di cặp mồi với đối chứng dương chứng dương IHHNV, WSSV, Perkinsus tnarinus không cho lên kết sản phẩm khuếch đại Chỉ xuất sản phấm khuếch đại (450 bp) phản ứng với mẫu chứng dương Perkỉnsus olseni có kích thước với kích thước trình tự mục tiêu (450 bp) có nghĩa cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R bắt cặp với DNA Perkinsus olseni Điều chứng tỏ cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R đặc hiệu, thích hợp cho việc thực tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR 29 Sau đà xác định độ hoạt động thực tế độ đặc hiệu mồi, tiếp tục dùng đối chứng dưcmg Perkỉnsus olsenỉ để tối ưu hóa nong độ moi, nhiệt độ thời gian gắn moi, từ tối ưu phản ứng PCR 3.3 Ket ciia tối ưu hóa phản ứng PCR Mục đích thí nghiệm tối ưu nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi đế từ tối ưu hóa phản ứng PCR đưa quy trình phát PerkinSUS olseni nhuyễn the 3.3.1 Ket tối ưu nồng độ mồi Nồng độ mồi yếu tố định đến thành công phản ứng PCR Nồng độ mồi cao thường dễ gây gắn mồi sai dần tới khuếch đại không đặc hiệu Mặc khác, nồng độ mồi thấp dần đến khếch đại khơng khuếch đại trình tự mong muốn Nồng độ moi tối ưu cho mồi phản ứng dao động khoảng 100 - 500 nM Nhằm tối ưu hóa phản ứng, khảo sát nồng độ moi từ 100 nM- 500 nM với độ tăng 100 nM nồng độ DNA plasmid dương tính Perkinsus olesin Tiến hành thí nghiệm tối ưu nồng độ mồi để xác định nồng độ mồi tối thiểu thích hợp hiệu suất phản ứng khuếch đại đạt hiệu Thực pha nong độ moi với thành phần phản ứng bản, sừ dụng chứng dương 107 copies Sản pham PCR kiểm tra gel agarose 1,5% Ket sản phẩm PCR đoi chứng với thang DNA chuẩn kích thước 0,1-10 kbp Kết sản phẩm PCR (hình 3.3) tỷ lệ nồng độ mồi cho thấy tỉ lệ nồng độ cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R ảnh hưởng đến khả phát độ nhạy phản ứng PCR Tóm lại, kết khảo sát nồng độ mồi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R, lựa chọn mồi nồng độ 400nM/300 nM tối ưu, phù hợp với mục đích thí nghiệm 30 A 100 nM B 200 nM c 300 nM D 400 nM E 500 nM Hình 3 Ket tối ưu nồng độ mồi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R Bảng 2.11 Bảng thích cho hình 3.3 Mồi xuôi Mồi ngược (nM) (nM) 100 200 300 400 500 100 Giểng A2, A3 A5, A6 A8, A9 All, A12 A14, A15 200 B2, B3 B5, B6 B8, B9 Bl 1, B12 B14, B15 300 C2,C3 C5,C6 C8, C9 C11,C12 C14, C15 31 400 D2, D3 D5,D6 D8, D9 D11,D12 D14, D15 500 E2, E3 E5,E6 E8, E9 E11,E12 E14, E15 Giếng Al, A4, A7, AỈO, BI, B4, B7, B10, Cl, C4, C7, CIO, Dl, D4, D7, DIO, El, E4, E7, E1O: mẫu âm 3.3.2 Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi Sau tối ưu hóa nong độ mồi thích họp, tiếp tục thực cải thiện nhiệt độ gắn mồi kết tối ưu hóa phản ứng PCR tốt Nhiệt độ gắn mồi có vai trị quan trọng phản ứng PCR Neu nhiệt độ gắn mồi đặt cao, đoạn mồi có the khơng bắt cặp với DNA mục tiêu, sè khơng khuếch đại, sè có sản phẩm tổng họp, nguyên nhân bắt cặp đoạn moi bị giảm đồng thời xuất sản phấm không đặc hiệu khuếch đại bất đối xứng đoạn sản phẩm Mặt khác, nhiệt độ gắn moi đặt thấp, đoạn moi PCR liên kết với trình tự khơng mong muốn Lấy chứng dương cùa Perkinsus olseni sử dụng để tối ưu nồng độ mồi thực cho công việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi Nồng độ mồi sử dụng phản ứng nong độ tối ưu hóa Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào độ lớn nhiệt độ nóng chảy moi Nhiệt độ khảo sát xác định cách lấy nhiệt độ trung bình moi có nhiệt độ nóng chảy thấp mồi có nhiệt độ nóng chảy cao ±5 (Ta= (Tmi+ Tni2)/2 ±5) Khoảng nhiệt độ khảo sát từ 56 °C đến 66 °C Chọn nhiệt độ gắn moi cặp mồi PolslTS-140F/ PolsITS-600R thực với nhiệt độ mức cách 2,5 56 °C, 58,5 °C, 61 °C, 63,5 °C, 66 °C Hình Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R 32 Giếng I, Giếng 4, Giếng 7, Giếng 10: đối chứng âm (-); Giếng 2,3: nhiệt độ 56°C; Giếng 5,6: nhiệt độ 58,5 °C: Giếng 8,9: nhiệt độ 6i°C; Giếng 11,12: nhiệt độ 63,5"C; Giếng 14,15: nhiệt độ 66°C: M: thang DNA Ket điện di từ Hình 3.4 cho thấy cặp mồi có the hoạt động rộng khoảng nhiệt độ khảo sát Tuy nhiên nhiệt độ gắn moi 63,5°c có tín hiệu tốt so với nhiệt độ khảo sát lại Chính nhiệt độ 63,5°c chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR 3.3.3 Ket tối ưu thời gian gắn mồi Sau tối ưu nồng độ gắn mồi nhiệt độ gắn mồi, tiếp thục thực tối ưu thời gian gắn mồi cho cặp mồi Tiếp tục lấy chứng dương Perkỉnsus olsenỉ thực công việc tối ưu thời gian gắn moi Và sử dụng nồng độ nhiệt độ mồi tối ưu Khảo sát thời gian gắn moi dựa vào kích thước cặp mồi, cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R có kích thước 450bp Nên chu trình nhiệt tối ưu hóa thời gian gắn mồi thực với mức thời gian 15 giây, 30 giây, 45 giây 60 giây Hình Kết tối ưu thời gian gẳn mồi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R Giếng 1, Giếng 4, Giếng 7, Giếng 10: đối chứng ảm (-); Giếng 2,3: thời gian gắn mồi 15s; Giếng 5,6: thời gian gan moi 30s; Giếng 8,9: thời gian gan moi 45s; Giếng 11,12:thời gian gan mồi 60s; M: thang DNA Ket hình 3.5 cho thấy, tất thời gian gắn mồi khảo sát cho sản phẩm khuếch đại rõ, sáng vi thời gian gắn moi khảo sát không gây thay đoi cho sản phẩm PCR Do đó, thời gian gắn mồi 15 giây chọn làm thời gian gắn moi thích họp cho phản ứng PCR 33 3.4 Xác định thơng số kỹ thuật qui trình PCR điện di phát Perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ giống Hàu (Crassostrea), Ngao (Meretrix) 3.4.1 Kết độ đặc hiệu kỹ thuật Mục đích thí nghiệm đề kiểm tra yếu tố nồng độ mồi, nhiệt độ thời gian gắn mồi moi tối ưu không ảnh hưởng tới độ đặc hiệu mồi Từ kiểm tra khả phát Perkinsus oỉseni gây bệnh nhuyễn thể, cho kết kiếm tra bệnh mục tiêu Sau tối ưu nồng độ mồi, nhiệt độ thòi gian gắn mồi mồi PolsITS-140F/PolsITS-600R Sử dụng nồng độ mồi 400nM/300nM, nhiệt độ gắn moi 63,5 °C, thời gian gắn mồi 15 giây thành phần phản ứng thực phản ứng PCR Tiến hành PCR với DNA mẫu đối chứng dương cùa Perkỉnsus tnarinus, Escherichia coỉi, wssv, IHHNV, Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, AHPND, EHP cung cấp từ Trung tâm Nghiên cứu Phát triền Nông nghiệp Công nghệ cao chứng dương Perkinsus olseni Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,5% Kết sản phẩm PCR đối chứng với thang DNA chuẩn kích thước 0,1-10 kbp (Hình 3.6) Bảng 3.1 Ket đánh giá độ đặc hiệu phân tích qui trình PCR điện di phát ký sinh trùng Perkinsus olsenỉ nhuyễn the hai mảnh vô Kết Giếng Mẩu Vạch 450 bp Ket luận Perkỉnsus marinus - Ảm tính với Perkinsus olseni Escherichia coỉi - Âm tính với Perkinsus olseni WSSV Âm tính với Perkinsus olseni IHHNV - Vibrio cholera - Âm tính với Perkinsus olseni Vibrio parahaemolyticus - Âm tính với Perkỉnsus olseni AHPND Âm tính với Perkinsus oỉseni EHP Perkỉnsus olseni + 34 Âm tính với Perkỉnsus oỉseni Âm tính với Perkinsus olseni Dương tính Perkinsus olseni MI 23456789 450 bp Hình Ket điện di đánh giá độ đặc hiệu kỳ thuật qui trình PCR điện di phát Perkinsus olseni nhuyễn the hai mảnh vỏ M: thang DNA; gieng 1: chứng đương Perkinsus marinus; giếng 2: chứng đương Escherichia coli; giếng 3: chứng dương WSSV; giếng 4: chứng dương IHHNV; giếng 5: chứng dương Vibrio cholera; giếng 6: chứng dương Vibrio parahaemolyticus; giềng 7: chứng dương AHPND; giếng 8: chứng dương EHP; giếng 9: chứng dương Perkinsus olseni 3.4.2 Ket độ nhạy kỹ thuật Mục đích thí nghiệm đe xác định giới hạn lượng dịch mầu phân tích có chất đặc trưng có the cho kết dương tính, có nghía ngưỡng nong độ ký sinh trùng Perkinsus olsenỉ thấp mẫu nhuyễn the kiểm tra quy trình, từ xác định nhuyễn thể mắc bệnh Perkỉnsus olseni gây Độ nhạy kỳ thuật gọi tên khác giới hạn phát LOD (Limit of detection) Đe thực việc khảo sát độ nhạy kỳ thuật hay LOD quy trình PCR Perkinsus olseni, DNA plasmid trình tự mục tiêu Perkinsus olseni sau tiếp tục pha lỗng theo cấp số 10 thành 106, 105, 104, 103, 102, 101, 10° copy/pl Tiến hành kiểm tra PCR cho nồng độ mầu chuẩn, mồi nồng độ lặp lại lần Sản phẩm PCR kiếm tra gel agarose 1,5% Ket sản phẩm PCR đoi chứng với thang DNA chuẩn kích thước 0,1-10 kbp (Bảng 3.2, Hình 3.7) 35 Bảng Kết đánh giá độ nhạy phân tích cùa qui trình PCR điện di phát ký sinh trùng Perkinsus olseni nhuyễn the hai mảnh vỏ Kêt (Vạch) Nồng độ mẫu chuẩn Kết (copies/phản ứng) Lần Lần Lần Lần Lần luận • (-) (-) (-) (-) (-) KPH 50 (+) (+) (+) (+) (+) PH 500 (+) (+) (+) (+) (+) PH 5000 (+) (+) (+) (+) (+) PH 50000 (+) (+) (+) (+) (+) PH 500000 (+) (+) (+) (+) (+) PH 5000000 (+) (+) (+) (+) (+) PH 50000000 (+) (+) (+) (+) (+) PH Đôi chứng âm (-) (-) (-) (-) (-) (-) Chú thích: KPH: Khơng phát hiện; PH: phát Hình Kết đánh giá giới hạn phát quy trình PCR điện di phát Perkinsus oỉseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ Giếng ỉ: đối chứng âm (-); Giếng 2,3: nồng độ DNA 5x10° copies/phán ứng; Giếng 4,5: nồng độ DNA 5x10' copies/phãn ứng; Giếng 6,7: nồng độ DNA 5x10? copies/phán ứng; Giếng 8,9: nồng độ DNA 5xl03 copies/phán ứng; Giếng 10,11: nồng độ DNA 5xl04copies/phàn ứng: Giếng 12,13: nồng độ DNA 5x1 o5 copies/phán ứng: Giếng 14,15: nồng độ DNA 5x10? copies/phàn ứng Qua kết Bảng 3.2 Hình 3.7 cho thấy chứng âm khơng cho tín hiệu chứng tỏ quy trình hoạt động tốt Các nồng độ từ 50 đến 50.000.000 copies cho cho sản phàm khuếch đại nồng độ copies/phản ứng khơng thấy tín hiệu Như vậy, quy 36 trình phát DNA KST Perkinsus olseni nồng độ 50 copies/phản ứng Độ nhạy kỳ thuật quy trình 50 copies/phản úng 3.5 Ket đánh giá quy trình PCR phát Perkìnsus olsenì mẫu thực tế Thí nghiệm tiến hành với 10 mầu nghêu khu chợ khác DNA tổng số mầu nghêu ly trích Gen All ©Tissue and Tissue Plus! SV Mini Protocol for Animal tissue Kit định lượng bang máy đo BioPhotometer Plus hãng Eppendorf Ket ly trích DNA cho thấy DNA thu từ mẫu chuẩn có độ tinh cao (tỉ lệ OD260:OD280 giao động từ 1,8 đến 2) hàm lượng DNA tương đối thấp khoảng < 250 ng/pl Ket phân tích 10 mầu nghêu thu thập phương pháp PCR cho thấy 10/10 mầu nghêu nhiễm Perkinsus olsetìỉ (100%) Ket chứng tỏ mồi đặc hiệu, độ nhạy cao quy trình phản ứng PCR thiết kế có chất lượng tốt (Bảng 3.3) (Hình 3.8) Bảng 3 Ket đánh giá quy trình PCR Perkinsus olseni mầu thực tế Nồng độ Phát STT Loại mẫu Noi thu mẫu Nghêu Chợ đầu mồi Bình Điền 76,53 1,75 + Nghêu Chợ Hàng Dương - cần Giờ 76,33 1,83 + Nghêu Vựa hài sàn Minh Hải 27,83 1,84 - Nghêu 50,70 1,81 + Nghêu Hài sán Long Hải 52,20 1,83 - Nghêu Siêu thị 31,90 1,79 + Nghêu Chợ Tân Phú Trung 111,20 1,82 - Nghêu Chợ An Phú Đông 66,70 1,89 4- Nghêu Chợ Thũ Đức 38,60 1,82 - 10 Nghêu Siêu thị 137,00 1,89 + ng/pl Cữa hàng hải sán tươi - Dũng Phú Quốc 37 OD 260/280 10 (+) M Hình Hình điện di kết khảo sát mẫu nghêu thực địa phương pháp PCR với cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R 38 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ Ket luận Qua trình thực đề tài “Xây dựng quy trình phát ký sinh trùng Perkinsus olseni nhuyễn hai mảnh vỏ phương pháp PCR”, cung cấp cách chi tiết tối ưu hóa thơng số kỹ thuật qui trình PCR điện di phát Perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ, cụ thể là: - Ket khảo sát nồng độ moi cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R, lựa chọn mồi nồng độ 400nM/300 nM, nhiệt độ gắn moi 63,5 °C thời gian gắn moi 15 giây tối ưu, phù hợp với mục đích thí nghiệm - Cặp mồi PolsITS-140F/ PolsITS-600R bắt cặp với DNA cùa Perkinsus olseni Ket luận thông số kỳ thuật đặc hiệu - Độ nhạy phân tích qui trình PCR điện di phát ký sinh trùng Perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ mức nồng độ 5x10’ copies/phản ứng - Ket phân tích 10 mầu nghêu thu thập phương pháp PCR cho thấy 10/10 mẫu nghêu nhiễm Perkinsus olseni (100%) Ket chứng tỏ mồi đặc hiệu, độ nhạy cao quy trình phản ứng PCR thiết ke có chất lượng tốt Đề nghị - Thực mở rộng quy trình đe sàn lọc từ mẫu nhuyễn the vùng sinh thái khác để nhận biết sớm nguồn bệnh từ có biện pháp phịng ngừa dịch lây lan - Kết xác định mầu cần gởi kiểm chứng độ xác quy trình đe xác định tỷ lệ dương tính giả âm tính giả - So sánh quy trình chẩn đốn bệnh nhuyễn thể kỳ thuật PCR với nghiên cứu kỳ thuật khác từ cần có thêm nghiên cứu Perkinsus olsenỉ để hoàn thiện tối đa quy trình để ứng dụng vào phân tích bệnh 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thanh Hà, Ngô Thị Ngọc Thủy, Từ Thanh Dung (2018), Nghiên cứu số mầm bệnh nghêu (Meretrix lyrata Sowerby, 1851) tỉnh Ben Tre: 76-82 Nguyễn Văn Hảo, Ngô Thị Ngọc Thủy, Tiêu Thanh Tươi, Hoàng Thị Hiền, Phạm Lâm Chính Văn, Nguyền Vy Vân (2010), Sự diện cùa perkinsus sp Trên nghêu (meretrix lyrata) vùng biển cần Giờ-Thành Phố Hồ Chỉ Minh Phạm Quốc Hùng Nguyễn Thị Hồng Nhung (2017), Thử nghiệm cảm nhiễm bào từ Perkinsus oỉseni vào nghêu bến tre (Meretrỉx lyrata) Phương Pháp Ngâm, Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Nguyễn Thị Là, Phan Trọng Bình, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Đại Thị Dung, Trần Tống Huy, Phạm Thái Giang (2021), Xác định nguyên nhản tương Ngao chết hàng loạt tỉnh phía Bắc giai đoạn 2016-2019 Lê Đình Lương (2004), Kỹ Thuật Di Truyền Và ửngDụng (ĐHKHTN), NXB ĐHQG Hà Nội Ngô Thị Thu Thảo (2008), Một số đặc điếm cùa ký sinh trùng Perkinsus sp lây nhiêm nghêu lụa Paphia undulata Kiên Giang Bà Rịa- Vũng Tàu, Tạp chí Khoa học Trường Đại học cần Thơ, 1: 222-230 Tiếng Anh Pablo Balseiro, Jaime Montes, Ramón Fernandez Conchas, Beatriz Novoa, Antonio Figueras (2010), Comparison of diagnostic techniques to detect the clam pathogen Perkinsus olseni, Diseases of aquatic organisms, 90(2): 143- 151 Susan M Bower, Sharon E McGladdery, Pricelola M Price (1994), Synopsis of infectious diseases and parasites of commercially exploited shellfish, Annual Review of Fish Diseases, 4: 1-199 40 Dieffenbach CW, Lowe TM, Dveksler GS (1993), General concepts for PCR primer design 10 Caetano-Anollés D (2013), Polymerase Chain Reaction, 392-395 11 Maddox J (1990), Understanding gel electrophoresis, Nature, 345(6274): 381 12 Rahman Md Tahminur, Uddin Muhammed Salah, Sultana Razia, Moue Arumina, Setu Muntahina (2013), Polymerase Chain Reaction (PCR): A Short Review, Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1): 30-36 13 Kyung-Il Park, Thao T T Ngo, Sang-Duk Choi, Moonjae Cho, Kwang-Sik Choi (2006), Occurrence of Perkinsus olseni in the Venus clam Protothaca jedoensis in Korean waters, Journal of Invertebrate Pathology, 93(2): 81-87 14 Lester R J G Davis G H G (1981), A new Perkinsus species (Apicomplexa, Perkinsea) from the abalone Haliotis ruber, Journal of Invertebrate Pathology, 37(2): 181-187 15 Jun Shimokawa, Tomoyoshi Yoshinaga, Kazuo Ogawa (2010), Experimental evaluation of the pathogenicity of Perkinsus olseni in juvenile Manila clams Ruditapes philippinarum, Journal of Invertebrate Pathology, 105(3): 347-351 16 Pretto T, Zambon M, Civettini M, Caburlotto G, Boffo L, Rossetti E, Arcangeli G (2014), Massive mortality in Manila clams (Ruditapes philippinarum) farmed in the Lagoon of Venice, caused by Perkinsus olseni, 34: 43-53 17 Tsukasa Waki, Miki Takahashi, Tatsuya Eki, Masato Hiasa, Kousuke Umeda, Nanae Karakawa, Tomoyoshi Yoshinaga (2018), Impact of Perkinsus olseni infection on a wild population of Manila clam Ruditapes philippinarum in Ariake Bay, Japan, Journal of Invertebrate Pathology, 153: 134-144 18 Chad M Warren, Paul R Krzesinski, Marion L Greaser (2003), Vertical agarose gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight proteins, Electrophoresis, 24(11): 1695-702 41