Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây hươngthảo (rosmarinus officinalis l ) bằng phương pháp HPLC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Tạ Thị Thảo TS Lê Thị Huyền Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, cảm phục kính trọng tới PGS TS Tạ Thị Thảo TS Lê Thị Huyền - người Thầy tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn tất thầy cô môn hố phân tích cán phịng đào tạo sau đại học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị phịng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển quan tâm giúp đỡ, với lời khuyên bổ ích góp ý quý báu việc thực hồn thiện luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới tồn thể gia đình, bạn bè người thân ln ln quan tâm, khích lệ, động viên tơi suốt trình học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2020 Học viên Lê Thị Oanh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC i MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu họ Hoa môi (Lamiaceae) 1.2 Chi Rosmarinus 1.3 Loài Hương thảo (R officinalis L.) 1.3.1 Đặc điểm thực vật 1.3.2 Nguồn gốc phân bố 1.3.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học 1.3.4 Cơng dụng hoạt tính sinh học lồi R officinalis 1.4 Tổng quan phương pháp phân tích thành phần hóa học lồi R officinalis11 1.4.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học dược liệu 11 1.4.2 Các nghiên cứu xác định thành phần hóa học loài R officinalis ………………………………………………………………………….12 1.4.3 Các phương pháp chiết tách chất phân tích khỏi mẫu dược liệu 14 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 16 2.2.1 Chất chuẩn 16 2.2.2 Các hoá chất khác 17 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp phân tách dịch chiết phân lập hợp chất 18 2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc chất 21 2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký 21 2.3.4 Phương pháp xử lý mẫu 22 2.4 Đánh giá phương pháp phân tích 25 2.4.1 Tính thích hợp hệ thống sắc ký 25 i 2.4.2 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 25 2.4.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 26 2.4.4 Độ lặp lại phương pháp 26 2.4.5 Độ (đánh giá qua độ thu hồi) 27 2.5 Phân tích mẫu thực tế 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập 29 3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện đo hệ thống sắc ký 33 3.2.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện tách hệ sắc ký HPLC 33 3.2.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn 37 3.3 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu R officinalis 42 3.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 42 3.3.2 Khảo sát phương pháp chiết 43 3.4 Đánh giá phương pháp phân tích 46 3.4.1 Đánh giá tính phù hợp hệ thống sắc ký 46 3.4.2 Độ đặc hiệu 47 3.4.3 Độ lặp lại phương pháp 48 3.4.4 Độ phương pháp 49 3.5 Định lượng bốn hoạt chất mẫu thực 51 KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng t hạt nhân carbon 13 H-NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng t hạt nhân proton ACN Acetonitrile Acetonitrile CDL Limit of detection of calibration Giới hạn phát đường chuẩn CDQ Limit of quantitation of calibration Giới hạn định lượng đường chuẩn DAD Diod Array Detector Detector mảng diod EtOH Ethanol Ethanol EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetate HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao MeOH Methanol Methanol R2 RO1 Correlation coefficient Hệ số tương quan 7α-methoxyrosmanol 7α-methoxyrosmanol RO2 Carnosol Carnosol RO3 Demethylsalvicanol Demethylsalvicanol RO4 Rosmarinoside A Rosmarinoside A RO5 Sageone Sageone RO6 20-deoxocarnosol 20-deoxocarnosol RO7 11,12,20-trihydroxy-abieta8,11,13-triene 11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13triene RO8 Rosmanol Rosmanol RO9 -methoxyrosmanol -methoxyrosmanol RO10 7α-ethoxyrosmanol 7α-ethoxyrosmanol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SKĐ v/v Sắc ký đồ Volume/volume Thể tích/thể tích DANH MỤC BẢNG Trang Bảng Các mẫu R officinalis dùng nghiên cứu 16 Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất RO1 hợp chất tham khảo 30 Bảng Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t loài R officinalis .31 Bảng 3 Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t loài R officinalis .32 Bảng Hệ gradient với pha động MeOH/H2O ACN/ H2O .35 Bảng Thông số đánh giá pic chất định phân điều kiện rửa giải 35 Bảng Ảnh hưởng thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic chất 36 Bảng Hệ gradient chạy HPLC 37 Bảng Khoảng tuyến tính RO1, RO3, RO9, RO10 38 Bảng Giá trị hệ số b’ 40 Bảng 10 Các đại lượng thống kê 40 Bảng 11 Phương trình đường chuẩn chất 41 Bảng 12 CDL CDQ RO1, RO3, RO9 RO10 HPLC-DAD .41 Bảng 13 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống 46 Bảng 14 Thời gian lưu mẫu đối chiếu mẫu thử 48 Bảng 15 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp mẫu RO1 49 Bảng 16 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp mẫu thực 49 Bảng 17 Kết khảo sát độ phương pháp 50 Bảng 18 Kết định lượng bốn hoạt chất số mẫu thân R officinalis52 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1 Cây Bạc hà (Mentha arvensis) Hình Cây Hồng cầm (Scutellaria baicalensis) Hình Lồi Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) .3 Hình Cấu trúc số terpene phân lập t loài R officinalis Hình Cấu trúc số flavonoid phân lập t loài R officinalis Hình Cấu trúc số phenolic phân lập t loài R officinalis Hình Sơ đồ phân lập hợp chất t loài R officinalis 20 Hình Cơng thức cấu tạo chất RO1 29 Hình Khảo sát bước sóng phát tối ưu chất .33 Hình 3 Sắc ký đồ ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn 37 Hình Đường chuẩn chất RO1, RO3 .38 Hình Đường chuẩn chất RO9, RO10 39 Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng RO1, RO3, RO9 RO10 42 Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 43 Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 44 Hình Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/khối lượng dược liệu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 45 Hình 10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10 46 Hình 11 SKĐ chất đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10 .47 Hình 12 SKĐ mẫu thử 48 MỞ ĐẦU Việt Nam nước nằm vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn dược liệu phong phú đa dạng Nhân dân ta t lâu biết dùng cỏ để chữa bệnh phòng bệnh, chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo t ng địa phương Phần lớn thuốc Việt Nam chưa nghiên cứu cách đầy đủ, thành phần hóa học, tác dụng sinh học hàm lượng hoạt chất chưa có sở khoa học để tạo sản phẩm ứng dụng lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm nơng nghiệp Trong số có Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) loại có nhiều ứng dụng sống Nhiều nghiên cứu giới có khả chống oxi hóa, kháng viêm chống ung thư, ức chế mạnh tăng trưởng tế bào tất dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ đường huyết, kích thích hệ thần kinh Với mong muốn tìm hiểu chất lượng Hương thảo, lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hoạt chất Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L.) phƣơng pháp HPLC‖ Mục tiêu nghiên cứu: - Phân lập số hoạt chất Hương thảo dùng làm chất đối chiếu việc định tính, định lượng hoạt chất - Xây dựng quy trình định lượng hoạt chất Hương thảo phương pháp HPLC - Ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng hoạt chất số mẫu Hương thảo vùng khác Phụ lục Phổ hợp chất RO3 Phụ lục Phổ 1H-NMR RO3 Phụ lục 2 Phổ 13C-NMR RO3 Phụ lục Phổ hợp chất RO9 Phụ lục Phổ 1H-NMR RO9 Phụ lục Phổ 13C-NMR RO9 Phụ lục Phổ hợp chất RO10 Phụ lục Phổ 1H-NMR RO10 Phụ lục Phổ 13C-NMR RO10 Phụ lục Sắc ký đồ bốn chất RO1, RO3, RO9 RO10 PL5 Sắc ký đồ chẩt đối chiếu RO1 PL5 Sắc ký đồ chẩt đối chiếu RO3 PL5 Sắc ký đồ chẩt đối chiếu RO9 PL5 Sắc ký đồ chẩt đối chiếu RO10 PL5 Sắc ký đồ hỗn hợp bốn chất đối chiếu RO1, RO3, RO9 RO10 PL5 Sắc ký đồ mẫu thực Phụ lục Kết khảo sát Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết Hàm lượng (%) EtOH 100% MeOH 100% EtOH 90% MeOH 90% EtOH 70% MeOH 70% EtOH 50% MeOH 50% EtOH 20% MeOH 20% RO1 0,39 0,41 0,92 0,95 1,12 1,18 0,74 0,86 0,58 0,60 RO3 0,02 0,03 0,08 0,08 0,11 0,10 0,07 0,08 0,02 0,01 RO9 0,07 0,09 0,27 0,26 0,34 0,35 0,25 0,23 0,17 0,16 RO10 0,11 0,10 0,33 0,35 0,53 0,47 0,24 0,25 0,13 0,12 Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết siêu âm Hàm lượng (%) Nhiệt độ phòng (250C) 300C 400C 500C RO1 0,90 0,92 0,91 0,90 RO3 0,03 0,04 0,04 0,05 RO9 0,11 0,10 0,11 0,12 RO10 0,23 0,21 0,22 0,22 Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm Hàm lượng (%) 15 phút 30 phút 1h 2h 3h 5h RO1 0,82 0,96 1,10 1,13 1,25 1,33 RO3 0,01 0,04 0,08 0,10 0,11 0,12 RO9 0,09 0,14 0,14 0,14 0,15 0,15 RO10 0,15 0,30 0,33 0,34 0,37 0,41 Bảng 4 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dung mơi chiết / khối lượng dược liệu Hàm lượng (%) Tỷ lệ 30/1 Tỷ lệ 50/1 Tỷ lệ 70/1 Tỷ lệ 90/1 RO1 0,43 1,23 1,24 1,25 RO3 0,01 0,03 0,10 0,11 RO9 0,12 0,28 0,29 0,29 RO10 0,08 0,31 0,40 0,41 Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết hồi lưu Hàm lượng (%) 1h 2h 3h 4h 5h RO1 0,20 0,41 1,13 1,14 1,14 RO3 0,03 0,05 0,10 0,10 0,11 RO9 0,05 0,13 0,33 0,35 0,35 RO10 0,16 0,29 0,50 0,52 0,53 ... NHIÊN L? ? THỊ OANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L. ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN... hiểu chất l? ?ợng Hương thảo, l? ??a chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hoạt chất Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L. ) phƣơng pháp HPLC? ?? Mục tiêu nghiên cứu: - Phân l? ??p số hoạt chất. .. tìm hiểu loài R officinalis thị trường Việt Nam tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hoạt chất Hương thảo (Rosmarinus officinalis L. ) phương pháp HPLC? ?? Trong nghiên cứu này,