Đang tải... (xem toàn văn)
Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược: Xây dựng quy trình định lượng berberin trong dược liệu Vàng đắng (Coscinium fenestratum...
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN NGUYỄN NGỌC KHÁNH VY XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG BERBERIN TRONG DƢỢC LIỆU VÀNG ĐẮNG (Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC DƢỢC Hậu Giang – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN NGUYỄN NGỌC KHÁNH VY XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG BERBERIN TRONG DƢỢC LIỆU VÀNG ĐẮNG (Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Dƣợc liệu KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC DƢỢC Giảng viên hƣớng dẫn: ThS DS HUỲNH LỜI TS DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Hậu Giang – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất nội dung báo cáo tổng kết đề tài thân tơi thực Tồn số liệu kết báo cáo hoàn tồn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Ngƣời cam đoan Nguyễn Ngọc Khánh Vy i LỜI CẢM ƠN Lời vô biết ơn ba mẹ gia đình ln bên cạnh, quan tâm động viên con, tới chặng đƣờng Em xin cảm ơn Ban Đào tạo khoa Dƣợc trƣờng Đại học Võ Trƣờng Toản tạo điều kiện cho em có hội thực đề tài cách thuận lợi Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Huỳnh Lời, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn em thực đề tài, quan tâm, giúp đỡ đồng hành em suốt thời gian thực Em xin cảm ơn quan tâm, hỗ trợ góp ý tận tình TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy, cảm ơn cô bên cạnh nhắc nhở, động viên em giúp em hồn thành đề tài Cuối nhƣng khơng phải xin gửi lời cảm ơn đến anh Tuyền (Đại học Nguyễn Tất Thành), chị Pha, chị Dung bạn Mỹ Anh, Trâm, Trân, Dũng, Tâm, Toàn, Tuấn, em Ngọc, Ái ln đồng hành suốt thời gian thực khóa luận Hậu Giang, ngày 05 tháng 03 năm 2016 Sinh viên thực Nguyễn Ngọc Khánh Vy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii PHẦN MỞ ĐẦU CHƢƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 TỔNG QUAN VỀ C Y VÀNG ĐẮNG 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Thực vật học 2.1.3 Thành phần hóa học lồi Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr 11 2.1.4 Tác dụng dƣợc lý 12 2.1.5 Tính vị – cơng .16 2.1.6 Công dụng – cách dùng 16 2.1.7 Một số chế phẩm có berberin 17 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PH N TÍCH BERBERIN .18 2.2.1 Phƣơng pháp phân tích sắc ký lớp mỏng .18 2.2.2 Phƣơng pháp quang phổ tử ngoại – khả kiến 19 2.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 20 PHẦN NỘI DUNG 22 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .23 3.2 TRANG THIẾT BỊ – DUNG MƠI – HĨA CHẤT .23 3.2.1 Dung mơi, hóa chất 23 3.2.2 Trang thiết bị 23 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.3.1 Mô tả đặc điểm cảm quan soi bột dƣới kính hiển vi bột thân rễ Vàng đắng 24 iii 3.3.2 Xác định hàm lƣợng chất chiết đƣợc 24 3.3.3 Định tính 24 3.3.4 Khảo sát điều kiện định lƣợng berberin Vàng đắng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .25 3.3.5 Thẩm định quy trình định lƣợng berberin phƣơng pháp HPLC 26 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 4.1 KHẢO SÁT DƢỢC LIỆU VÀNG ĐẮNG 29 4.1.1 Cảm quan 29 4.1.2 Soi bột .29 4.1.3 Độ ẩm 30 4.1.4 Xác định hàm lƣợng chất chiết đƣợc 30 4.1.5 Định tính 30 4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PH N TÍCH BERBERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC .31 4.2.1 Quy trình xử lý mẫu 31 4.2.2 Khảo sát thành phần pha động 31 4.3 X Y DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG BERBERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC 32 4.3.1 Khảo sát tính phù hợp hệ thống 33 4.3.2 Kết thẩm định quy trình 34 PHẦN KẾT LUẬN 44 CHƢƠNG BÀN LUẬN – KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .45 5.1 BÀN LUẬN 45 5.2 KẾT LUẬN 46 5.3 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Một số thuộc họ Tiết dê Menispermaceae .6 Hình 2.2 Cây Vàng đắng thân Vàng đắng .7 Hình 2.3 Cấu trúc số alkaloid thân rễ Vàng đắng 11 Hình 2.4 Một số hợp chất khác Vàng đắng .12 Hình 2.5 Một số chế phẩm có berberin .17 Hình 3.1 Thân rễ Vàng đắng .25 Hình 3.2 Bột thân rễ Vàng đắng .25 Hình 4.1 Hình ảnh dƣợc liệu bột dƣợc liệu Vàng đắng 29 Hình 4.2 Kết soi bột Vàng đắng 29 Hình 4.3 Bột dƣợc liệu Vàng đắng dƣới ánh sáng tử ngoại 365 nm 30 Hình 4.4 Kết SLKM berberin thân bột rễ Vàng đắng 30 Hình 4.5 SKĐ mẫu thử định lƣợng berberin .32 Hình 4.6 Sắc ký đồ mẫu trắng .34 Hình 4.7 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu berberin 35 Hình 4.8 Sắc ký đồ mẫu thử định lƣợng berberin 35 Hình 4.9 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn định lƣợng berberin 36 Hình 4.10 Phổ UV – Vis pic berberin SKĐ mẫu đối chiếu 36 Hình 4.11 Độ tinh khiết mẫu pic berberin SKĐ mẫu đối chiếu 36 Hình 4.12 Phổ UV – Vis pic berberin SKĐ mẫu thử 37 Hình 4.13 Độ tinh khiết pic berberin SKĐ mẫu thử 37 Hình 4.14 Phổ 3D mẫu đối chiếu 37 Hình 4.15 Phổ 3D mẫu thử 38 Hình 4.16 Đƣờng biểu diễn tƣơng quan nồng độ diện tích pic berberin 40 v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 4.1 Kết khảo sát hàm lƣợng chất chiết đƣợc thân rễ Vàng đắng 30 Bảng 4.2 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu thử Vàng đắng .33 Bảng 4.3 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu đối chiếu 34 Bảng 4.4 Kết khảo sát độ đặc hiệu quy trình định lƣợng berberin 38 Bảng 4.5 Tƣơng quan nồng độ diện tích pic berberin chuẩn 39 Bảng 4.6 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lƣợng berberin 41 Bảng 4.7 Kết khảo sát độ xác trung gian (liên ngày) 41 Bảng 4.8 Tỷ lệ phục hồi berberin Vàng đắng .42 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AF Hệ số bất đối ALP Alkaline phosphatase ALT Alanin Amino Transferase AST Aspartate Amino Transferase CNS Central nervous system (Hệ thống thần kinh trung ương) DĐVN Dƣợc điển Việt Nam EC50 Effective concentration 50% (Nồng độ tác dụng trung bình) G6PD Glucose-6-phosphat dehydrogenase GGT Gamma glutamyl transpeptidase HPLC ICH High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) International Conference Harmonization (Hội nghị Hài hòa Quốc tế) LD50 Lethal dose 50% (Liều lượng gây chết trung bình) LDH Lactate dehydrogenase MBC MIC Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) Minimum Inhibitory concentrations (Nồng độ ức chế tối thiểu) MTV Một thành viên PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) Ppm Parts per million (Phần triệu) vii rpm Revolutions per minute (Số vòng quay phút) Rs Hệ số phân giải RSD Realative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TBA – RS Thiobarbituric acid reactive subtance TC Tiêu chuẩn TEA Triethanolamin TFA Trifluoroacetic acid TNHH Trách nhiệm hữu hạn TR Thời gian lƣu (phút) UV – Vis Ultraviolet – Visible (Tử ngoại – khả kiến) viii Hình 4.15 Phổ 3D mẫu thử Nhận xét: SKĐ mẫu trắng không xuất pic khoảng thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu pic berberin SKĐ mẫu đối chiếu SKĐ mẫu thử cho pic có thời gian lƣu tƣơng tự với pic berberin SKĐ mẫu đối chiếu Diện tích pic berberin SKĐ mẫu thử thêm chất đối chiếu tăng lên rõ rệt so với diện tích pic berberin SKĐ mẫu thử ban đầu Các pic cần định lƣợng mẫu thử đối chiếu đạt yêu cầu độ tinh khiết pic Bảng 4.4 Kết khảo sát độ đặc hiệu quy trình định lƣợng berberin Mẫu đối chiếu Chất thử Berberin Mẫu thử tR max Purity Purity tR max Purity Purity phút nm angle threshold phút nm angle threshold 5,332 345 0,074 0,218 5,331 345 0,141 0,218 Kết luận: quy trình đạt độ đặc hiệu 38 4.3.2.2 Khảo sát tính tuyến tính Pha mẫu đối chiếu có nồng độ 20% đến 400% so với nồng độ định lƣợng, tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Kiểm tra tính thích hợp phƣơng trình hồi qui ŷ = Ax + B với trắc nghiệm F kiểm tra ý nghĩa hệ số phƣơng trình hồi qui với trắc nghiệm: hệ số phƣơng trình có ý nghĩa Phƣơng trình hồi qui: ŷ = 35849620x – 63037 R2 = 0,9999 Bảng 4.5 Tƣơng quan nồng độ diện tích pic berberin chuẩn Berberin chuẩn C (mg/ml) Diện tích pic (µV*sec) 0,01 323083 0,025 833351 0,05 1712954 0,075 2644062 0,1 3467655 0,15 5320987 0,2 7124918 ŷ = 35849620x – 63037 R2 = 0,9999 39 8000000 y = 35849620x – 63037 R² = 0,9999 7000000 S (µV*sec) 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0,05 0,1 C (mg/ml) 0,15 0,2 0,25 Hình 4.16 Đƣờng biểu diễn tƣơng quan nồng độ diện tích pic berberin Kết luận: hệ số tƣơng quan đạt u cầu Quy trình đạt tính tuyến tính pic berberin khoảng nồng độ khảo sát 4.3.2.3 Khảo sát độ xác a Khảo xác độ lặp lại Tiến hành sắc ký lần mẫu thử, ghi nhận diện tích pic tính hàm lƣợng C% berberin thân rễ Vàng đắng theo cơng thức: Trong đó: St: diện tích pic berberin mẫu thử (µV x giây) Sc: diện tích pic berberin mẫu đối chiếu (µV x giây) Cc: nồng độ chất đối chiếu (g/ml) C%: hàm lƣợng % chất đối chiếu h: độ ẩm dƣợc liệu mdl: khối lƣợng cân bột dƣợc liệu (g) Kết khảo sát độ lặp lại đƣợc trình bày Bảng 4.6 40 Bảng 4.6 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lƣợng berberin Berberin Vàng đắng S (µV*sec) C (%) 1846254 2,90 Số mẫu Kl (mg) 200,0 200,2 1882898 2,96 200,4 1888876 2,97 200,0 1834530 2,88 200,4 1888174 2,97 200,3 1886550 2,96 TB = 2,94 RSD% = 1,17% Nhận xét: hàm lƣợng C% berberin thân rễ Vàng đắng 2,94 ± 0,004% (RSD% = 1,17 < 2%; e = ± 0,004) Kết luận: quy trình đạt độ lặp lại b Khảo sát độ xác trung gian Kết khảo sát độ xác trung gian đƣợc trình bày Bảng 4.7 Bảng 4.7 Kết khảo sát độ xác trung gian (liên ngày) Số mẫu Kl (mg) 200,4 200,4 200,2 200,3 200,0 200,2 Berberin Vàng đắng S (µV*sec) C (%) 1892507 2,98 1894308 2,98 1886254 2,96 1888174 2,97 1882898 2,95 1886550 2,96 TB = 2,97 RSD% = 0,147% Nhận xét: hàm lƣợng C% berberin thân rễ Vàng đắng 2,97 ± 0,005% (RSD% = 0,147 < 2%; e = ± 0,005) Kết luận: phƣơng pháp đạt độ xác trung gian 41 Kết phân tích thống kê ANOVA kết so sánh độ lặp lại độ xác trung gian pic berberin phƣơng pháp HPLC: n = 6; Flt = 4,96; Ftn = 2,5 Nhận xét: giá trị Ftn < Flt Kết luận: khơng có khác biệt kết định lƣợng berebrin thân rễ Vàng đắng thử nghiệm độ lặp lại độ xác trung gian HPLC 4.3.2.4 Khảo sát độ Kết khảo sát độ đƣợc trình bày Bảng 4.8 Bảng 4.8 Tỷ lệ phục hồi berberin Vàng đắng Lƣợng Tỷ lệ thêm Mẫu vào (%) 80 100 120 chuẩn C thêm vào (µg/ml) (mg) Diện tích Lƣợng pic chuẩn tìm (µV*sec) thấy (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 2,00 92,45 3251421 2,03 101,5 2,00 92,46 3251874 2,03 101,5 2,02 92,60 3256344 2,04 101,0 2,63 105,07 3703925 2,66 101,1 2,65 105,24 3709753 2,67 100,7 2,65 105,42 3716585 2,68 101,1 3,00 113,1 3992335 3,06 102,0 3,20 116,7 4122292 3,24 101,2 3,05 114,1 4026817 3,11 101,9 TB = 101,4% RSD (%) = 0,40 % Nhận xét: % tỷ lệ phục hồi berberin khoảng 98 – 102 % Kết luận: quy trình đạt độ 42 4.3.2.5 Giới hạn phát (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ) LOD LOQ đƣợc tính độ lệch chuẩn đáp ứng đƣờng tuyến tính: LOD = 2,8.10-3 mg/ml LOQ = 8,5.10-3 mg/ml Kết luận: quy trình định lƣợng berberin Vàng đắng HPLC đƣợc xây dựng với tính tuyến tính, độ xác cao, độ đạt yêu cầu; giới hạn LOQ, LOD thấp 43 PHẦN KẾT LUẬN 44 CHƢƠNG BÀN LUẬN – KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 5.1 BÀN LUẬN Sau thời gian thực đề tài, chúng tơi hồn thành mục tiêu đề ban đầu: xây dựng thẩm định hồn chỉnh quy trình định lƣợng berberin Vàng đắng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) - Nguyên liệu nghiên cứu đƣợc kiểm tra tiêu cảm quan; đặc điểm bột; độ ẩm hàm lƣợng chất chiết đƣợc theo hƣớng dẫn DĐVN IV Các kết khảo sát cho thấy nguyên liệu đạt yêu cầu để làm mẫu thử cho thử nghiệm - Kết nghiên cứu cho kết luận hàm lƣợng berberin khoảng C% = 2,97 ± 0,005%, cao hàm lƣợng berberin đƣợc báo cáo cơng trình nghiên cứu trƣớc [2], [34], [48] - Kỹ thuật chiết với hỗ trợ sóng siêu âm (chiết siêu âm) đƣợc chọn để lấy hoạt chất (alkaloid) từ nguyên liệu Chiết siêu âm đáp ứng yêu cầu thời gian chiết nhanh; chiết kiệt an toàn Đặc biệt tránh đƣợc tác động nhiệt độ lên mẫu thử; hạn chế phân hủy mẫu Kỹ thuật yếu tố ảnh hƣởng dễ điều chỉnh, lƣợng mẫu nhỏ, hiệu suất chiết cao phƣơng pháp khác Trang thiết bị phổ biến tất phịng thí nghiệm chun phân tích – kiểm nghiệm - Dung môi hữu đƣợc lựa chọn acetonitril kết hợp với dung dịch acid phosphoric 1% với tỷ lệ (30 : 70) Hệ dung môi sử dụng acid để điều chỉnh pH pha động tiết kiệm đƣợc nhiều thời gian cho việc vệ sinh hệ thống sau phân tích hạn chế đƣợc giảm tuổi thọ cột dùng hệ đệm với muối vơ có nồng độ cao - Khảo sát thời gian phân tích với mẫu thử 60 phút cho thấy pic berberin xuất cuối khoảng phút, chọn thời gian phân tích cho mẫu thử 10 phút để đảm bảo cân cho trình phân mẫu 45 - Quy trình đáp ứng tất yêu cầu: độ đặc hiệu; khoảng tuyến tính; độ đúng; độ xác; giới hạn định tính – giới hạn định lƣợng theo qui định ICH Kết thẩm định chứng minh quy trình đƣợc ứng dụng để định tính – định lƣợng berberin nguyên liệu thân rễ Vàng đắng sản phẩm có thành phần berberin Độ đặc hiệu: pic berberin có thời gian lƣu khơng trùng với pic khác có mặt mẫu thử; độ tinh khiết pic berberin đạt yêu cầu Độ xác: với độ lặp lại có RSD% = 1,17% độ xác trung gian có RSD% 0,147% < 2% Độ đúng: tỷ lệ phục hồi pic berberin 101,4%, thuộc giới hạn qui định 98% đến 102% Khoảng tuyến tính: có tƣơng quan nồng độ tỷ số diện tích pic berberin khoảng khảo sát, với phƣơng trình hồi qui ŷ = 35849629x – 63037 (R2 = 0,9999) 5.2 KẾT LUẬN Chúng xây dựng thẩm định hồn chỉnh quy trình định lƣợng berberin thân rễ Vàng đắng phƣơng pháp HPLC với điều kiện xử lý mẫu điều kiện sắc ký nhƣ sau: Mẫu đối chiếu: dung dịch berberin đối chiếu 50 µg/ml đƣợc pha pha động Mẫu thử: cân 200,0 mg bột dƣợc liệu cho vào bình định mức 100 ml, thêm 40 ml methanol; siêu âm khoảng 30 phút nhiệt độ 50 ± oC (x lần) Gạn lớp dịch chiết điền đầy methanol đến vạch bình định mức 100 ml Lọc lấy dịch chiết qua giấy lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu Tất mẫu khảo sát đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 µm trƣớc tiêm vào hệ thống HPLC Các điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm; m) 46 Bƣớc sóng phát hiện: 345 nm Nhiệt độ cột: 40 oC Tốc độ dịng: ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Hệ dung môi: acetonitril – acid phosphoric 1% (30 : 70) 5.3 KIẾN NGHỊ Chúng tơi xin có vài kiến nghị: - Ứng dụng quy trình định lƣợng vào việc xây dựng Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho chế phẩm có Vàng đắng sản phẩm có thành phần berberin; góp phần nâng cao chất lƣợng thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu - Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời palmitin berberin để nâng cao độ xác phƣơng pháp kiểm nghiệm mẫu Vàng đắng - Nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng berberin thân rễ Vàng đắng phƣơng pháp điện di mao quản (HPLC – CE) để góp phần làm phong phú phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học Hà Nội, Hà Nội, tr 33-35, 178-179 Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr 929 Bộ Y Tế (2013), Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (II), NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 504-508 Vũ Tiến Chính, X.N (2011), Nghiên cứu bổ sung liệu dây Ký Ninh - TINOSPORA Miers Họ Tiết Dê (Menispermaceae Juss.) Việt Nam, Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 4, Hà Nội, tr 56 Đặng Văn Hòa, V.Đ (2011), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 135-180 Nguyễn Liêm (2004), Hồi ký hành quân, Trung tâm Di sản nhà khoa học Việt Nam, Hà Nội, tr 315 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr 382-384 Tiếng nước Ali, S.S., et al (2008), "Indian medicinal herbs as sources of antioxidants", Food Research International 41 (1), pp 1-15 10 Armen Takhtajan (2009), "Flowering Plants", Springer, pp 531 11 Assob, J.C.N., et al (2011), "Antimicrobial and toxicological activities of five medicinal plant species from Cameroon Traditional Medicine", BMC Complement Altern Med 11, pp 70 48 12 Babbar, O.P., et al (1982), "Effect of berberine chloride eye drops on clinically positive trachoma patients", Indian J Med Res 76 Suppl, pp 83-8 13 Dkhil, M.A., et al (2015), "Protective effect of berberine chloride on Plasmodium chabaudi-induced hepatic tissue injury in mice", Saudi J Biol Sci 22 (5), pp 551-5 14 Forman, L.L (1968), "The Menispermaceae of Malesia: V Tribe Cocculeae Hook F & Thoms", Kew Bulletin 22 (3), pp 349-374 15 Forman, L.L.S., P.S., (2011), "Menispermaceae", Flora of the Darwin Region 1, pp 1-8 16 I.C.H Harmonised tripartite guiline (2005), Validation of analytical procedure: text and methodology, tr 1-13 17 Isimi, C., et al (2011), "Anti-plasmodial Activity of the Mixed Stem Bark Extracts of Anogeissus leiocarpus and Prosopis africana and in vitro Evaluation of Its Tablet Dosage Form", Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants 17 (4), pp 419-435 18 Jian-ling, J., et al (2011), "Antibacterial mechanisms of berberine and reasons for little resistance of bacteria", Chinese Herb Med (1) 19 Keawpradub, N., S Dej-adisai, and S YuenyongsawadAntioxidant and cytotoxic activities of Thai medicinal plants named Khaminkhruea: Arcangelisia flava, Coscinium blumeanum and Fibraurea tinctoria 20 Kessler, P.J.A (1993), "The Families and Genera of Vascular Plants" 2, pp 402- 418 21 Kumar, G., et al (2007), "Antimicrobial effects of Indian medicinal plants against acne-inducing bacteria", pharmaceutical research (2), pp 717-723 49 Tropical journal of 22 Luo Xianrui, H.-s., Chen Tao& Michael G Gilbert, (208), "Flora of China", Missouri Boitanical Garden Press 7, pp 1-31 23 Malhotra, S., S.C Taneja, and K.L Dhar (1989), "Minor alkaloid from Coscinium fenestratum", Phytochemistry 28 (7), pp 1998-1999 24 Malviya, N., S Jain, and S Malviya (2010), "Antidiabetic potential of medicinal plants", Acta Pol Pharm 67 (2), pp 113-8 25 Maritim, A.C., R.A Sanders, and J.B Watkins, 3rd (2003), "Diabetes, oxidative stress, and antioxidants: a review", J Biochem Mol Toxicol 17 (1), pp 24-38 26 Nair, G.M., et al (2005), "Antibacterial effects of Coscinium fenestratum", Fitoterapia 76 (6), pp 585-7 27 Nazeema, T and V Brindha (2009), "Antihepatotoxic and antioxidant defense potential of Mimosa pudica", Int J Drug Discov 1, pp 1-4 28 Punitha, I.S.R., et al (2005), "Alcoholic Stem Extract of Coscinium fenestratum Regulates Carbohydrate Metabolism and Improves Antioxidant Status in Streptozotocin–Nicotinamide Induced Diabetic Rats", Evid Based Complement Alternat Med (3), pp 375-81 29 Rai, R.V., P.S Rajesh, and H.-M Kim (2012), "Medicinal use of Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.: an short review", Oriental Pharmacy and Experimental Medicine 13 (1), pp 1-9 30 Ravikumar, K., et al (2000), "100 Red listed medicinal plants of conservation concern in Southern India" 31 Rojsanga, P and W Gritsanapan (2005), "Variation of berberine content in coscinium fenestratum stem in Thailand Market", The Mahidol University Journal of Pharmaceutical Sciences 32 (3-4), pp 66-70 50 32 Saravanan, R., B Ramesh, and K Pugalendi (2007), "Effect of Piper betle on hepatotoxicity and antioxidant defense in ethanol-treated rats", Journal of herbs, spices & medicinal plants 12 (1-2), pp 61-72 33 Severina, I.I., et al (2001), "Transfer of cationic antibacterial agents berberine, palmatine, and benzalkonium through bimolecular planar phospholipid film and Staphylococcus aureus membrane", IUBMB life 52 (6), pp 321-324 34 Shigwan, H., et al (2013), "HPLC Method Development and Validation for Quantification of Berberine from Berberis aristata and Berberis tinctoria", International Journal of Applied Science and Engineering 11 (2), pp 203-211 35 Shirwaikar, A., K Rajendran, and I.S Punitha (2005), "Antidiabetic activity of alcoholic stem extract of Coscinium fenestratum in streptozotocin-nicotinamide induced type diabetic rats", J Ethnopharmacol 97 (2), pp 369-74 36 Shirwaikar, A., K Rajendran, and I.S.R Punitha (2005), "Antihyperglycemic Activity of the Aqueous Stem Extract of Coscinium fenestratum in Non–insulin Dependent Diabetic Rats", Pharmaceutical Biology 43 (8), pp 707-712 37 Simoes, M., R.N Bennett, and E.A.S Rosa (2009), "Understanding antimicrobial activities of phytochemicals against multidrug resistant bacteria and biofilms", Natural Product Reports 26 (6), pp 746-757 38 Singburaudom, N (2015), "The alkaloid Berberine isolated from Coscinium fenestratum is an inhibitor of phytopathogenic fungi", Journal of Biopesticides (1), pp 28 39 Singh, G.B., et al (1990), "Hypotensive action of a Coscinium fenestratum stem extract", J Ethnopharmacol 30 (2), pp 151-5 51 40 Stermitz, F.R., et al (2000), "Synergy in a medicinal plant: antimicrobial action of berberine potentiated by 5'- methoxyhydnocarpin, a multidrug pump inhibitor", Proc Natl Acad Sci U S A 97 (4), pp 1433-7 41 Tushar, K., et al (2008), "Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr A review on this rare, critically endangered and highly-traded medicinal species", Journal of Plant Sciences (2), pp 33-145 42 Tran, Q.L., et al (2003), "In vitro antiplasmodial activity of antimalarial medicinal plants used in Vietnamese traditional medicine", J Ethnopharmacol 86 (2-3), pp 249-52 43 Venukumar, M.R and M.S Latha (2002), "Antioxidant effect of Coscinium fenestratum in carbon tetrachloride treated rats", Indian J Physiol Pharmacol 46 (2), pp 223-8 44 Venukumar, M.R and M.S Latha (2004), "Effect of Coscinium fenestratum on hepatotoxicity in rats", Indian J Exp Biol 42 (8), pp 792-7 45 Vicente, E., et al (2008), "Synthesis and antiplasmodial activity of 3furyl and 3-thienylquinoxaline-2-carbonitrile 1,4-di-N-oxide derivatives", Molecules 13 (1), pp 69-77 46 Warrier, P.K., V.P.K Nambiar, and C Ramankutty (1994), Indian Medicinal Plants: A Compendium of 500 Species, Orient Longman 47 Yin, J., H Xing, and J Ye (2008), "Efficacy of Berberine in Patients with Type Diabetes", Metabolism: clinical and experimental 57 (5), pp 712-717 48 Weber, H.A and M Joseph (2004), "[Extraction and HPLC analysis of alkaloids in goldenseal]", Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 20 (2), pp 306-8 52