Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng Mangiferin trong cây Tri mẫu bằng phương pháp HPLC nghiên cứu xác định thành phần hoạt chất quan trọng của Tri mẫu trong điều trị biến chứng trên thần kinh trung ương do bệnh đái tháo đường bằng phương pháp network pharmacology; xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Mangiferin (thành phần hoạt chất quan trọng của Tri mẫu trong điều trị DN, thu được từ mục tiêu 1) trong cây Tri mẫu bằng phương pháp HPLC.
có cĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRẦN HOÀNG MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MANGIFERIN TRONG CÂY TRI MẪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: TRẦN HỒNG MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MANGIFERIN TRONG CÂY TRI MẪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2017.Y Người hướng dẫn : TS Hồng Lê Sơn ThS Nguyễn Xuân Bách Hà Nội - 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Hoàng Lê Sơn – Cán Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu ThS Nguyễn Xuân Bách – Giảng viên Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội định hướng, tận tâm bảo tạo điều kiện tốt giúp em hồn thành đề tài Khóa luận Các thầy khơng truyền đạt kiến thức học thuật cho em mà cung cấp, trang bị thêm cho em thêm nhiều kĩ quan trọng khác sống Em xin cảm ơn tới chị Ngô Thị Lan Hương Quý thầy, cô, anh chị Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu tạo điều kiện dẫn cho em nhiều trình thực Khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cán bộ, giảng viên trực thuộc Trường Đại học Y Dược tận tình dạy, giúp đỡ cho em suốt năm học tập nghiên cứu chuyên ngành Dược học nơi Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, anh, chị bạn bè bên, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu, thực Khóa luận Trong thời gian thực Khóa luận, hướng dẫn tận tình thầy cô, em nỗ lực học tập, nghiên để hồn thành Khóa luận Tuy nhiên kiến thức hạn hẹp, thời gian nghiên cứu chưa nhiều ảnh hưởng tình hình dịch bệnh nên Khóa luận em khơng thể tránh khỏi thiết sót Em mong nhận lời nhận xét, góp ý Q thầy để Khố luận tốt nghiệp Dược sĩ em hoàn thiện Lời cuối, em xin phép kính chúc Quý thầy, cô người hạnh phúc, khỏe mạnh thành công sống! Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Trần Hoàng Minh Đức DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Aβ AChE AGEs BC BP (GO) CC CC (GO) COX-2 DC DN ERK1/2 GO HĐC HIF HPLC IC50 KEGG LOD LOQ MAPK MF (GO) NF-κB PPI RAGE Nghĩa tiếng anh Amyloid beta-peptide Acetylcholinesterase Advanced glycation end products Betweenness Centrality Biological Process Closeness Centrality Cellular Component Cyclooxygenase-2 Degree Centrality Diabetic Neuropathy extracellular signal‑regulated protein kinase Gene Ontology Hypoxia-inducible factor High performance Liquid Chromatographic Half-maximal inhibitory concentration Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Limit of Detection Limit of Quantitation Mitogen-activated protein kinase Molecular function Nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B Protein – Protein interacion network Receptor for advanced glycation end products Nghĩa tiếng việt Sản phẩm chuyển hóa cuối trình glycation nâng cao Thơng số Betweenness Q trình sinh học Thông số Closeness Thành phần tế bào Thông số Degree Biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường Tín hiệu ngoại bào điều hịa protein kinase Bản thể học gene Hoạt chất – Đích – Con đường sinh hóa Yếu tố cảm ứng thiếu oxy Sắc ký lỏng hiệu cao Nồng độ ức chế tối thiểu 50% Bách khoa toàn thư gene gene Kyoto Giới hạn phát Giới hạn định lượng Protein kinase hoạt hóa mitogen Chức phân tử Yếu tố hạt nhân tăng cường chuỗi nhẹ kappa tế bào B hoạt động Mạng tương tác protein – protein Thụ thể sản phẩm cuối trình glycation nâng cao Từ viết tắt ROS VEGF TNF-α Nghĩa tiếng anh reactive oxygen species Vascular endothelial growth factor Tumor Necrosis Factor Alpha Nghĩa tiếng việt Các loại oxy phản ứng Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu Yếu tố hoại tử khối u alpha DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí Tri mẫu hệ thống phân loại thực vật Bảng 1.2 Các thể lâm sàng DN đặc điểm chúng 15 Bảng 2.1 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu .24 Bảng 2.2 Dung mơi, hố chất sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Các phần mềm sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.4 Chương trình rửa giải hệ thống HPLC 29 Bảng 3.1 Các thông số đánh giá với chất chuẩn Mangiferin HPLC 41 Bảng 3.2 Quan hệ tuyến tính nồng độ với diện tích pic Mangiferin 43 Bảng 3.3 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống 44 Bảng 3.4 Bảng kết độ lặp lại 44 Bảng 3.5 Kết độ thu hồi Mangiferin 45 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình vẽ mơ tả Tri mẫu bao gồm thân rễ (1); cành hoa (2); hoa (3); thân (4); nhị hoa tràng hoa (5); búp hoa (6) .3 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học saponin steroid Tri mẫu Hình 1.3 Cấu trúc hóa học flavonoid Tri mẫu Hình 1.4 Cấu trúc hóa học alkaloid Tri mẫu Hình 1.5 Cấu trúc hóa học phenylpropanoid Tri mẫu .8 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học acid hữu có Tri mẫu Hình 3.1 Mạng PPI Tri mẫu – DN bao gồm Mạng (A) xây dựng từ gene tiềm thu từ sở liệu STRING-db gồm 49 nốt 212 cạnh Trong đó, cạnh tơ màu theo loại tương tác xác minh (biểu diện hình) Mạng (B) đưa từ sở liệu STRING-db vào phần mềm Cytoscape 3.8.2 gồm 45 nốt 212 cạnh Mạng (C) lọc từ mạng (B) dựa nốt có giá trị DC, BC, CC lớn trung bình, mạng gồm 15 cạnh 85 cạnh Nốt có giá trị DC lớn có màu đỏ kích thước lớn 34 Hình 3.2 Biểu đồ phân tích chức GO gene tiềm Tri mẫu điều trị biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường Theo thứ tự hình (A) biểu đồ chức GO-BP, hình (B) biểu đồ chức GOCC hình (C) biểu đồ chức GO-MF Mỗi biểu đồ bao gồm 20 chức quan trọng dựa số gene tiềm 35 Hình 3.3 Biểu đồ cột thể 46 đường sinh hóa có giá trị DC, BC CC lớn giá trị trung bình mạng HĐC Trục x thể số gene tham gia đường sinh hóa Các đường sinh hóa có giá trị p-value nhỏ cho màu sắc đậm 36 Hình 3.4 Sơ đồ đường tín hiệu AGE-RAGE biến chứng đái tháo đường (AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, hsa04933), nốt bơi đỏ gene đích thành phần hoạt chất Tri mẫu điều trị biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường .37 Hình 3.5 Mạng Hoạt chất – Đích – Con đường sinh hóa (HĐC) gồm 168 nút 3321 cạnh Trong đó, nút kim cương màu xanh đại diện cho Tri mẫu, 73 nút trịn tím đại diện cho 73 hoạt chất, 48 nút tròn đỏ đại diện cho 48 đích tiềm 46 nút chữ V vàng đại diện cho 46 đường sinh hóa Mỗi nhóm nút có thay đổi kích thước theo số cạnh liên kết, cạnh đại diện cho tương tác nút 39 Hình 3.6 Kết biểu diễn chế liên kết docking 3D (trên) 2D (dưới) hợp chất A12 (3,5,7-Trihydroxy-4'-methoxyl-8-prenylflavone-3-Orhamnopyranoside) với protein 2H44 (Hình A, gene PDE5A, docking score=-13,44) protein 5KCV (Hình B, gene AKT1, docking score=-13,07); A44 (Mangiferin) với protein 6V63 (Hình C, gene ACTB, docking score=-13,70) protein 2H44 (Hình D, gene PDE5A, docking score=-13,56); A51 (Neomangiferin) với protein 6V63 (Hình E, gene ACTB, docking score=-14,45) protein 3O96 (Hình F, gene AKT1, docking score=-14,28) Mơ hình tương tác 2D biểu diễn liên kết trực tiếp phối tử protein (liên kết hydro, liên kết ion) thông qua đường nét đứt, tương tác kỵ nước biểu diễn qua nét màu xanh 40 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Mangiferin (A), mẫu trắng (B) mẫu dịch chiết Tri mẫu (C) bước sóng λ 257 nm 42 Hình 3.8 Đường chuẩn thể mối liên hệ nồng độ diện tích pic Mangiferin phân tích HPLC 43 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU Chương – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tri mẫu (A asphodeloides Bunge) .2 1.1.1 Tên khoa học .2 1.1.2 Đặc điểm thực vật, phận sử dụng công dụng 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng sinh học .9 1.2 Tổng quan biến chứng thần kinh trung ương gây đái tháo đường .13 1.2.1 Khái quát biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường 13 1.2.2 Dịch tễ học hậu 13 1.2.3 Sinh lý bệnh biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường 13 1.2.4 Đặc điểm thể lâm sàng biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường 14 1.2.5 Các thuốc điều trị biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường 16 1.3 Tổng quan số phương pháp định lượng hoạt chất dược liệu Tri mẫu .19 1.3.1 Định lượng Mangiferin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao theo dược điển Trung Quốc (2020) 19 1.3.2 Định lượng hoạt chất Tri mẫu phương pháp sắc ký lỏng theo dược điển Anh (2018) .19 1.3.3 Định lượng hoạt chất Tri mẫu phương pháp sắc ký lỏng theo dược điển Hong Kong (2005) 20 1.4 Khái quát số khái niệm sử dụng 20 1.4.1 Phương pháp network pharmacology .20 1.4.2 Phương pháp Docking .21 1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 22 1.4.4 Thẩm định quy trình phân tích 22 Chương – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Trang thiết bị, dung mơi, hóa chất, phần mềm 24 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 24 2.2.2 Dung mơi, hố chất 24 2.2.3 Các phần mềm 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Dự đoán chế hoạt chất quan trọng Tri mẫu điều trị DN 25 2.3.2 Định lượng hợp chất Mangiferin Tri mẫu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 28 Chương – KẾT QUẢ 32 3.1 Dự đoán chế hoạt chất quan trọng Tri mẫu điều trị DN .32 3.1.1 Sàng lọc thành phần hoạt chất Tri mẫu protein đích liên quan đến biến chứng thần kinh trung ương đái tháo đường 32 3.1.2 Sử dụng phương pháp docking xác định protein tiềm có liên quan đến DN 32 3.1.3 Xây dựng phân tích mạng tương tác protein-protein (PPI, Proteinprotein interaction network) 32 3.1.4 Phân tích chức GO đường sinh hóa KEGG đích tiềm 34 3.1.5 Xây dựng phân tích mạng Hoạt chất – Đích – Con đường sinh hóa (HĐC) 37 3.2 Định lượng hợp chất Mangiferin Tri mẫu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .41 3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng 41 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng .42 Chương – BÀN LUẬN 46 4.1 Về phương pháp network pharmacology .46 4.2 Về quy trình định lượng Mangiferin HPLC 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 50 Kết luận 50 Đề xuất 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ... hiện: TRẦN HOÀNG MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MANGIFERIN TRONG CÂY TRI MẪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2017.Y Người hướng... 37 3.2 Định lượng hợp chất Mangiferin Tri mẫu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .41 3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng 41 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng ... ràng Do đó, đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng Mangiferin Tri mẫu phương pháp HPLC? ?? tiến hành với mục tiêu: Nghiên cứu xác định thành phần hoạt chất quan trọng Tri mẫu điều trị biến