ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ====== ====== NGUYỄN THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD KHOÁ LUẬ[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ====== ====== NGUYỄN THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019 dP rm ac y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ====== ====== an NGUYỄN THỊ HUÊ ine XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ed ic CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG M PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG ho ol of CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QHY.2014 rig ht @ Sc KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Co py NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI - 2019 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U LỜI CẢM ƠN ac y, Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ mơn Hố Dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận dP rm Tôi xin cảm ơn thầy Bộ mơn Hố Dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, tạo điều kiện để tơi thực khóa luận an Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, Phòng ban Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tồn thể thầy giáo Khoa cho kiến thức quý báu suốt năm học tập, sinh hoạt rèn luyện Khoa Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Huê Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U CHỮ VIẾT TẮT Acetonitril BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia) DAD Máy đo quang (Diode Array Detector) EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High - performance liquid chromatography) dP rm ac y, ACN Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MS Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ) NIR Quang phổ cận hồng ngoại RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) ho ol of M ed ic ine an ICH Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia) Co py rig ht @ Sc USP PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN ac y, 1.1 Giới thiệu chung sả chanh 1.2 Giới thiệu chung citral dP rm 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Cấu trúc tính chất 1.2.3 Công dụng 1.2.4 Các phương pháp định lượng citral an 1.3 Thẩm định quy trình phân tích ine 1.3.1 Tính đặc hiệu ed ic 1.3.2 Miền giá trị 10 1.3.3 Tính tuyến tính 10 M 1.3.4 Giới hạn phát 11 of 1.3.5 Giới hạn định lượng 11 1.3.6 Độ 12 ho ol 1.3.7 Độ xác 13 Sc CHƯƠNG - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 14 @ 2.1.1 Dung mơi, hố chất 14 ht 2.1.2 Trang thiết bị 14 rig 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 py 2.2.1 Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 14 Co 2.2.2 Thẩm định tính đặc hiệu 15 2.2.3 Thẩm định tính tuyến tính xác định miền giá trị 15 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 2.2.4 Xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 15 VN U 2.2.5 Thẩm định độ 15 2.2.6 Thẩm định độ xác 15 ac y, 2.2.7 Định lượng citral tinh dầu sả chanh 16 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 dP rm 3.1 Xác định điều kiện phân tích 17 3.1.1 Khảo sát hệ dung môi 17 3.1.2 Xác định bước sóng hấp thụ 19 3.1.3 Điều kiện sắc ký 20 an 3.2 Tính đặc hiệu 21 ine 3.3 Tính tuyến tính miền giá trị 23 3.3.1 Đối với đồng phân neral 23 ed ic 3.3.2 Đối với đồng phân geranial 24 3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 26 M 3.5 Độ 26 of 3.5.1 Đối với đồng phân neral 26 ho ol 7.5.2 Đối với đồng phân geranial 27 3.6 Độ lặp lại 27 Sc 3.6.1 Đối với đồng phân neral 28 @ 3.6.2 Đối với đồng phân geranial 29 3.7 Độ xác trung gian 29 rig ht 3.7.1 Đối với đồng phân neral 30 3.7.2 Đối với đồng phân geranial 31 py 3.8 Định lượng citral số mẫu tinh dầu sả chanh 31 Co 3.8.1 Sản phẩm A 31 3.8.2 Sản phẩm B 32 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 3.8.3 Sản phẩm C 33 VN U 3.8 Bàn luận 35 CHƯƠNG - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận 38 ac y, 4.2 Kiến nghị 39 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm TÀI LIỆU THAM KHẢO PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Neral (A) Geranial (B) VN U DANH MỤC CÁC HÌNH ac y, Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v) 17 dP rm Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng phát 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) 18 Hình 3.3 Phổ hấp thụ UV-VIS Neral (A) Geranial (B) 19 an Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml điều kiện sắc ký lựa chọn 20 Hình 3.5 Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS geraniol 21 ed ic ine Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chứa 20 µg/ml citral µg/ml geraniol bước sóng phát 200 nm 21 M Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chứa 20 µg/ml citral µg/ml geraniol bước sóng phát 242 nm 22 of Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn tương quang nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân neral 24 ho ol Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tương quang nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân geranial 25 Sc Hình 3.10 Kết xác định độ lặp lại phương pháp đồng phân neral 28 32 Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml 33 Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml 34 Co py rig ht @ Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tên gọi sả chanh số nước Bảng 1.2 Hàm lượng citral số loại tinh dầu ac y, Bảng 3.1 Thông số pic dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng phát 233 nm với hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v) 18 dP rm Bảng 3.2 Thông số pic dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng phát 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) 19 20 an Bảng 3.3 Thông số pic dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml điều kiện sắc ký lựa chọn ine Bảng 3.4 Thông số pic dung dịch citral 20 µg/ml dung dịch geraniol µg/ml bước sóng phát 200 nm 22 ed ic Bảng 3.5 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân neral 23 M Bảng 3.6 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân geranial 25 26 Bảng 3.8 Kết xác định tỷ lệ phục hồi đồng phân geranial 27 ho ol of Bảng 3.7 Kết xác định tỷ lệ phục hồi đồng phân neral Sc Bảng 3.9 Kết xác định độ lặp lại phương pháp đồng phân geranial 29 @ Bảng 3.10 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp đồng phân neral 30 35 Bảng 4.1 Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng neral 38 Bảng 4.2 Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng geranial 39 Co py rig ht Bảng 3.11 So sánh số phương pháp định lượng citral PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U ac y, dP rm an ine ed ic M of ho ol Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U MỞ ĐẦU dP rm ac y, Sả chanh (Cymbopogon citratus) gọi cỏ sả, sả, hương mao, thuộc họ Lúa có nguồn gốc vùng nhiệt đới Cây cao khoảng 1,5 m sống lâu năm mọc thành bụi, phân nhánh nhiều Sả sử dụng làm gia vị chế biến ăn mà sử dụng nhiều nước giới [16] Tại Việt Nam, sả chanh dễ trồng, thích hợp với nhiều loại đất vùng trung du, miền núi mang lại hiệu kinh tế cao of M ed ic ine an Tinh dầu sả chanh nhà khoa học quan tâm khả ức chế hoạt động sống số nhóm vi sinh vật gây bệnh hoạt tính dược lý Priyanka Singh cộng nghiên cứu ảnh hưởng tinh dầu sả chanh đến phát triển khả sản sinh độc tố Aspergillus flavus Kết cho thấy tinh dầu sả chanh ức chế hoàn toàn phát triển nấm mốc A flavus [38] ức chế hình thành biofilm gây nên Candida albicans, Listeria monocytogenes (biofilm nguyên nhân gây nhiễm khuẩn cơng nghiệp sản xuất thực phẩm chúng khó bị loại trừ trình vệ sinh hệ thống trang thiết bị) [21,27] Một số cơng trình nghiên cứu thành phần tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus) cho thấy thành phần tinh dầu sả chanh citral, bao gồm hai đồng phân geranial (citral-A) neral (citral-B) [6] Co py rig ht @ Sc ho ol Tại Việt Nam, tinh dầu sả chanh phổ biến thị trường chất lượng chưa kiểm soát chặt chẽ Nhằm kiểm sốt chất lượng tinh dầu sả chanh, chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình định lượng citral tinh dầu sả chanh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò dãy diod theo hướng dẫn Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng citral số sản phẩm thương mại PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung sả chanh dP rm ac y, Cây sả chanh tên khoa học Cymbopogon citratus, thuộc họ Poaceae, loại thảo dược vùng nhiệt đới có nguồn gốc từ Ấn Độ Sri Lanka [32] Loài sử dụng nhiều nước giới với nhiều tên gọi khác (bảng 1.1) Bảng 1.1 Tên gọi sả chanh số nước [45] Đất nước Tên gọi English Lemon grass, Citronella ( نوُِ يش لَلا َةشيِشHashisha al-limun) an Middle Eastern ( Arabic) 草薑(Chou geung) M ed ic ine Chinese 風茅(Fung maauh) of ho ol Serai, Serai dapur Dutch Citroengras, Sereh Sc Malaysia French Verveine des Indes German Zitronengras, Citronella, Lemongras Greek Λεμονόχορτο (Lemonochorto ) ht @ 草薑(Chou geung) 檸檬草(Nihng mung chou) Κιτρονέλλα (Kitronella) (Cymbopogon rig py Co 風茅(Fung maauh) nardus ( ןומיל בשעEssef limon) Hebrew PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ( סארג ןומילLimonit rehanit) Sera, Verveine Italian Cimbopogone Russian Лимонное сорго(Limonnoe sorgo) VN U India (Hindi) ac y, Лимонная трава(Limmonaya trava) Zacate de limón, Te de limón, Ca de dP rm Spanish Limón, Citronella, Hierba de Limón レモングラス(Remonso) Japanese an レモンソウ(Remonguraso Limon out ine Turkish Sả chanh, Sả (Sa chanh, Sa) ed ic Vietnamese Co py rig ht @ Sc ho ol of M Cây trồng rộng rãi vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới thích hợp với khí hậu ẩm ướt điều kiện đầy đủ ánh nắng mặt trời Trong điều kiện hỗ trợ, chịu đựng loại khí hậu khác Tuy nhiên, khu vực ôn đới, không sống vào mùa đơng rễ bị đóng băng [49] Loại nhiệt đới phát triển nhanh thành cụm dày đặc, đạt chiều cao 180 cm chiều rộng khoảng 120 cm Lá rộng khoảng cm, dài khoảng 90 cm, đầu nhọn rủ xuống có màu xanh sáng [50] Cây sả chanh có lẽ biết đến nhiều xuất ẩm thực Thái Lan Việt Nam Sả chanh sử dụng loại trà thảo dược đồ uống khơng cồn khác, nướng bánh kẹo Sả chanh từ lâu sử dụng y học cổ truyền Ấn Độ loại thuốc để hạ sốt, làm giảm ợ đường tiêu hóa, chống nhiễm trùng chống trùng hiệu [39] Tinh dầu chiết xuất từ sả chanh sử dụng rộng rãi hương thơm nước hoa mỹ phẩm có đặc tính khử mùi tốt Trong liệu pháp mùi hương, tinh dầu sả chanh sử dụng chất chống trầm cảm, làm dịu đau nhức giảm căng thẳng [39] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ac y, VN U Tinh dầu sả chanh có thành phần citral Chất lượng tinh dầu sả chanh xác định hàm lượng citral, mùi thơm tinh dầu sả chanh thành phần aldehyd định [34] Trong tinh dầu sả chanh, đồng phân trans geranial (40 đến 62%) chiếm ưu so với đồng phân cis neral (25 đến 38%) [37] 1.2 Giới thiệu chung citral dP rm 1.2.1 Nguồn gốc Citral thành phần số loại tinh dầu (bảng 1.2) [15,25,30] Bảng 1.2 Hàm lượng citral số loại tinh dầu Loại tinh dầu Hàm lượng citral (%) an Backhousia citriodora ine Litsea citrata 90 70-85 Cymbopogon citratus 65-85 Leptospermum liversidgei 70-80 M ed ic Litsea cubeba 90-98 66,5 of Ocimum gratissimum 65 Calypranthes parriculata 62 Petitgrain 36 Sc ho ol Lindera citriodora 26 Aloysia citriodora 30-35 Melissa officinalis 11 rig ht @ Eucalyptus staigeriana Co py Citral aldehyd có cơng thức C10H16O phân lập lần Bertram [8] từ tinh dầu Backhousia citriodora Năm 1890, Dodge phân lập citral từ tinh dầu sả chanh [12] Sau đó, Tiemann cộng [23] phân lập đồng thời hai đồng phân geranial (citral A) neral (citral B) PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U citral Citral A dễ dàng tách khỏi citral B phương pháp bisulphate natri đề xuất Tiemann [44] 1.2.2 Cấu trúc tính chất ac y, Citral có danh pháp quốc tế 3,7-dimethyl-2,6-octadienal, khối lượng mol phân tử 152,237 g/mol Citral có số CAS 5392-40-5, mã Pubchem 638011 [51] an dP rm Citral chất lỏng màu vàng nhạt, có mùi chanh mạnh Citral hịa tan nước (độ hòa tan nước 0,059 g/100ml 25 0C); hòa tan rượu (độ hòa tan rượu ml 7ml cồn 70%); đồng tan benzen benzoat, diethyl phthalate, glycerin, propylene glycol, dầu khoáng, dầu cố định cồn 95% Citral có khối lượng riêng 0.9 g/cm³ nhiệt độ sôi 229 °C (502 K; 444 °F) [51] ho ol of M ed ic ine Citral hỗn hợp hai đồng phần hình học monoterpene aldehyd có công thức phân tử C10H16O Hai đồng phân có tên gọi neral (Cis hay Z) geranial (Trans hay E) thể tính chất vật lí gần giống Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Neral (A) Geranial (B) Sc 1.2.3 Công dụng rig ht @ Geranial có mùi chanh mạnh Mùi chanh neral nồng hơn, Do Citral hợp chất hương thơm sử dụng nước hoa để tạo mùi hương họ cam quýt Citral sử dụng hương liệu làm tăng thêm mùi hương tinh dầu sả chanh Co py Citral cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Gram dương Gram âm nấm tinh dầu có tính chất kỵ nước, cơng phá vỡ màng tế bào, gây ảnh hưởng đến hệ thống enzym dẫn đến ức chế hô hấp gây chết tế bào Do đó, citral sử dụng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U chất bảo quản ngành cơng nghiệp thực phẩm, xà phịng mỹ phẩm [30] dP rm ac y, Mặc dù citral tinh dầu sả chanh có khả xua đuổi trùng, nhiên tinh dầu sả chanh lại có tác dụng hấp dẫn sử dụng "mồi nhử" để thu hút ong mật Vì chất pheromone từ ong chúa tiết giống mùi tinh dầu sả chanh Do kỹ thuật ni ong mật người ta dùng tinh dầu sả chanh chất gọi đàn đàn ong chuyển vùng [24,33] Citral dùng để tổng hợp vitamin A, ionone methylionone an Citral thử nghiệm lâm sàng rộng rãi, không gây biến đổi gen hay gây ung thư [40] 1.2.4 Các phương pháp định lượng citral ine Phương pháp chuẩn độ (theo dược điển Anh) ho ol of M ed ic Tiến hành lấy 25 mẫu tinh dầu sả chanh nguyên chất trộn mẫu với ethanol tuyệt đối Sau đó, thêm vào hỗn hợp dung dịch hydroxylamine hydrochloride dung dịch xanh promophenol Thêm axit clohydric, hiệu chỉnh lượng axit clohydric theo phản ứng hydroxylamine với citral Axit clohydric phản ứng chuẩn độ từ từ với dung dịch kali hydroxit etanolic chuẩn màu 19 chuyển từ màu vàng sang màu xanh liu Hàm lượng citral tìm thấy mẫu tinh dầu sả chanh 69,89-76,95% Sc Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại Co py rig ht @ Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại Wilson cộng xây dựng để xác định hàm lượng citral tinh dầu sả chanh vào năm 2002 [17] Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại dựa hấp thụ xạ điện tử bước sóng phạm vi 750 – 2500 nm: Khi có chùm ánh sáng tới chiếu qua mẫu, vùng ánh sáng cận hồng ngoại (bước sóng 750 – 2500 nm) liên kết C-H, N-H, O-H có chất hữu hấp phụ Ghi nhận phổ ánh sáng phản xạ từ mẫu thu thơng tin thành phần hóa học mẫu Phổ thu phân tích phần mềm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U máy tính Áp dụng mơ hình thống kê nhiều biến mơ tả mối quan hệ phổ hấp phụ thành phần hóa học; mối quan hệ sở để xác định thành phần hóa học máy phân tích (máy NIR) [46] dP rm ac y, Các tác giả tiến hành lấy 26 mẫu tinh dầu sả chanh quét phổ khoảng 1100-2500 nm máy Foss NIR- System 6500 Rapid Content Sample Mỗi mẫu thu lấy phổ (mỗi phổ trung bình 32 lần qt) Quang phổ sau tính trung bình phần mềm NSAS phiên 3.52 Kết thu hàm lượng citral trung bình mẫu tinh dầu sả chanh 75,77% (w/w) có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) độ xác trung gian 1,00% RSD độ 0,23% [46] ed ic ine an Tham chiếu với phương pháp định lượng citral tinh dầu sả chanh quy định Dược điển Anh, phương pháp NIR có độ xác tương đương Tuy nhiên, phương pháp NIR có ưu điểm so với phương pháp Dược điển Anh thực đơn giản hơn, không cần xử lý mẫu thời gian định lượng nhanh [46] Phương pháp sắc ký khí ht @ Sc ho ol of M Phương pháp Gaonkar cộng [49] xây dựng để định lượng đồng thời đồng phân hình học citral có mẫu tinh dầu sả chanh Phân tích thực máy Agilent technologies 5975 Inert Mass Selective Detector GC–MS Sử dụng cột sắc ký HP-5MS với chiều dài 30 mm, đường kính (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25 µm Heli sử dụng làm khí mang với tốc độ dịng 1ml/phút Nhiệt độ buồng bơm mẫu 250oC Nhiệt độ phận phát 260oC Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: trình nhiệt độ 75oC phút, tăng 4oC/phút 250oC, dừng nhiệt độ 10 phút Kết thu hàm lượng citral mẫu tinh dầu sả chanh 72,57% rig Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Co py Sắc ký lỏng hiệu cao kỹ thuật phân tích dựa sở phân tách chất pha tĩnh chứa cột, nhờ dòng di chuyển pha động lỏng áp suất cao Sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng Khi phân tích PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha thuận VN U sắc ký, chất hịa tan dung mơi thích hợp hầu hết phân tách xảy nhiệt độ thường Chính mà chất không bền với nhiệt không bị phân hủy sắc ký [3,11,22,29] ine an dP rm ac y, Phương pháp Rauber cộng [50] xây dựng để xác định hàm lượng citral có tinh dầu sả chanh Phân tích sử dụng pha động nhexane : ethanol (85:15, v/v) với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, ghép với đầu dò UV cài đặt bước sóng 233nm để phát citral Phương pháp sử dụng cột pha thuận CN Kết thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu citral 13,8 phút Trong khoảng nồng độ tiến hành có tương quan chặt chẽ với độ lệch chuẩn se slopes 1,78 hệ số xác định R2 = 0,9991 Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ độ xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD độ lặp lại ≤ 1,37% ed ic Ứng dụng phương pháp trên, xác định hàm lượng citral mẫu tinh dầu sả chanh 75,20% Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo Co py rig ht @ Sc ho ol of M Phương pháp Gaonkar cộng [49] xây dựng để định lượng đồng thời đồng phân hình học citral có số mẫu tinh dầu Phân tích sử dụng cột silicagel pha đảo Enable C - 18G (250 ì 4,6 mm, à), pha ng acetonitril : nước (70: 30, v/v) với tốc độ dòng ml/phút; ghép với đầu dò DAD đặt bước sóng 233nm để phát citral Nhiệt độ cột 22oC, đầu dị có nhiệt độ 40oC độ rộng khe 1,2 nm Kết thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu neral geranial tương ứng 7,246 phút 7,680 phút Trong khoảng nồng độ citral từ – 100 µg/ml, có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic y (mAU.min) nồng độ dung dịch x (µg/ml) theo phương trình đồng phân neral y = 230540x – 100165 (hệ số xác định R2 = 0,9996), phương trình đồng phân geranial y = 260014x + 23521 (hệ số xác định R2 = 0,9964) Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) đồng phân neral 0,062 µg/ml 0,205 µg/ml, đồng phân geranial 0,059 µg/ml 0,198 µg/ml Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U độ xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD độ lặp lại ≤ 1,74%, RSD độ xác trung gian ≤ 1,93% ac y, Ứng dụng phương pháp để định lượng citral có tinh dầu sả chanh, tinh dầu chanh ta tinh dầu vỏ chanh tây Kết xác định hàm lượng citral mẫu tinh dầu sả chanh 74,98%, mẫu tinh dầu chanh ta 2.09% mẫu tinh dầu từ vỏ chanh tây 0,3% dP rm 1.3 Thẩm định quy trình phân tích ed ic ine an Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung phương pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) ICH (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [43], yếu tố quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính miền giá trị LOD LOQ thơng số khơng bắt buộc phải có quy trình thẩm định 1.3.1 Tính đặc hiệu M Phương pháp HPLC coi chọn lọc chất phân tích nếu: ho ol of - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác khơng có ý nghĩa thống kê với pic chất chuẩn sắc ký đồ mẫu chuẩn - Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [1,2,14,43] Sc Phương pháp xác định rig ht @ Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD khối phổ, việc sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic giúp tránh nhầm lẫn với hợp chất có cấu trúc tương tự chứng minh sắc ký pic hai thành phần trở lên Co py Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay khơng tự tạo mẫu có sản phẩm phân huỷ so sánh với mẫu khơng có sản phẩm phân huỷ PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma 1.3.2 Miền giá trị VN U Khái niệm ac y, Miền giá trị quy trình phân tích khoảng nồng độ cao nồng độ thấp chất cần phân tích có mẫu thử với nồng độ khoảng phải đáp ứng độ xác lẫn độ tính chất tuyến tính phương pháp [1,2,14,43] - dP rm Phương pháp xác định Khảo sát đánh giá tính tuyến tính khoảng nồng độ định an - Sau thiết lập cách khẳng định khoảng có đáp ứng độ tuyến tính chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không ine Yêu cầu ed ic Với quy trình định lượng nguyên liệu thuốc, yêu cầu tối thiểu miền giá trị phải đạt 80% - 120% nồng độ mẫu thử [1,2,14,43] Khái niệm M 1.3.3 Tính tuyến tính ho ol of Tính tuyến tính quy trình phân tích khả luận kết phương pháp dựa vào đường biểu diễn phụ thuộc độ đáp ứng đại lượng đo chiều cao diện tích pic (y) nồng độ (x) Sc Tính tuyến tính biểu thị phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,14,43] @ Phương pháp xác định - Khảo sát [43] [14] mức nồng độ khác rig ht - Nồng độ cao thấp phải nằm khoảng xác định phương pháp Các mẫu pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu py - Co - Đánh giá tính tuyến tính phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp phương trình 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ... chặt chẽ Nhằm kiểm soát chất lượng tinh dầu sả chanh, tiến hành xây dựng quy trình định lượng citral tinh dầu sả chanh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò dãy diod theo hướng dẫn Hội nghị... ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ====== ====== an NGUYỄN THỊ HUÊ ine XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ed ic CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG M PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG ho ol of CAO. .. ac y, VN U Tinh dầu sả chanh có thành phần citral Chất lượng tinh dầu sả chanh xác định hàm lượng citral, mùi thơm tinh dầu sả chanh thành phần aldehyd định [34] Trong tinh dầu sả chanh, đồng