HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI[.]
HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 U VN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI rm ac Ph a DƯƠNG THỊ PHƯỢNG y, KHOA Y DƯỢC an d ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) ine BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG of Me dic HIỆU NĂNG CAO ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y ThS NGUYỄN THỊ HỒNG ANH Co py rig ht @ Sc Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2018 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U LỜI CẢM ƠN VN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận này, tơi nhận rm ac y, nhiều giúp đỡ vô quý báu thầy cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội với gia đình bạn bè Thời điểm hồn thành khóa luận lúc xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian qua Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy Ph a dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ động viên q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hồng an d Anh ln dành thời gian hướng dẫn động viên tơi q trình hồn thiện khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô ine Khoa Y Dược đặc biệt Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc ln tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận dic Tơi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt bạn Thùy, Phương, Chuyên đồng hành với suốt thời gian qua Tôi of Me xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thành viên nhóm nghiên cứu tơi chị Thủy chị Huệ ln giúp đỡ nhiệt tình bảo tơi suốt q trình thực đề tài Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2018 Sinh viên Dương Thị Phượng Co py rig ht @ Sc ho ol Lời cuối cùng, vô biết ơn gia đình ni dạy, khích lệ sát cánh, giúp tơi có thêm động lực cố gắng để có kết ngày hôm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Acetonitril BuOH Buthanol DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd Dung dịch EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performace liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sti Stipuleanosid R2 SVD Sâm vũ diệp TB Trung bình TT Thứ tự UV Ultra violete VIS Visible Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Ph a rm ac y, ACN PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Chương trình dung mơi 18 rm ac Bảng Tính thích hợp hệ thống y, Bảng Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết 19 23 24 Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 26 Bảng Kết khảo sát độ phương pháp Ph a Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 28 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an d Bảng Kết định lượng stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp 27 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.4 Sắc ký đồ chất thông số đặc trưng rm ac Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo stipuleanosid R2 y, Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp 10 Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập 11 Ph a Hình 2.1 Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 17 Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 HPLC 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng 21 dic ine an d Hình 3.1 Sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập sau phun H2SO4 10% /EtOH 21 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử 22 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 24 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U MỤC LỤC y, ĐẶT VẤN ĐỀ rm ac CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học .2 Ph a 1.1.2 Đặc điểm thực vật .2 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái an d 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý .4 1.1.6 Công dụng 1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ine 1.2.1 Cơng thức hóa học 1.2.2 Tính chất lý hóa dic 1.2.3 Tác dụng sinh học .6 1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 HPLC Me 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ho ol of 1.3.1 Nguyên tắc HPLC .6 1.3.2 Một số thông số đặc trưng 1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC 1.3.4 Tổng quan nghiên cứu định lượng thành phần hóa học Sâm vũ diệp HPLC CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 Sc 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 ht @ 2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp 10 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2 .10 2.1.3 Dung mơi, hóa chất 11 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 11 rig 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 Co py 2.3.1 Phương pháp chiết xuất hợp chất 12 2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 cao rễ SVD HPLC 13 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U 2.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp 16 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16 y, CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 17 rm ac 3.1 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP ĐƯỢC 17 3.1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 3.1.2 Phương pháp HPLC 17 Ph a 3.1.3 Phương pháp đo độ nóng chảy 20 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 BẰNG HPLC 20 an d 3.2.1 Chương trình sắc ký 20 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng .20 ine 3.3 ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP 27 3.4 BÀN LUẬN 28 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic 3.4.1 Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 HPLC 28 3.4.2 Về định lượng stipuleanosid R2 dược liệu cao sâm vũ diệp 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U ĐẶT VẤN ĐỀ VN Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), rm ac y, gọi Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất vị thuốc quý phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [3,22] Gần sâm vũ diệp hóa bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Về mặt y học, sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ thành phần số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc [3,22] Theo tài liệu công bố sâm vũ diệp cho Ph a thấy saponin thành phần hoạt chất mang lại tác dụng dược lý giá trị sử dụng dược liệu quý y học Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành an d phần saponin SVD định lượng thành phần có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng dược liệu SVD thực tiễn ine Qua trình tra cứu tài liệu, chúng tơi thấy nước ta có nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học tác dụng dược lý sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ dic SVD thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất saponin phân lập từ phân đoạn Me buthanol xác định stipuleanosid R2 thành phần saponin có thân rễ SVD [24] Tiếp nối nghiên cứu trên, thực đề tài “Định lượng ho ol of stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu thị trường tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin SVD sau rig ht @ Sc Mục tiêu đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc Đề tài phần đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên Co py liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCNTB.07C/13-18 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U CHƯƠNG - TỔNG QUAN VN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học rm ac y, SVD có tên khoa học Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Ph a Sâm vũ diệp thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng đặc biệt ưa ẩm [3,21] Thân rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng hàng năm để lại Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đơng, mọc chồi thân từ tháng đến đầu ol of Me dic ine an d tháng dương lịch Lá kép chân vịt, gồm - mọc vòng Lá chét - (ít 3) thn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - cm, gốc trịn, đầu thn thành mũi nhọn, xẻ thùy khơng đều, mép có cưa, có lơng ho Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21] Sc 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái Co py rig ht @ Sâm vũ diệp loài sâm mọc tự nhiên phát tương đối sớm nước ta Trong tự nhiên, SVD phân bố dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22] Gần sâm vũ diệp nghiên cứu bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Hiện vùng phân bố SVD bị thu hẹp dần đứng trước nguy tuyệt chủng Do SVD loài dược liệu quý cần bảo tồn gìn giữ để phát triển tương lai Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung tán rừng ẩm, gần quanh năm có sương mù Hàng năm vào cuối tháng đầu tháng 3, từ phần đầu mầm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất mọc lên vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh) Chồi sinh trưởng nhanh vòng y, tháng gần đạt chiều cao cực đại Đến tháng 4, thân mang cho cụm hoa Quả xanh quan sát vào cuối tháng – 6, đến tháng chín rụng xuống xung quanh gốc mẹ Do chín vào rm ac thời kì có lượng mưa lớn tháng – nên hạt giống thường bị trôi, ảnh hưởng đến khả tái sinh tự nhiên sâm vũ diệp Cách xác định tuổi dựa vào vết sẹo thân hình thành sau chín [3] Ph a 1.1.4 Thành phần hóa học Theo tài liệu nghiên cứu cho thấy Saponin xem thành phần an d hoạt chất loài thuộc chi Panax L Các nhà khoa học chiết tách xác định gần 300 saponin từ loài thuộc chi [31] Các kết dic ine nghiên cứu trước SVD saponin thành phần rễ sâm vũ diệp, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao với số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [11,23] Năm 1989, nhà khoa học Trung Quốc công bố phân lập 13 Me saponin khung dammaran từ Trung Quốc bao gồm số ginseng saponin đặc trưng ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re Rb3 [37] ho ol of Nghiên cứu Trần Công Luận cộng vào năm 2002 cho thấy kết định tính sơ thân rễ rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất polyacetylen saponin với acid béo, acid amin [21] Năm 2003, xác định thành phần saponin thân rễ SVD chủ yếu saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm Sc chất chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro Ngoài cịn có saponin triterpen nhóm dammaran Rb1, Rd, Re, Rg1 Rg2 [22] Co py rig ht @ Gần vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc phân lập xác định nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) thành phần rễ sâm vũ diệp thu hái núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), có chất bifinosid A-C (1-3) [33] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U VN y, rm ac Ph a an d ine Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp [33] dic 1.1.5 Tác dụng dược lý Me Tính vị, cơng năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, huyết, tán ứ [3] Một số nghiên cứu tác dụng dược lý SVD cho thấy thử động ho ol of vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp thấp, tăng cường chức sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [3] Nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Hương cộng SVD có tác dụng chống stress [25], chống trầm cảm, có tác dụng bảo Sc vệ gan kích thích tăng miễn dịch [12-15] 1.1.6 Công dụng rig ht @ Sâm vũ diệp biết đến vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [25], chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, phụ nữ sau sinh Sâm vũ diệp dùng để cầm máu, tán ứ, tiêu sưng Dùng ngồi, rễ phơi khơ, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu làm vết thương mau lành Rễ sâm vũ diệp ngâm rượu chiết dạng tinh Co py sâm dùng tốt cho sức khỏe đặc biệt chức sinh dục Ngoài nhân dân vùng trồng tận dụng thân nấu cao dùng để pha với nước rượu PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U để uống có tác dụng rễ Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22] 1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 dic ine an d Ph a rm ac y, 1.2.1 Cơng thức hóa học Me Hình 1.3 Công thức cấu tạo stipuleanosid R2 [41] Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: of (2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- ho ol heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- Sc [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2carboxylic acid [40] @ Công thức phân tử: C53H84O23 [41] ht Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [42] Co py rig 1.2.2 Tính chất lý hóa Chất bột màu trắng Độ tan: 0,57 g/L [42] Điểm nóng chảy 210 - 2150C [41] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U 1.2.3 Tác dụng sinh học VN Stipuleanosid R2 thành phần saponin dược liệu, biết đến rm ac y, thành phần có hoạt tính định tác dụng sinh học loài dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [36], Aralia elata [34] Trong số nghiên cứu giới stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc Ph a tế bào ung thư [30]; ức chế gia tăng tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt dòng tế bào K562 U937 [29]; có tác dụng chống oxy hóa [38]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch hạ lipid máu [37] 1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 HPLC Theo tài liệu chúng tơi tìm hiểu tính đến thời điểm hiên tại: Trên an d giới chưa có nghiên cứu cơng bố định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 dược liệu phương pháp HPLC mà chủ yếu dừng lại việc phân lập chất dược liệu Do việc xây dựng phương pháp định lượng ine stipuleanosid R2 cần thiết việc ứng dụng dược liệu thực tiễn 1.3.1 Nguyên tắc HPLC dic 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Me Sắc ký lỏng hiệu cao một phương pháp tách chất khỏi hỗn ol of hợp phân tích; dựa sở phân tách chất pha tĩnh chứa cột, nhờ dòng di chuyển pha động áp suất cao Trong đó: pha động chất lỏng; pha tĩnh chất rắn dạng tiểu phân chất lỏng phủ chất mang rắn, hay chất mang liên kết hố học với nhóm hữu ho Q trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay dựa phân bố theo kích cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng @ Sc Tốc độ di chuyển khác liên quan đến hệ số phân bố chúng hai pha tức liên quan đến lực tương đối chất với pha tĩnh pha động dẫn tới thứ tự rửa giải chất khỏi cột khác từ giúp phân tách chất Co py rig ht Các chất sau khỏi cột phát detector Detector giúp phát đo nồng độ chất phân tích Hiện có nhiều loại detector sử dụng như: detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode array (DAD), detector điện hoá,…Trong đề tài sử dụng detector DAD PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN U Nếu thực trình tách sắc ký hỗn hợp nhiều thành phần, ta thu kết sắc đồ gồm nhiều pic Quá trình sắc ký tốt hỗn hợp gồm y, nhiều thành phần có nhiêu pic riêng biệt tách sắc ký đồ [4,5,8,20,27,28] ine an d Ph a rm ac 1.3.2 Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15] dic Hình 1.4 Sắc ký đồ chất thông số đặc trưng [9] Me a) Thời gian lưu t0 (Thời gian chết): thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký ol of tR (Thời gian lưu): thời gian tính từ chất phân tích tiêm vào hệ thống sắc ký đến phát nồng độ cực đại ho tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0 (Thời gian lưu thông tin mặt định tính sắc ký đồ với chất Sc định tiến hành sắc ký điều kiện định) b) Hệ số dung lượng k’ t 'R t R -t t R k'= = = -1 t0 t0 t0 Hệ số dung lượng cho biết khả phân bố chất vào hai pha, tức Co py rig ht @ Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ tính theo cơng thức: tỷ lệ lượng chất tan pha tĩnh lượng chất tan pha động thời điểm cân Nếu k’ nhỏ tR nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma c) Hệ số bất đối AF (tailing factor) rm ac Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối pic sắc ký đồ: W AF y, VN U mẫu làm giảm khả tách, k’ lớn dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp thời gian lưu kéo dài Trong thực tế k’ nằm khoảng - tốt 1/20 Ph a 2a Trong đó: an d - W1/20: chiều rộng pic đo 1/20 chiều cao pic ine - a: khoảng cách từ đường vng góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước vị trí 1/20 chiều cao pic Yêu cầu phép định lượng: 0,9 < AF < dic Giá trị AF gần pic cân đối Me d) Hệ số chọn lọc of ' t R,B-t (k’B k’A) α= k B = k 'A t R,A -t Yêu cầu: α nằm khoảng 1,05 đến ol α khác nhiều khả tách rõ ràng ho e) Độ phân giải (resolution) Sc Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách chất khỏi điều kiện sắc ký Độ phân giải pic kề tính theo cơng thức: ht @ 2t R,B t R,A 1,18t R,B t R,A N α k'B RS ' α k B WB WA W1/2B W1/2A - RS = 0,75: Hai pic chưa tách Co py rig - RS = 1,5: độ phân giải đạt được, pic tách khỏi rõ ràng, xen phủ 0,3% - Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn xen phủ 4% PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U 1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC y, VN a) u cầu chung Các quy trình phân tích HPLC cần phải thẩm định quy trình chưa công bố tiêu chuẩn Dược điển nước Nội dung thẩm định phương pháp hướng dẫn tài liệu phân tích quy định rm ac Dược điển b) Nội dung thẩm định Thông số đặc trưng kỹ thuật HPLC cần đánh giá thẩm định phương Ph a pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại độ an d 1.3.4 Tổng quan nghiên cứu định lượng thành phần hóa học Sâm vũ diệp HPLC Năm 2009, nhóm nghiên cứu Trần Công Luận cộng định lượng ine hàm lượng saponin tổng số thân rễ rễ củ Sâm vũ diệp theo phương pháp trọng lượng Namba 5,86% [17] dic Năm 2017, Nhóm nghiên cứu Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội: Nguyễn Thị Huệ tiến hành khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký xây dựng ho ol of Me phương pháp định lượng acid oleanolic saponin toàn phần dược liệu sâm vũ diệp phương pháp HPLC - DAD Kết định lượng cho thấy hàm lượng acid oleanolic cao sâm vũ diệp rễ sâm vũ diệp là: 0,034% 0,0066% tương đương với 340 μg/g 66 μg/g; hàm lượng saponin cao sâm vũ diệp dược liệu SVD 0,364% 0,0698% tương đương 3640 µg/g 698 μg/g [11] rig ht @ Sc Nhận xét: Đây kết bước đầu định lượng thành phần hóa học SVD xác định hàm lượng saponin tổng số Tính thời điểm tại, chưa có nhiều kết cơng bố phân tích định lượng thành phần saponin cụ thể có sâm vũ diệp Trong nghiên cứu chúng tơi phân tích định lượng thành phần saponin SVD phương pháp HPLC, phương pháp Dược điển nước công nhận đạt yêu cầu tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng phần lớn chuyên luận dược liệu Phương pháp HPLC với ưu điểm độ xác cao đáp ứng yêu Co py cầu phân tích thành phần riêng lẻ có mẫu, đặc biệt mẫu phức tạp cao chiết từ dược liệu PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma VN 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU U CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp rm ac y, Mẫu nghiên cứu đề tài thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng Sa Pa, Lào Cai thu hái vào ngày 15/7/2016 Mẫu nghiên Ph a cứu giám định tên khoa học ThS Nguyễn Quỳnh Nga CN Phan Văn Trường, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu tiêu (PB-150716) lưu giữ Phòng tiêu Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu Mô tả mẫu nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm Thể chất cứng chắc, giòn, an d dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt Mùi thơm nhẹ, vị đắng, Sc ho ol of Me dic làm nguyên liệu nghiên cứu ine Cách xử lí mẫu: thân rễ SVD thu hái Sa Pa rửa sạch, cắt miếng mỏng, sấy khô 500C, bảo quản túi nilong kín, để nơi khơ ráo, thống mát @ Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2 rig ht Trong đề sử dụng chất stipuleanosid R2 phân lập từ dược liệu sâm vũ diệp nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu với [24] Stipuleanosid R2 phân lập tiến hành đánh giá độ tinh khiết đạt Co py tiêu chuẩn để sử dụng làm chất chuẩn phương pháp định lượng nồng độ chất có SVD HPLC 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U VN y, rm ac Ph a Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập an d 2.1.3 Dung mơi, hóa chất Dung mơi, hóa chất: Các hóa chất dung mơi dùng nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) loại tinh khiết dùng HPLC ine - Dung môi dùng cho chiết xuất phân lập: Ethanol 70%, methanol dic (MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH) of 2.1.4 Máy móc, dụng cụ Me - Dung mơi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV ho ol Trong trình nghiên cứu đề tài, sử dụng thiết bị, dụng cụ đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 GLP Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội: Sc - Máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD phận bơm mẫu tự động @ - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức) Co py rig ht - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ) - Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60 - Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml - Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc) - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ) 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma U - Bếp điện, bếp đun cách thủy VN - Đèn tử ngoại - Cột sắc ký loại kích cỡ y, - Màng lọc 0,45 µm rm ac - Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet xác Ph a - Tủ hút 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU an d Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 thân rễ SVD HPLC với chất chuẩn stipuleanosid R2 tinh khiết phân lập từ SVD ine Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 thân rễ SVD thu hái Sa Pa, Lào Cai phương pháp HPLC xây dựng thẩm định dic 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp chiết xuất hợp chất Me Các nghiên cứu thành phần hoạt chất sâm vũ diệp cho thấy sâm vũ diệp có chứa thành phần saponin, tham khảo tài liệu chiết xuất of saponin sapogenin dược liệu để tìm phương pháp chiết xuất phù hợp với mẫu nghiên cứu thân rễ SVD [23] ho ol - Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70% - Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng Sc Quy trình chiết xuất thực sau: @ Thân rễ SVD sau rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ chiết hồi lưu dung môi EtOH 70% nhiệt độ 700C, chiết lần rig ht Tiến hành lọc loại bã dược liệu, dịch chiết ethanol thu lọc qua giấy lọc, gom lại cất loại dung môi áp suất giảm thu cao tổng ethanol py Cao ethanol đem phân tán nước lắc với dung mơi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate n-butanol lặp lại lần theo tỷ lệ Co 1:1 Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không áp 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma ... VN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI rm ac Ph a DƯƠNG THỊ PHƯỢNG y, KHOA Y DƯỢC an d ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM. ) ine BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG of... saponin có thân rễ SVD [24] Tiếp nối nghiên cứu trên, thực đề tài ? ?Định lượng ho ol of stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem. ) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao? ?? Kết đề... dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc Đề tài phần đề tài