LUẬN văn THẠC sĩ định lượng stipuleanosid r2 trong thân rễ sâm vũ diệp ( panax bipinnatifidus seem ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP

SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi

Sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2]

Sâm vũ diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm [3,21] Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại

Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng Lá chét 5 - 7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có răng cưa, có lông

Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21]

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta Trong tự nhiên, SVD phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22] Gần đây sâm vũ diệp đã được nghiên cứu và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai Hiện nay vùng phân bố của SVD đang bị thu hẹp dần và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Do vậy SVD là loài dược liệu quý hiếm cần được bảo tồn và gìn giữ để phát triển trong tương lai

Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh) Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp Cách xác định tuổi của cây dựa vào những vết sẹo thân được hình thành sau khi quả chín [3]

Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định được gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31] Các kết quả nghiên cứu trước đây của SVD cũng chỉ ra rằng saponin là thành phần chính của lá và rễ cây sâm vũ diệp, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [11,23]

Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [37]

Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 cho thấy kết quả định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [21] Năm 2003, đã xác định thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2[22]

Gần đây vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [33]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 1.2 Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [33]

Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3]

Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [3] Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD có tác dụng chống stress [25], chống trầm cảm, có tác dụng bảo vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [12-15]

Sâm vũ diệp được biết đến như một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [25], chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh Sâm vũ diệp còn được dùng để cầm máu, tán ứ, tiêu sưng Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thương mau lành Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt cho sức khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU để uống cũng có tác dụng như rễ Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22].

TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41]

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:

(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [40]

Chất bột màu trắng Độ tan: 0,57 g/L [42] Điểm nóng chảy 210 - 215 0 C [41]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Stipuleanosid R2 là thành phần saponin trong dược liệu, được biết đến như là thành phần có hoạt tính và quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [36], Aralia elata [34] Trong một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc tế bào ung thư [30]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và U937 [29]; có tác dụng chống oxy hóa [38]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và hạ lipid máu [37]

1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC

Theo như tài liệu chúng tôi tìm hiểu được tính đến thời điểm hiên tại: Trên thế giới vẫn chưa có các nghiên cứu công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu bằng phương pháp HPLC mà chủ yếu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập chất này trong các dược liệu Do đó việc xây dựng được phương pháp định lượng stipuleanosid R2 là rất cần thiết trong việc ứng dụng dược liệu trong thực tiễn.

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một một phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích; dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao Trong đó: pha động là chất lỏng; pha tĩnh là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay dựa trên phân bố theo kích cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng

Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động dẫn tới thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ khác nhau và từ đó giúp phân tách được các chất

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector Detector sẽ giúp phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng như: detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode array (DAD), detector điện hoá,…Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector DAD

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Nếu thực hiện quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ thu được kết quả là một sắc đồ gồm nhiều pic Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ [4,5,8,20,27,28]

1.3.2 Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15]

Hình 1.4 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng [9] a) Thời gian lưu t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định) b) Hệ số dung lượng k’

Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất c) Hệ số bất đối AF (tailing factor)

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ:

- W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

- a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2

Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối d) Hệ số chọn lọc

Yêu cầu: α nằm trong khoảng 1,05 đến 2 α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng e) Độ phân giải (resolution) Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

- RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3%

- Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%

- RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC a) Yêu cầu chung

Các quy trình phân tích HPLC cần phải thẩm định là các quy trình chưa được công bố trong tiêu chuẩn Dược điển các nước Nội dung về thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được quy định trong các Dược điển b) Nội dung thẩm định

Thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC cần đánh giá khi thẩm định phương pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng

1.3.4 Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp bằng HPLC

Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã định lượng hàm lượng saponin tổng số của thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp theo phương pháp trọng lượng của Namba là 5,86% [17]

Năm 2017, Nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội:

Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm vũ diệp bằng phương pháp HPLC - DAD Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp và rễ sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034% và 0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao sâm vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 àg/g

Nhận xét: Đây là những kết quả bước đầu về định lượng thành phần hóa học của SVD và xác định hàm lượng saponin tổng số Tính thời điểm hiện tại, chưa có nhiều kết quả công bố phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể có trong sâm vũ diệp Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích định lượng thành phần saponin trong SVD bằng phương pháp HPLC, hiện đang là phương pháp được Dược điển các nước công nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu hiện nay Phương pháp HPLC với ưu điểm là độ chính xác cao sẽ đáp ứng được yêu cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ có trong mẫu, đặc biệt là đối với các mẫu phức tạp như cao chiết từ dược liệu

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp

Mẫu nghiên cứu trong đề tài là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được trồng ở Sa Pa, Lào Cai và thu hái vào ngày 15/7/2016 Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga và CN Phan Văn Trường, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (PB-150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu

Mô tả mẫu nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và những vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt

Cách xử lí mẫu: thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa được rửa sạch, cắt miếng mỏng, sấy khô ở 50 0 C, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu

Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào

Cai vào ngày 15/7/2016 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2

Trong đề này chúng tôi sử dụng chất stipuleanosid R2 được phân lập từ dược liệu sâm vũ diệp trong một nghiên cứu trước của cùng nhóm nghiên cứu với chúng tôi

[24] Stipuleanosid R2 phân lập được sẽ được tiến hành đánh giá độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn để sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ chất này có trong SVD bằng HPLC

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 2.1.3 Dung môi, hóa chất

Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC

- Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol (MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH)

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ)

- Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Cột sắc ký các loại kích cỡ

- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân lập từ SVD

2 Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa, Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm vũ diệp có chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ SVD [23]

- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%

- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng

Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:

1 Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 70 0 C, chiết 3 lần

2 Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol

3 Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ 1:1 Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU suất giảm để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn

4 Cao butanol thu được trong quá trình chiết xuất sẽ được sử dụng để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp

2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC a) Lựa chọn điều kiện sắc ký

Tham khảo một số tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát về bước sóng, tỷ lệ dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng, thể tích bơm mẫu nhằm mục đích lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu nhất để đảm bảo điều kiện phân tích stipuleanosid R2 có trong thân rễ SVD đạt kết quả chính xác nhất b) Thẩm định stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD đủ tiêu chuẩn làm chất chuẩn trong quy trình định lượng

* Yêu cầu của chất sử dụng làm chất chuẩn [35]:

- Nguyên liệu được sử dụng thiết lập chất chuẩn phải có độ tinh khiết cao (đối với hợp chất hóa dược > 95%), được lựa chọn từ các lô nguyên liệu sản xuất thuốc có chất lượng cao, có tính đồng nhất và được cung cấp từ các nguồn đáng tin cậy (các nhà sản xuất gốc)

- Việc đánh giá mức độ phù hợp của một nguyên liệu dự kiến thiết lập chuẩn phải được tiến hành rất cẩn thận, phải cân nhắc tất cả số liệu thu được từ các phép thử và nên áp dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau để đánh giá so sánh

* Phương pháp thẩm định: Độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được được kiểm tra dựa vào ba phương pháp sau:

1 Sắc ký lớp mỏng: Sti phân lập được sẽ tiến hành sắc ký trên silicagel RP-

18 F254S (Merk) Phát hiện chất bằng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol 96 %, phun đều lên bản mỏng, sấy khô ở 120 0 C rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi xuất hiện màu Quan sát vết xuất hiện ở ánh sáng thường

Yêu cầu: Sau khi phun thuốc thử trên sắc ký đồ phải xuất hiện một pic duy nhất màu hồng tím của stipuleanosid R2

2 HPLC Phương pháp đánh giá độ tinh khiết thông qua tổng tạp dựa theo phương pháp chuẩn hóa diện tích khi tiến hành định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Tiến hành định lượng 01 dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần bằng HPLC Dựa vào kết quả sắc ký đồ tính lượng tạp bằng phương pháp phần trăm diện tích pic

Yêu cầu: độ tinh khiết > 95%

3 Đo độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD

Yêu cầu: stipuleanosid R2 phân lập được phải có nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng 210 - 215 0 C [41] c) Thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD [4,5,40]

* Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Phương pháp HPLC được coi là có tính đặc hiệu đối với chất cần phân tích nếu:

- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

* Kiểm tra tính thích hợp hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích

* Độ tuyến tính Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích pic hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Độ tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R 2 Trong đó: y là đáp ứng của pic (diện tích pic hay chiều cao) và x là nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ

- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp

- Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau

* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính

LOQ là lượng thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử để có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp

Tiến hành: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N) Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử

LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3/1)

LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N /1)

* Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 với một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả

- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 xRSD S  

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU