KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (KIỂM NGHIỆM và độc CHẤT) định lượng stipuleanosid r2 trong thân rễ sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) bằng phương pháp HPLC

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: Người hướng dẫn: Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận này, tơi nhận nhiều giúp đỡ vô quý báu thầy cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội với gia đình bạn bè Thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hồng Anh ln dành thời gian hướng dẫn động viên tơi q trình hồn thiện khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô Khoa Y Dược đặc biệt Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện cho hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt bạn Thùy, Phương, Chuyên đồng hành với suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thành viên nhóm nghiên cứu chị Thủy chị Huệ ln giúp đỡ nhiệt tình bảo tơi suốt q trình thực đề tài Lời cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình ni dạy, khích lệ sát cánh, giúp tơi có thêm động lực cố gắng để có kết ngày hôm Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2018 Sinh viên DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BuOH Buthanol DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd Dung dịch EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performace liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sti Stipuleanosid SVD R2 TB Trung bình TT Thứ tự UV Ultra violete VIS Visible DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Chương trình dung mơi 18 Bảng Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết 19 Bảng Tính thích hợp hệ thống 23 Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 24 Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 26 Bảng Kết khảo sát độ phương pháp 27 Bảng Kết định lượng stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp 28 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo stipuleanosid R2 Hình 1.4 Sắc ký đồ chất thông số đặc trưng Hình 2.1 Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 10 Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập sau phun H2SO4 10% /EtOH 17 Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 HPLC 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng 21 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 21 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử 22 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 24 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) .6 1.3.1 Nguyên tắc HPLC CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .10 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 cao rễ SVD HPLC 13 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 17 3.1.3 Phương pháp đo độ nóng chảy 20 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 BẰNG HPLC 20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), gọi Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất vị thuốc quý phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [3,22] Gần sâm vũ diệp hóa bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Về mặt y học, sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ thành phần số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc [3,22] Theo tài liệu công bố sâm vũ diệp cho thấy saponin thành phần hoạt chất mang lại tác dụng dược lý giá trị sử dụng dược liệu quý y học Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành phần saponin SVD định lượng thành phần có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng dược liệu SVD thực tiễn Qua trình tra cứu tài liệu, thấy nước ta có nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học tác dụng dược lý sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ SVD thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất saponin phân lập từ phân đoạn buthanol xác định stipuleanosid R2 thành phần saponin có thân rễ SVD [24] Tiếp nối nghiên cứu trên, thực đề tài “Định lượng stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu thị trường tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin SVD sau Mục tiêu đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc Đề tài phần đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCNTB.07C/13-18 [35] M Schwarz, B Klier, and H Sievers (2009), "Herbal reference standards", "Planta Med", 75(7), pp 689-703 [36] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", "Yao Xue Xue Bao", 32(9), pp 685-90 [37] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "[Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng]", "Yao Xue Xue Bao", 24(8), pp 593-599 [38] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type diabetic rats", "J Ethnopharmacol", 152(3), pp 553-560 [39] M Xi, C Hai, H Tang, A Wen, H Chen, R Liu, et al (2010), "Antioxidant and antiglycation properties of triterpenoid saponins from Aralia taibaiensis traditionally used for treating diabetes mellitus", "Redox Rep", 15(1), pp 2028 [40] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva C Trang web [41] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top [42] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855 PHỤ LỤC Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Pharmac y, Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 15,625 µg/ml Medici ne of Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 37,5 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 75 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 150 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 200 µg/ml School @ Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 300 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 400 µg/ml Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Kiểm tra tính thích hợp hệ thống Pharma cy, and Medicine VN Pharma cy, and Medici ne of School VN Pharma cy, and Medici ne of VN Pharmacy , VN Pharma cy, and Medici ne of School VN Pharma cy, and Medici ne of PHỤ LỤC 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) PHỤ LỤC 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp VN and of @ VN and ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM. ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC... phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 dược liệu sâm vũ diệp 3.3 ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP Kết thẩm định phương pháp HPLC. .. 2.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp Áp dụng phương pháp HPLC thẩm định để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 có cao SVD dược liệu SVD 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ