KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (KIỂM NGHIỆM và độc CHẤT) xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: Người hướng dẫn: Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hồn thành luận văn lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian qua Đầu tiên tơi xin gửi lời cám ơn đến tồn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện cho tơi làm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo trường dìu dắt, giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập suốt năm qua Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tri ân tới GVHD, TS Nguyễn Hữu Tùng, người dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2014.Y đặc biệt bạn Hà, Nhung, Thảo, Vân đồng hành suốt thời gian qua Đồng thời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thành viên nhóm nghiên cứu tơi chị Đặng Thị Ngần, Nguyễn Thị Thu Thủy người nhiệt tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCNTB.07C/13-18, 2015- 2017 (Chương trình Tây Bắc) PGS.TS Dương Thị Ly Hương chủ nhiệm tài trợ kinh phí để tơi thực nội dung nghiên cứu Cuối cùng, vô biết ơn gia đình ni dạy, khích lệ sát cánh, giúp tơi có thêm động lực cố gắng để có kết ngày hơm Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT SVD Sâm vũ diệp HPLC Sắc ký lỏng hiệu chromatography) UV Ultra violete FLD Đầu dò huỳnh quang DAD Detector mảng điốt (Detector Diod Array) Rf Hệ số di chuyển RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) R2 Hệ số tương quan tuyến tính LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) SKLM Sắc ký lớp mỏng cao (High performace liquid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất saponin phân lập từ Sâm vũ diệp Bảng 3.1 Kết xác định độ ẩm mẫu Sâm vũ diệp 22 Bảng 3.2 Kết xác định tro toàn phần mẫu Sâm vũ diệp 22 Bảng 3.3 Kết xác định độ tro không tan acid mẫu 23 Sâm vũ diệp Bảng 3.4 Chương trình dung mơi 25 Bảng 3.5 Tính thích hợp hệ thống 26 Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 29 Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi 30 Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu Sâm vũ diệp 31 ANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh Sâm vũ diệp Hình 1.2 10 hợp chất saponin tách từ rễ Sâm vũ diệp Hình 2.1 Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái 11 Sa Pa, Lào Cai Hình 3.1 Vi phẫu thân rễ Sâm vũ diệp 21 Hình 3.2 Bột thân rễ Sâm vũ diệp 21 Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử 27 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 29 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC stipuleanosid R2 (A) dược liệu 31 Sâm vũ diệp (B) MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái .4 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý .8 1.1.6 Công dụng 1.2 TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 11 2.1.1 Nguyên liệu 11 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 12 2.1.3 Máy móc, thiết bị 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1 Mô tả 13 2.2.2 Vi phẫu 13 2.2.3 Soi bột 13 2.2.4 Độ ẩm 13 2.2.5 Tro toàn phần .13 2.2.6 Tro không tan acid 14 2.2.7 Tạp chất 14 2.2.8 Định tính .15 2.2.9 Định lượng 16 3.1 Mô tả 20 3.2 Vi phẫu 20 3.3 Soi bột 21 3.4 Độ ẩm .21 3.5 Tro toàn phần 22 3.6 Tro không tan acid 22 3.7 Định tính 23 3.8.Định lượng 24 3.9 Bàn luận 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm dược liệu quý có giá trị cao sử dụng nhiều thuốc y học cổ truyền Hiện nay, nhiều loài chi Sâm (Panax), đặc biệt loài nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen ex C.Y Wu et K.M Feng; syn.: P pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.), sâm Siberia (AcanthoPanax senticosus (Rupr et Maxim.) Harms; syn.: Eleutherococcus senticosus Maxim.) , thuốc quý, ưa chuộng, tiếng có giá trị cao Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thuốc quý sử dụng thuốc truyền thống có tiềm để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe lồi khác chi [2,14] Ngày nay, xu hướng sử dụng sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày tăng kèm theo làm hàng giả, hàng nhái, hàng chất lượng tăng theo Điều gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người gây lòng tin người sử dụng thuốc sảm phẩm từ dược liệu Để sử dụng dược liệu làm nguyên liệu làm thuốc địi hỏi cần phải xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, đồng thời xây dựng phương pháp thử để đánh giá tiêu chuẩn Do đó, chúng tơi thực đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)” Đề tài phần đề tài cấp “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội Mục tiêu đề tài: xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Sâm vũ diệp Để đạt mục tiêu trên, đề tài thực với nội dung sau: Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi STT Lượng có sẵn (µg) 711,754 711,754 711,754 711,754 711,754 711,754 Lượng thêm vào (µg) Diện tích pic (mAU*s) 75 2094,160 75 2093,725 100 2167,998 100 2175,860 200 2416,990 200 2451,260 Trung bình RSD (%) Lượng tìm lại (µg) Độ thu hồi (%) 72,358 72,191 100,668 103,683 196,137 209,277 96,48 103,68 100,67 96,25 98,07 104,64 99,96 3,31 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn phân tích HPLC đến tín hiệu chất định phân tích sắc ký đồ có tỉ lệ S/N (tín hiệu/ nhiễu) đạt khoảng từ 2-3, S chiều cao pic chất phân tích, N chiều cao tín hiệu nhiễu lớn Nồng độ xác định giới hạn phát (LOD) phương pháp ứng với chất định phân tích Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng phương pháp xác định dựa giới hạn phát LOQ = 3,3 x LOD Kết thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát LOD = 1,953 µg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 µg/ml Kết cho thấy phương pháp xây dựng có giới hạn phát giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 dược liệu sâm vũ diệp c) Kết định lượng Ta có sắc ký đồ HPLC stipuleanosid R2 dược liệu SVD (Hình 9) Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC stipuleanosid R2 (A) dược liệu Sâm vũ diệp (B) Kết định lượng thành phần stipuleanosid R2 mẫu SVD trình bày bảng 9: Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu Sâm vũ diệp TT Tên mẫu Hàm lượng % stipuleanosid R2 tính theo khối lượng khô tuyệt đối Mẫu 0,338 Mẫu 0,334 Mẫu 0,332 Trung bình 0,335 % ± 0,003 Nhận xét: Ta thấy hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu thử nằm khoảng từ 0,332 % đến 0,338 % trung bình 0,335 % ± 0,003 Giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 dược liệu SVD qui định tiêu chuẩn không thấp 0,3 % 3.9 Bàn luận 3.9.1 Về mô tả dược liệu Nghiên cứu thực mẫu dược liệu giám định tên khoa học thu hái Sa Pa – Lào Cai năm 2016 Kết tốt thực quan sát nhiều mẫu thu hái vùng khác 3.9.2 Về khảo sát tiêu theo quy định Dược điển Việt Nam Khi xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nghiên cứu đánh giá tiêu độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần, tỷ lệ tro không tan acid số đặc trưng giúp đánh giá chất lượng dược liệu SVD trước đưa vào sử dụng Do thời gian kinh phí khơng cho phép nên số tiêu chưa thực tạp chất lẫn dược liệu, tỷ lệ vụn nát dược liệu, hàm lượng kim loại nặng, hàm lượng chất chiết đượctrong dược liệu dung môi (nước, ethanol,…) 3.9.3 Về định tính Định tính chúng tơi sử dụng phương pháp SKLM: Khi phun thuốc thử H2SO4 10% ethanol hơ nóng mỏng thấy có xuất vết chất khoảng Rf màu với cho thấy có mặt chất stipuleanosid R2 Nghiên cứu đề xuất hệ dung môi phù hợp để định tính thành phần stipuleanosid R2 dược liệu SVD phương pháp SKLM 3.9.4 Về định lượng Chúng xác định hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu dược liệu SVD thu hái Sa Pa phương pháp HPLC Kết thu sau: Hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu thử nằm khoảng từ 0,332 % đến 0,338 % Do đó, giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 dược liệu SVD qui định tiêu chuẩn không thấp 0,3 % KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài thực mục tiêu nghiên cứu đề sau: - Đã khảo sát tiêu chí dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ quy định DĐVN V, gồm: mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro tồn phần, tro khơng tan acid, định tính, định lượng - Khảo sát, xây dựng quy trình định lượng saponin phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2 - Đây nghiên cứu bước đầu góp phần bước hoàn thiện chuyên luận tiêu chuẩn sở cho dược liệu SVD DĐVN tương lai Trên sở kết đạt được, nhóm nghiên cứu đề xuất dự thảo tiêu chuẩn sở cho dược liệu SVD (phụ lục II).Trong đó, độ ẩm: khơng q 10,0%; tro tồn phần: khơng q 8,0%; tro khơng tan acid: không 2,0%; định lượng: hàm lượng stipuleanosid R2 không thấp 0,3 % KIẾN NGHỊ Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất dược liệu, tỉ lệ vụn nát xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu SVD Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu SVD để bổ sung chuyên luận dược liệu SVD Dược điển Việt Nam Đề xuất thầm định tiêu chuẩn sở dược liệu SVD TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cộng (2003), Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 711 – 714 [2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr 285286 [3] Bộ Khoa học Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, tr 85 – 87 [4] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học [5] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích Phụ lục - Thơng tư 22/2009 TT-BYT Quy định đăng ký thuốc [6] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113, 216-250 [7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 326 – 338 [8] Phạm Xuân Đà (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 19-58 [9] Nguyễn Thị Thu Hương và cộng (2001), Cơng trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch sâm Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 464 - 466 [10] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích Đồn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam đinh lăng trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200 [11] Nguyễn Thị Thu Hương Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress chống trầm cảm sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv Araliaceae) hoạt chất majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr 25-27 [12] Trần Cơng Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học số tác dụng dược lý hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr 165 [13] Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng dược lý hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr 17-23 [14] Lã Đình Mỡi cộng (2013), "Họ nhân sâm(Araliaceae Juss.)nguồn hoạt chất sinh học đa dạng đầy triển vọng Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5, tr 1152-1158 [15] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76 [16] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái sâm vũ diệp Tam thất hoang Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr 177-180 [17] Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Huệ, Đặng Thị Thùy, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Dương Thị Phượng, Phạm Thị Tuyết Nhung, Hà Vân Oanh, Dương Thị Ly Hương, Nguyễn Hữu Tùng (2018), “Nghiên cứu thành phần saponin thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Dược liệu, 2(23), tr 82-88 [18] Trần Mỹ Tiên Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr 202-206 [19] Trần Mỹ Tiên Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu số tác dụng dược lý sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu, 10(1), tr 27-32 Tiếng Anh [20] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp [21] Gurung B, Bhardwaj PK et al (2018), "Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokopayensis and Panax bipinnatifidus", Nat Prod Res, 33(2), pp 234-238 [22] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420 [23] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599 [24] Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636 [25] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva [26] Zhang Y, Shi C et al (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1039, pp 79-87 PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP Sâm vũ diệp (thân rễ) Panax bipinnatifidus Seem Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Ngật đáp thất Thân rễ phơi sấy khô Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), ho ̣ Nhân sâm (Araliaceae) Mô tả Thân rễ thường nhiều đốt, cong ngoằn ngoè o, dà i 7-12 cm, đườ ng kính 0,5-1,5 cm ngoà i mà u nâu, có nhữ ng vết nhăn doc, mả nh; nhữ ng vết vân Măṭ ngang nổ i rõ chia thân rễ thà nh nhiều đốt, có nhiều thân khí sinh haǹ g seọ năm tà n để laị Thể chất cứ ng chắc, giò n, dễ bẻ , bẻ lở m chở m, mà u luị măṭ trưng, vi ̣đắng, ngot vàng nâu nhaṭ Mù i thơm nhe ̣ đăc̣ Vi phẫu Lớ p bần gồm - hà ng tế bà o hinh ̀ chữ nhâṭ , thành cong, mà u luc, lớ p ngoà i bi ̣ bong rá ch Mô mềm vỏ gồm nhữ ng tế bà o hiǹ h nhiều caṇ h dà y lên ở gó c, chứ a nhiều ống tiết và tinh thể calci oxalat hình cầu gai Cá c bó libe-gỡ xếp thành bó riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm, phân cá ch bở i tia ruột rôṇ g Gỗ gồm nhữ ng tế bà o thành dà y, mô mềm gỗ it́ đăṭ hó a gỗ Tầng phát sinh libe-gỗ nằm libe cấp hai gỗ cấp hai, gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật có màng mỏng, xếp thành dãy đặn Tia ruột rôṇ g gồm nhiều tế bà o xếp theo hướ ng xuyên tâm bở i cá c tế bà o cấu taọ Ruôṭ để hở nhữ ng khoả ng gian bà o, ống tiết ở vi ̣ trí ứ ng vớ i cá c bó libe-gỗ ở cả phiá phiá ngoà i lâñ Bột Màu vàng nâu Soi kinh ́ hiển vi thấy: những haṭ tinh hình bầu dục, bơṭ là kić h thướ c khơng đều, rốn vac̣ h Mả nh bần vớ i nhữ ng tế bà o hiǹ h môṭ haṭ nhiều caṇ h, thành dà y mà u và ng nâu Mả nh mô mềm gồm nhữ ng tế bà o mà ng mỏ ng, mà u trắng Mả nh mach vach, mach maṇ g Rả i rá c có chất tiết mà u nâu đen Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4) Bả n mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254S Dung môi khai triển: CH3OH-H2O (3:1, v/v) Dung dic̣ h thử : Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10 ml methanol: nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu (1): Lấy 1g bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10 ml methanol: nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan lượng stipuleanosid R2 chuẩn methanol để dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml Cá ch tiến hà nh: chấm riêng lên bả n mỏ ng µl cho mỡi dung dic̣ h biêṭ thử và dung dịch đối chiếu Sau khai triể n xong, lấy bả n mỏ ng để khô ở đô ̣ phò ng, phun dung dich acid sulfuric 10% ethanol (TT) nhiêṭ Sấy bả n mỏ ng ở 105°C vết Các vết sắc ký đồ dung dịch thử phải có màu sắc giá trị Rf giống vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Định lượng Cân xác khoảng 1,0 g bột dược liệu cho vào bình tam giác dung tích 100 ml, thêm xác 50,0 ml hỗn hợp methanol – nước tỷ lệ (70: 30), cân, siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung hỗn hợp dung môi lượng mất, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 m dung dịch để tiêm sắc ký Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 methanol có điểm nồng độ xác gồm: 18,75 g/ml, 37,5 g/ml, 75 g/ml, 150 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml 400 g/ml Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm) Detector UV: bước sóng 203 nm Tốc độ dịng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh cần thiết Thể tích tiêm: 20 µL Pha động: Acetonitril (A) 0,5% acid acetic/ H2O (B) Cách tiến hành: Kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn có nồng độ xác khoảng 75 µg/ml chuẩn bị trên, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic đáp ứng từ lần tiêm lặp lại không lớn 2,0 % Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ Thiết lập đường chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ dung dịch (µg/ml) diện tích pic tương ứng theo phương trình y = ax + b Tiêm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ Tính nồng độ stipuleanosid R2 dung dịch thử (µg/ml) dựa phương trình đường chuẩn xây dựng Hàm lượng stipuleanosid R2 có dược liệu SVD (%) tính theo dược liệu khơ kiệt tính cơng thức: C × 50 × 100 X (%) = mc × (100 – a) × 1000 Trong đó: C: nồng độ stipuleanosid R2 dung dịch mẫu thử (g/ml) mc: lượng cân mẫu thử (mg) a: Độ ẩm mẫu thử (%) Hàm lượng saponin tổng khơng thấp 0,3% tính theo dược liệu khô kiệt Độ ẩm Không 10,0% ( phụ lục 9.6) Tro tồn phần Khơng q 8,0% (phụ lục 9.8) Tro không tan acid Không 2,0% (phụ lục 9.7) Chế biến Thu hoạch thân rễ vào tháng - 4, lấy rửa sạch, phơi khô sấy nhiệt độ 50ºC Bảo quản Để nơi khơ thống, tránh ẩm mốc Tính vị, quy kinh Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính ấm Cơng năng, chủ trị Có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, huyết, tán ứ Chủ trị: dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh lực, chống stress… ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: Người hướng dẫn: Hà... loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội Mục tiêu đề tài: xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Sâm vũ diệp. .. Bàn luận 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm dược