KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (KIỂM NGHIỆM và độc CHẤT) định lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh (eurycoma longifolia) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: NgƯời hƯớng dẫn: Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp đƯợc thực mơn Hóa dƯợc Kiểm nghiệm thuốc thuộc Khoa Y DƯợc, Đại học Quốc gia Hà Nội Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Y DƯợc, Đại học Quốc gia Hà Nội dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học vừa qua Em xin đƯợc gửi lời cảm ơn tới thầy mơn Hóa dƯợc Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin phép bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Hữu Tùng nhiệt tình, tận tâm hƯớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận Em xin cảm ơn dƯợc sỹ Nguyễn Thị Huệ (QH.2012.Y) bạn nhóm nghiên cứu Thùy, PhƯợng, Chuyên tập thể lớp DƯợc học khóa (QH.2013.Y) ln sát cánh, động viên, cổ vũ tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận cách tốt Qua đây, em cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt q trình hồn thành khóa luận Mặc dù nỗ lực, cố gắng để hồn thành khóa luận, song kiến thức kinh nghiệm cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đƯợc cảm thơng góp ý tận tình thầy để khóa luận đƯợc hồn thiện Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2018 Sinh viên DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril DAD Diode array detector Detector mảng điốt HPLC High performace liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IL Interleukin Interleukin LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƯợng LPS Lipopolysaccharide MeOH Methanol Methanol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƯơng đối TN Thí nghiệm UV Ultra violete VIS Visible DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ảng 1.1 Thành phần hóa học rễ bá bệnh ảng 3.1 hƯơng trình chạy dung mơi pha động phân tích dịch chiết rễ bá bệnh .20 ảng 3.2 Tính thích hợp hệ thống 23 ảng 3.3 Kết khảo sát khoảng tuyến tính eurycomanone .24 ảng 3.4 Kết độ lặp lại phƯơng pháp 25 ảng 3.5 Kết độ phƯơng pháp 26 ảng 3.6 Kết định lƯợng eurycomanone rễ bá bệnh 27 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) Hình 1.2 Cấu trúc chung nhóm quasinoid Hình 1.3 Cấu trúc hóa học eurycomanone Hình 1.4 Mối quan hệ đại lƯợng thời gian HPLC 13 Hình 2.1 Mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) 17 Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch eurycomanone chuẩn 21 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone (đánh giá độ đặc hiệu) 22 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ diện tích pic nồng độ eurycomanone 24 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ HƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố sinh thái 1.1.3 Thu hái, chế biến 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dƯợc lý 1.1.6 Tính vị cơng 1.1.7 Một số thuốc dân gian từ bá bệnh 1.2 Tổng quan nhóm quassinoid 1.2.1 Khái quát chung quassinoid 1.2.2 Cấu trúc chung phân loại 1.3 Tổng quan eurycomanone 1.3.1 Cơng thức hóa học 1.3.2 Tính chất lí hóa 10 1.3.3 Tác dụng sinh học Eurycomanone 10 1.3.4 Một số nghiên cứu định lƯợng eurycomanone HPLC .10 1.4 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao HPL 13 1.4.1 Nguyên tắc HPLC 13 1.4.2 Một số thông số đặc trƯng 13 1.4.3 Thẩm định phƯơng pháp HPL 15 HƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU .17 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 17 2.1.3 Máy móc, dụng cụ 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 17 2.2.1 PhƯơng pháp chiết xuất eurycomanone từ rễ bá bệnh 18 2.2.2 PhƯơng pháp phân tích HPLC 18 2.2.3 PhƯơng pháp xử lý số liệu 19 HƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 KẾT QUẢ 20 3.1.1 trình chiết rễ bá bệnh 20 3.1.2 dựng quy trình định lƯợng 20 3.2 Thảo luận 28 3.2.1 Đối tƯợng nghiên cứu 28 3.2.2 dựng phƯơng pháp phân tích eurycomanone HPLC 28 3.2.3 ịnh lƯợng eurycomanone dƯợc liệu bá bệnh 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 KẾT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đất nƯớc nhiệt đới gió mùa với nguồn thuốc vơ phong phú Từ lâu nhân dân ta sử dụng nhiều cỏ tự nhiên để làm thuốc Ngày nay, với phát triển nhƯ vũ bão khoa học, kĩ thuật nên có nhiều dƯợc liệu tiềm đã, đƯợc nghiên cứu rộng rãi Trong đó, bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.), họ Thanh thất (Simaroubaceae) đƯợc nhân dân ta sử dụng nhiều với số công dụng nhƯ vỏ dùng chữa trƯờng hợp ăn uống không tiêu, đau lƯng, dùng chữa lị Ở ampuchia, ngƯời ta dùng rễ chữa ngộ độc, say rƯợu, trị giun Lá đƯợc dùng để tắm trị ghẻ, lở ngứa Ngoài bá bệnh cịn đƯợc biết đến với cơng dụng tăng cƯờng sinh lực, hỗ trợ điều trị yếu sinh lí nam giới, kích thích ham muốn [14,15,32] Hơn nữa, bá bệnh đƯợc chứng minh có tính chống viêm, chống sốt rét, chống oxy hóa [11,21,22,28,32,45], điều trị tiểu đƯờng [32], ứng cử viên tiềm điều trị ký sinh trùng đƯờng ruột Blastocystis [17] Trên giới, bá bệnh đƯợc đƯợc đánh giá dƯợc liệu có hiệu lực điều trị tốt đem lại hiệu kinh tế cao Bá bệnh đƯợc gọi Sâm Malaysia đƯợc sử dụng nhƯ loại thuốc bổ sức khỏe chống lão hóa [34,45] Nhóm quassinoid, nhóm hợp chất bá bệnh bao gồm số chất nhƯ eurycomanone, eurycomalactone, eurycomanol, eurycolactone… đƯợc báo cáo góp phần vào tính chất chữa bệnh tăng sức mạnh bắp, sức bền, giảm lo lắng, căng thẳng, diệt vi trùng sốt rét Plasmodium falcifarum kháng thuốc… [1,2,21,32], phịng ngừa điều trị lỗng xƯơng nam giới thiếu androgen [19] Trong đó, eurycomanone hợp chất mang lại hiệu cao tác dụng chữa bệnh Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu eurycomanone – marker bá bệnh cịn hạn chế Ngồi khả nhân giống cộng với tốc độ sinh trƯởng chậm việc khai thác rễ không hợp lí khiến cho nguồn dƯợc liệu cạn kiệt Ngồi ra, dƯợc điển Việt Nam chƯa có chun luận định lƯợng eurycomanone bá bệnh Bên cạnh đó, việc kiểm nghiệm bá bệnh nhƯ chế phẩm bá bệnh chủ yếu thực phẩm chức chƯa đƯợc thực Trên sở với trang thiết bị đại sở vật chất vốn có phịng thí nghiệm mơn Hóa dƯợc Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y DƯợc, Đại học Quốc gia Hà Nội đề tài “Định lƯợng eurycomanone bá bệnh (Eurycoma longifoila) sắc ký lỏng hiệu cao HPLC” đƯợc tiến hành Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lƯợng dƯợc liệu bá bệnh nhƯ việc quản lí sản phẩm từ bá bệnh thị trƯờng Các mục tiêu đề tài: Xây dựng phƯơng pháp định lƯợng eurycomanone HPLC thẩm định phƯơng pháp phân tích Xác định hàm lƯợng eurycomanone rễ bá bệnh VN Pharma cy, and Medici ne of V Pharma cy, and Medici ne of VN Pharma cy, and Medicine Phụ lục 02: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone – Xây dựng đƯờng hồi quy tuyến tính Pharma cy, and Medici ne of Hình PL2.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 18,75 µg/ml VN Pharma cy, and Medici ne of Hình PL2.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 25 µg/ml Hình PL2.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 37,5 µg/ml Hình PL2.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 50 µg/ml Hình PL2.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 100 µg/ml Hình PL2.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 200 µg/ml Phụ lục 03: Sắc ký đồ dung dịch trắng (MeOH) Pharmac y, Medici ne of Phụ lục 04: Sắc ký đồ cao bá bệnh and Medicine School @ of School Phụ lục : Độ đồng pic Pharma cy, and Medici ne of School ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: ... 3.6 ảng 3.6 Kết định lượng eurycomanone rễ bá bệnh TN Khối Khối lƯợng lƯợng dƯợc cao liệu (mg) (mg) Diện tích pic eurycomanone Khối lƯợng eurycomanone cao Hàm lƯợng eurycomanone cao 100,3 11,8... cao Đã định lƯợng đƯợc thành phần eurycomanone bá bệnh phƯơng pháp HPL –DAD Kết định lƯợng: hàm lƯợng eurycomanone cao rễ bá bệnh rễ bá bệnh lần lƯợt 0,597% 0,0761% tƯơng đƯơng 5,97 mg/g cao 761