NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN SAPONIN của THÂN rễ sâm vũ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM ) TRỒNG ở SA PA LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học hà nội 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) TRỒNG Ở SA PA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) TRỒNG Ở SA PA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU-DƢỢC HỌC CỔ TRYỀN MÃ SỐ: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Tùng TS Nguyễn Thế Hùng HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ quý báu từ thầy cô giáo đồng nghiệp, quan, gia đình bạn bè Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội; TS Nguyễn Thế Hùng - Bộ Khoa học Công nghệ; TS Hà Vân Oanh - môn Dƣợc học cổ truyền, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, hết lịng bảo tận tình động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, cán Khoa Y Dƣợc - Đại học Quốc gia Hà Nội; môn Dƣợc liệu - Trƣờng ĐH Y Dƣợc Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện đóng góp ý kiến cho tơi q trình thực nghiên cứu Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trƣờng ĐH Y Dƣợc Thái Nguyên; Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học - Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện để đƣợc học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Cảm ơn em sinh viên Huệ, Hào, Thùy, Phƣợng - Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội tập thể lớp Cao học 21 - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đồng hành suốt thời gian qua Lời cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh động viên, ủng hộ tơi suốt q trình học tập đạt đƣợc kết nhƣ ngày hôm Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2018 Nguyễn Thị Thu Thủy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Panax L 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố chi Panax L 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Panax L 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng dƣợc lý số loài chi Panax L 1.2 Tổng quan sâm vũ diệp 1.2.1 Tên khoa học, tên đồng danh 1.2.2 Đặc điểm thực vật, phận dùng 1.2.3 Đặc điểm phân bố Việt Nam 10 1.2.4 Tác dụng dƣợc lý 10 1.2.5 Công dụng 10 1.2.6 Tổng quan nghiên cứu thành phần hóa học SVD 11 1.2.7 Tổng quan số nghiên cứu phân tích định tính định lƣợng thành phần hóa học SVD 14 1.3 Tổng quan chất đánh dấu hóa học cơng tác kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu SVD 15 CHƢƠNG II - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Thiết bị 16 2.1.3 Dung mơi, hóa chất 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất SVD 18 2.3.2 Phƣơng pháp phân lập tinh chế hợp chất hóa học 19 2.3.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 19 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích định tính, định lƣợng saponin thân rễ SVD HPLC 19 2.3.4.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 20 2.3.4.2 Nhận dạng pic sắc ký đồ xác định độ tinh khiết chất phân lập đƣợc từ thân rễ SVD 20 2.3.4.3 Xây dựng dấu vân tay sắc ký HPLC dƣợc liệu SVD 20 2.3.4.4 Thẩm định phƣơng pháp HPLC dùng định lƣợng saponin 21 2.3.4.5 Xác định hàm lƣợng saponin mẫu SVD thu hái đƣợc 23 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu – đánh giá kết 23 CHƢƠNG III - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 24 3.1 Chiết xuất phân lập hợp chất saponin từ thân rễ sâm vũ diệp 24 3.1.1 Chiết xuất 25 3.1.2 Phân lập 25 3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết SKLM 27 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 28 3.2.1 Hợp chất số 28 3.2.2 Hợp chất số 31 3.3 Phân tích thành phần saponin phân lập đƣợc từ sâm vũ diệp HPLC 34 3.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC 34 3.3.2 Nhận dạng pic sắc ký đồ xác định độ tinh khiết chất phân lập đƣợc từ thân rễ SVD 35 3.3.2.1 Nhận dạng pic sắc ký đồ hai saponin phân lập đƣợc 35 3.3.2.2 Xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 phân lập đƣợc 37 3.3.3 Xây dựng dấu vân tay sắc ký HPLC dƣợc liệu SVD 39 3.3.4 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng stipuleanosid R2 SVD 41 3.3.4.1 Chuẩn bị mẫu 41 3.3.4.2 Chƣơng trình sắc ký 41 3.3.4.3 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng 41 3.4 Xác định sơ hàm lƣợng stipuleanosid R2 dƣợc liệu sâm vũ diệp 46 CHƢƠNG IV - BÀN LUẬN 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH n-Butanol 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Cacbon 13) DAD Diode array detector (Detector mảng diod) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat GF254 Gypsum fluorescent 254nm Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton ) HPLC High performace liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantitation (Giới hạn định lƣợng) MeOH Methanol MS Mass spectrum (Phổ khối) m/z Khối lƣợng/điện tích ion NMR Nuclear Magetic Resonance (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) P Panax Rf Retardation factor RP18 Reversed Phase 18 RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối) TT Thuốc thử TPHH Thành phần hóa học SD Độ lệch chuẩn SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng SVD Sâm vũ diệp UV-VIS Ultra violete-Visible v/v Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Phân bố loài thuộc chi Panax L Bảng 1.2 Saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol 20(S)-protopanaxatriol Bảng 1.3 Saponin dẫn chất dammaran khác Bảng 1.4 Saponin dẫn chất ocotillol Bảng 1.5 Saponin dẫn chất acid oleanolic Bảng 1.6 Các hợp chất saponin phân lập từ SVD 14 Bảng 3.1 Hàm lƣợng cắn phân đoạn chiết xuất từ SVD 24 Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H số 28 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất số 32 10 Bảng 3.4 Chƣơng trình dung mơi 35 11 Bảng 3.5 Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết 38 12 Bảng 3.6 Khảo sát thời gian lƣu pic đƣợc chọn 40 13 Bảng 3.7 Thời gian lƣu tƣơng đối pic đƣợc chọn 40 14 Bảng 3.8 Kết khảo sát phù hợp hệ thống sắc ký 42 15 Bảng 3.9 Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 44 16 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp 45 17 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ với stipuleanosid R2 46 18 Bảng 3.12 Kết định lƣợng stipuleanosid R2 dƣợc liệu SVD 47 13 C-NMR, DEPT hợp chất DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học 10 saponin tách đƣợc từ rễ SVD 12 Hình 2.1 Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai 15/03/2016 16 Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng 25 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất số 1, từ phân đoạn n-butanol 27 Hình 3.3 Sắc ký đồ chất số số phân lập đƣợc sau phun TT H2SO4 10% /EtOH 27 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất số phân lập đƣợc 31 Hình 3.5 Cấu trúc hóa học hợp chất số phân lập đƣợc 34 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC saponin phân lập đƣợc, (A) (B), cao butanol (C) SVD 37 Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 38 10 Hình 3.8 Sắc ký đồ chuẩn dấu vân tay sắc ký HPLC 40 11 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng 43 12 Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 43 13 Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch thử 43 14 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn stipuleanosid R2 44 Phụ lục 4.2 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (CD3OD, 400MHz) chất số 2.00 1.75 2.92 0.87 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223.als auto 2.29 1.50 2.59 1.25 3.44 1.00 0.75 6.70 9.99 3.87 3.72 PPM 5.25 5.00 0.66 1.36 1.00 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223.als auto 4.75 4.50 4.25 1.07 1.53 4.00 PPM 200 150 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223_13c.als auto 100 50 PPM 176.4341 170.8524 143.1822 122.1970 107.4275 105.2706 94.1235 89.5873 85.3639 81.2064 77.0488 76.6866 76.4149 74.5296 73.4923 72.2821 69.4583 61.4643 60.7728 55.3227 52.9929 51.3546 50.8030 50.1279 49.7656 49.3046 49.2470 48.8600 48.7942 48.3332 48.2755 48.2179 48.1603 47.7486 47.6910 47.6334 47.4029 47.2464 47.1806 46.7854 46.7278 46.3820 46.0856 45.6905 45.1389 41.2942 40.9155 39.0714 38.5280 38.1081 36.2475 33.2673 32.3041 31.9336 31.8266 31.5055 29.9083 27.2821 26.7799 25.3639 24.6394 22.9270 22.3919 17.7075 16.0445 15.2706 14.4391 Phụ lục 4.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) chất số 30 25 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223_13c.als auto 33.2673 32.3041 31.9336 31.8266 31.5055 29.9083 27.2821 26.7799 25.3639 24.6394 22.9270 22.3919 20 17.7075 16.0445 15 15.2706 14.4391 10 PPM 55 50 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223_13c.als auto 55.3227 45 52.9929 51.3546 50.8030 50.1279 49.7656 49.3046 49.2470 48.8600 48.7942 48.3332 48.2755 48.2179 48.1603 47.7486 47.6910 47.6334 47.4029 47.2464 47.1806 46.7854 46.7278 46.3820 46.0856 45.6905 45.1389 41.2942 40.9155 40 39.0714 38.5280 38.1081 36.2475 PPM 85 80 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223_13c.als auto 85.3639 81.2064 77.0488 76.6866 76.4149 75 74.5296 73.4923 72.2821 70 69.4583 65 61.4643 60.7728 60 PPM 122.1970 120 110 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PB-F223_13c.als auto 100 89.5873 90 81.2064 85.3639 94.1235 105.2706 107.4275 80 PPM Phụ lục – Sắc ký đồ khảo sát phù hợp hệ thống sắc ký Phụ lục - Sắc ký đồ chất đối chiếu xây dựng đƣờng chuẩn Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 75 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 150 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 200 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 300 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 400 µg/mL Phụ lục - Sắc ký đồ cao BuOH sâm vũ diệp nồng độ 100 mg/mL Phụ lục - Sắc ký đồ cao EtOH sâm vũ diệp ... ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM. ) TRỒNG Ở SA PA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU-DƢỢC HỌC... tài ? ?Nghiên cứu thành phần saponin thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem. ) trồng Sa Pa? ?? với mục tiêu: Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học 2-3 saponin thân rễ SVD trồng Sa Pa. .. dụng dƣợc lý nhƣ: nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius) sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) Các nghiên cứu dƣợc lý học chứng minh saponin thành phần