NGUYỄN HOÀNG VIỆT NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN STIPULEANOSIDE R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) TRỒNG Ở SA PA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HOÀNG VIỆT NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN STIPULEANOSIDE R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) TRỒNG Ở SA PA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HOÀNG VIỆT NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN STIPULEANOSIDE R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) TRỒNG Ở SA PA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU-DƯỢC HỌC CỔ TRYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Tùng TS Hà Vân Oanh HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, nhận nhiều giúp đỡ q báu từ thầy cơ, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Trước hết, Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Tùng, Giảng viên Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội, TS Hà Vân Oanh, Giảng viên BM Dược học Cổ truyền, Trường ĐH Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thận lợi cho tơi suốt q trình thực nghiệm hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung thầy cơ, cán thuộc Bộ mơn Hóa dược & Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Phịng Sau Đại học tồn thể cán bộ, thầy cô Trường ĐH Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập q trình hồn thiện luận văn Cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thu Thủy, Giảng viên Trường ĐH Y Dược Thái Nguyên em Đặng Thị Ngần, Nghiên cứu viên BM Hóa dược & KNT, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tập thể lớp Cao học K22, Trường ĐH Dược Hà Nội giúp đỡ đồng hành suốt thời gian qua Cuối cùng, xin cảm ơn vợ tơi gia đình thân u, bạn bè đồng nghiệp quan công tác động viên, quan tâm, chia sẻ khích lệ tơi suốt trình học tập thực luận văn Ds Nguyễn Hoàng Việt MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 CHẤT CHUẨN, CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Ứng dụng 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Phương pháp thiết lập chất chuẩn 1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.2 Thành phần hóa học 1.2.3 Tác dụng dược lý 11 1.2.4 Công dụng theo y học cổ truyền 11 1.3 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 12 1.3.1 Cơng thức hóa học đặc điểm 12 1.3.2 Tác dụng sinh học 13 1.3.3 Các nghiên cứu stipuleanosid R2 13 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 14 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 14 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 14 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 15 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế, xác định cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 16 2.3.2 Xây dựng liệu nhận dạng chất 18 2.3.3 Quy trình thiết lập phân tích đánh giá chất chuẩn 19 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ STIPULEANOSID R2 TRONG SÂM VŨ DIỆP 25 3.1.1.Chiết xuất 25 3.1.2 Phân lập 27 3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập SKLM 27 3.2 XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 28 3.2.1 Đặc điểm cảm quan 28 3.2.2 Điểm chảy 28 3.2.3 Kết đo phổ 29 3.3 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU 32 3.3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích 32 3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn 37 3.3.3 Đóng gói đánh giá đồng lô 41 3.3.4 Đánh giá liên phòng thí nghiệm xác định giá trị ấn định 42 3.3.5 Kết nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn đối chiếu 43 3.4 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU 44 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46 4.1 Về chiết xuất, phân lập tinh chế 46 4.2 Xây dựng liệu nhận dạng 46 4.3 Xác định độ tinh khiết tạp chất 46 4.4 Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 47 4.4.1 Xây dựng thẩm định phương pháp 47 4.4.2 Về qui trình đóng gói đánh giá độ đồng lô 48 4.4.3 Độ ổn định chất chuẩn đối chiếu 48 4.5 Về việc xác định hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu sâm vũ diệp sử dụng nghiên cứu 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACRS chất chuẩn đối chiếu ASEAN BuOH n-Butanol CCĐC Chất chuẩn đối chiếu 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13) CTCL Chỉ tiêu chất lượng DAD Diode array detector (Detector mảng diod) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat GF254 Gypsum fluorescent 254nm GTAĐ Giá trị ấn định Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ) HPLC High performace liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng) MeOH Methanol MS Mass spectrum (Phổ khối) m/z Khối lượng/điện tích ion NMR Nuclear Magetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) P Panax PCRS Chất chuẩn sơ cấp PPPT Phương pháp phân tích PTn Phịng thí nghiệm Rf Retardation factor RP18 Reversed Phase 18 RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) TCCL Tiêu chuẩn chất lượng TT Thuốc thử TPHH Thành phần hóa học SD Độ lệch chuẩn SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng SVD Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) UV-VIS Ultra violete-Visible v/v Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 So sánh hai loại chất chuẩn Bảng 3.1 Hàm lượng cắn phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp 25 Bảng 3.2 Kết đo điểm chảy stipuleanosid R2 29 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H 13C-NMR, DEPT hợp chất số 29 Bảng 3.4 Chương trình dung mơi 33 Bảng 3.5 Tính thích hợp hệ thống sắc ký 34 Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 35 Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi 36 10 Bảng 3.8 Chỉ tiêu phương pháp đánh giá chất lượng chất chuẩn Bảng 3.9 Kết đo điểm chảy nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 37 39 11 Bảng 3.10 Sự phù hợp hệ thống xác định độ tinh khiết 40 12 Bảng 3.11 Kết định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 41 13 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ đồng lô 42 14 Bảng 3.13 Các tiêu chất lượng đánh giá giới hạn chấp nhận 43 15 Bảng 3.14 Các giá trị thời điểm ban đầu 43 16 17 Bảng 3.15 Kết phân tích tạp chất liên quan stipuleanosid R2 sau tháng Bảng 3.16 Kết phân tích tạp chất liên quan stipuleanosid R2 sau tháng 44 44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp 10 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 12 Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai 14 Hình 3.1 Quy trình chiết xuất Stipuleanosid R2 26 Hình 3.2 Quy trình phân lập Stipuleanosid R2 27 Hình 3.3 Sắc ký đồ chất số phân lập sau phun TT H2SO4 10% /EtOH 28 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất số 32 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử 34 10 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 36 11 Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 40 12 Hình 3.8 Sắc ký đồ cao EtOH SVD 45 Phụ lục 3.4 Phổ hồng ngoại FT – IR Stipuleanosid R2 Phụ lục - Sắc ký đồ khảo sát phù hợp hệ thống sắc ký Phụ lục - Sắc ký đồ chất đối chiếu xây dựng đường chuẩn Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 75 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 150 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 200 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 300 µg/mL Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Stipuleanosid R2 400 µg/Ml Phụ lục - Sắc ký đồ cao EtOH sâm vũ diệp Phụ lục 7- Tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn stipuleanosid R2 Công thức phân tử: C53H84O23 Phân tử lượng: 1089.232 g/mol Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Định tính 1.1 Phổ hồng ngoại IR: tiến hành theo Phụ lục 4.2 – DĐVN V 1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H-NMR, 13C-NMR Điểm chảy: tiến hành theo Phụ lục 6.7 – DĐVN V Xác định độ tinh khiết: Không thấp 95,0% Xác định tạp chất liên quan: Yêu cầu: Tổng hàm lượng tạp chất ngun liệu khơng vượt q % tính theo chế phẩm nguyên trạng, loại pic có % diện tích < 0,05% Điều kiện sắc ký tương tự phần định lượng, thời gian chạy sắc ký gấp đôi thời gian lưu pic sắc ký đồ dung dịch thử Cơng thức tính: Spic Ctạp(%) = ∑ Spic x 100 Định lượng (HPLC): Yêu cầu: Mẫu thử phải có hàm lượng khơng nhỏ 95% stipuleanosid R2 tính theo nguyên trạng Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient bảng Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 10 mg chuẩn stipuleanosid R2 vào bình định mức 20 ml, hịa tan pha lỗng vừa đủ MeOH Dung dịch thử: Cân xác khoảng 10 mg chế phẩm vào bình định mức 20 ml, hịa tan pha lỗng vừa đủ MeOH Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm) - Detector DAD phát bước sóng 203 nm - Tốc độ dịng: 0,8 ml/phút - Thể thích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ: 25oC Cách tiến hành: Kiểm tra khả thích hợp hệ thống: Cân cột hỗn hợp pha động 30 phút Tiêm dung dịch chuẩn, hệ số bất đối pic stipuleanosid R2 không lớn 2,0; số đĩa lý thuyết cột không nhỏ 3000 Tiêm riêng biệt lần dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic lần tiêm lặp lại không lớn 2,0% Tiêm dung dịch chuẩn dung dịch thử Căn vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng chuẩn, tính hàm lượng % stipuleanosid R2 có chế phẩm Phụ lục – Báo cáo kết đánh giá liên phịng thí nghiệm xác định giá trị ấn định chất chuẩn stipuleanosid R2 Phụ lục – SKĐ xác định tạp chất liên quan định lượng Stipuleanosid R2 thời điểm tháng Phụ lục 10 - SKĐ xác định tạp chất liên quan định lượng Stipuleanosid R2 thời điểm tháng ... BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HOÀNG VIỆT NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN STIPULEANOSIDE R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) TRỒNG Ở SA PA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN... Tiếp nối kết nghiên cứu thành phần hóa học sâm vũ diệp công bố, thực đề tài ? ?Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn Stipuleanosid R2 từ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng Sa Pa? ?? với mục tiêu:... diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp 10 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 12 Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa