DƢƠNG THỊ hảo NGHIÊN cứu về THỰC vật, THÀNH PHẦN hóa học và tác DỤNG CHỐNG OXY hóa của cây THẠCH CHÂU (pyrenaria sp ), họ CHÈ (theaceae) LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học hà nội 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DƢƠNG THỊ HẢO NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY THẠCH CHÂU (Pyrenaria sp.), HỌ CHÈ (Theaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DƢƠNG THỊ HẢO NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY THẠCH CHÂU (Pyrenaria sp.), HỌ CHÈ (Theaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60 72 04 06 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phƣơng Thiện Thƣơng TS Bùi Hồng Cƣờng HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phƣơng Thiện Thƣơng, Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu TS Bùi Hồng Cƣờng, Bộ môn Dƣợc học cổ truyền, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, ln động viên, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn cán bộ, nhân viên Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu Bộ môn Dƣợc học cổ truyền, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội ln tận tình, tạo điều kiện thuận lợi hết lịng giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Sau cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh chị em bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2016 Học viên Dƣơng Thị Hảo MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .…1 CHƢƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Chi Pyrenaria .3 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Công dụng sử dụng dân gian .5 1.1.3 Thành phần hóa học tác dụng sinh học 1.2 Gốc tự chất chống oxi hóa CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .9 2.2 Hóa chất thiết bị 2.2.1 Thuốc thử, dung mơi, hố chất 2.2.2 Phương tiện máy móc .10 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật giám định tên khoa học .11 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 12 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa phân đoạn cao hợp chất phân lập test in vitro mơ hình in vivo .20 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .26 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học 26 3.1.2 Đặc điểm vi học .28 3.2 Định tính thành phần hóa học 33 3.2.1 Định tính phản ứng hóa học đặc trưng 33 3.2.2 Định tính phương pháp sắc kí lớp mỏng 34 3.2.3 Kết định lượng polyphenol tổng số 39 3.3 Chiết xuất phân lập số hợp chất Thạch châu 40 3.3.1 Chiết xuất chuẩn bị cao phân đoạn 40 3.3.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 41 3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập 42 3.3.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Thạch châu 45 3.4 Tác dụng chống oxy hóa test in vitro mơ hình in vivo 51 3.4.1 Thử tác dụng test in vitro dọn gốc tự DPPH 51 3.4.2 Thử tác dụng test in vitro dọn gốc tự Superoxyd .53 3.4.3 Thử tác dụng chống oxy hóa mơ hình in vivo 54 CHƢƠNG BÀN LUẬN 57 4.1 Về thực vật .57 4.2 Về thành phần hóa học .58 4.3 Về tác dụng chống oxi hóa mối liên quan với thành phần hóa học 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .62 Kết luận 62 Kiến nghị 62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ BuOH n- Butanol 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR DCM Dichlorometha DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl DTNB 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol MS Mass Spectrometry (phổ khối lƣợng) GSH Glutathione Hex n-Hexan HPLC High performance liquid chromatography IC50 Inhibitory concentration 50% IR Infrared Spectroscopy (phổ hồng ngoại) IUCN International Union for Conservation of Nature MDA Malonyl dialdehyd NMR Nuclear Magnetic Resonance OD Optical Density POL Lipid peroxidation Rf Retardation Factor RSD Relative standard devition SD Standard devition SKLM (TLC) Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) SOD Superoxide dismutase ROS/RNS/RCS SRSA Reactive oxygen species/ reactive nitrogen species/ reactive chlorine species Superoxide radical scavenging activity TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TNB 5-thionitrobenzoic acid UV-VIS Ultra violet – Visible DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Tên bảng Trang Bảng 2.1 Cách pha hỗn hợp thử nghiệm phản ứng với DPPH 21 Bảng 3.1 Kết định tính hóa học nhóm chất Thạch châu 33 Bảng 3.2 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất PJE1 so sánh với chất 45 -amyrin β-amyrin Bảng 3.3 Bảng số liệu phổ NMR chất PJE2 so sánh với chất α- 48 tocopherolquinon Bảng 3.4 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất PJE3 so sánh với chất 50 Phytol Bảng 3.5 Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự DPPH phân 51 đoạn từ mẫu Thạch châu Bảng 3.6 Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự DPPH hợp 52 chất phân lập từ mẫu Thạch châu Bảng 3.7 Bảng Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự Superoxyd 53 phân đoạn từ mẫu Thạch châu Bảng 3.8 Kết sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự Superoxyd hợp 53 chất phân lập từ mẫu Thạch châu Bảng 3.9 Hàm lƣợng MDA gan chuột (nmol/ 100mg gan) 55 Bảng 3.10 Hàm lƣợng GSH gan chuột (nmol/ 100mg gan) 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Một số chất chống oxi hóa thƣờng gặp tự nhiên Hình 2.1 Một số hình ảnh Thạch châu (Pyrenaria jonquieriana Pierre ex Laness.) Hình 2.2 Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu Thạch châu nghiên cứu 19 Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo dạng chuyển hóa DPPH 20 Hình 2.4 Sơ đồ Thiết kế thí nghiệm chuột 24 Hình 3.1 Ảnh quan sinh dƣỡng Thạch châu nghiên cứu 26 Hình 3.2 Ảnh quan sinh sản mẫu Thạch châu nghiên cứu 27 Hình 3.3 Hình ảnh vi phẫu cắt ngang mẫu Thạch châu nghiên cứu 28 Hình 3.4 Hình ảnh vi phẫu thân Thạch châu 30 Hình 3.5 Một số đặc điểm bột hoa Thạch châu 31 Hình 3.6 Một số đặc điểm bột thân Thạch châu 32 Hình 3.7 Kết định tính phân đoạn Hex Thạch châu 35 Hình 3.8 Kết định tính phân đoạn EtOAc Thạch châu 36 Hình 3.9 Kết định tính phân đoạn BuOH Thạch châu 37 Hình 3.10 Kết định tính phân đoạn EtOH (C) phân đoạn 38 nƣớc (N) Hình 3.11 Kết định tính phân đoạn EtOH (C) phân đoạn 39 nƣớc (N) Hình 3.12 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn cao mẫu Thạch châu 40 Hình 3.13 Sơ đồ phân lập số hợp chất từ Thạch châu 42 Hình 3.14 Sắc ký đồ định tính hợp chất phân lập đƣợc từ phân 43 đoạn EtOAc mẫu Thạch châu nghiên cứu Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 44 Hình 3.16 Cơng thức cấu tạo chất PJE1 (β-amyrin) 47 Hình 3.17 Cơng thức cấu tạo chất PJE2 (α-tocopherolquinon) 49 Hình 3.18 Cơng thức cấu tạo chất PJE3 (phytol) 51 Hình 3.21 Tác dụng thạch châu đến hàm lƣợng MDA gan 54 chuột bị gây độc CCl4 Hình 3.22 Tác dụng thạch châu đến hàm lƣợng GSH gan chuột bị gây độc CCl4 55 PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H (TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 1H (TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN 13C (TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN DEPT(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN COSY PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN COSY(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN COSY(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HMBC(TIẾP) PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HSQC PHỤ LỤC BỘ PHỔ CHẤT PJE3 PHỔ CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN HSQC ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI DƢƠNG THỊ HẢO NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY THẠCH CHÂU (Pyrenaria sp. ), HỌ CHÈ (Theaceae) LUẬN VĂN... ? ?Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa Thạch châu (Pyrenaria sp. ), họ Chè (Theaceae)? ?? đƣợc thực với mục tiêu sau: Nghiên cứu đặc điểm thực vật giám định xác tên khoa học. .. 1.1.3 Thành phần hóa học tác dụng sinh học Hiện nghiên cứu chi Pyrenaria chủ yếu tập trung vào phân loại theo phƣơng pháp nhƣ Protein hay ADN hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng