NGUYỄN THỊ MINH HỒNG NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật, THÀNH PHẦN hóa học và tác DỤNG KHÁNG VI SINH vật của cây lở LEO THU hái tại hòa BÌNH KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ bộ y tế TRƯỜNG đại học dược hà nội

Bên cạnh một số cây thuốc có tác dụng chữa bệnh ngoài da đã được nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học và tác dụng sinh học, Lở leo là một cây thuốc được sử dụng lâu đời tại Hòa Bình với t

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Trường Đại học Dược Hà Nội

2 Bộ môn Vi Sinh & Sinh học -

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2020

Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn quý thầy

cô trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy cô bộ môn Thực Vật- Trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng đã giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt 5 năm học qua, đồng thời luôn giúp đỡ, tạo mọi

điều kiện để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Quỳnh Hoa và ThS Phạm Thị Linh Giang, những người đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, góp ý, hết

lòng hỗ trợ em trong suốt quá trình làm khóa luận tại bộ môn Em xin gửi lời

cảm ơn tới TS Đỗ Ngọc Quang - Bộ môn Vi sinh & Sinh học - Đại học Dược

Hà Nội đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em cũng xin

chân thành cảm ơn chị Phạm Mỹ Hạnh - kĩ thuật viên bộ môn Thực Vật -

Trường Đại học Dược Hà Nội đã hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu Nhân dịp này, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các cán bộ bộ môn Thực Vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất về phòng thí nghiệm cũng như dụng cụ, thiết bị để

em hoàn thành tốt việc nghiên cứu, thực nghiệm tại bộ môn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và các bạn sinh viên K70 cùng nghiên cứu tại bộ môn Thực Vật đã luôn giúp đỡ, động viên và cổ vũ em trong suốt thời gian qua

Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, kiến thức còn hạn chế nên em không tránh khỏi việc mắc thiếu sót trong quá trình thực hiện khóa luận Em kính mong nhận được ý kiến góp ý quý báu của quý thầy cô để đề tài khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên

Nguyễn Thị Minh Hồng

MỤC LỤC Lời cảm ơn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 1

1.1.1 Đặc điểm thực vật họ Dây khế (Connaraceae) 1

1.1.2 Vị trí phân loại chi Cnestis 1

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Cnestis 1

1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Cnestic Jussieu 2

1.2.1 Hợp chất phenolic 2

1.2.2 Sterol 3

1.2.3 Dẫn chất glucosid 4

1.2.4 Acid béo và dẫn chất 4

1.2.5 Ancol 5

1.2.6 Coumarin 5

1.2.7 Acid amin 5

1.3 Tác dụng sinh học của chi Cnestis 6

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 6

1.3.2 Chống co giật 7

1.3.3 Hoạt động chống oxy hóa 7

1.3.4 Chống tế bào ung thư 7

1.3.5 Tác dụng an thần, giải tỏa căng thẳng 8

1.3.6 Giảm đau chống viêm 8

1.3.7 Hạ đường huyết 9

1.3.8 Tác dụng chống trầm cảm 9

1.3.9 Tác dụng bảo vệ gan 9

1.3.10 Tác dụng nhuận tràng 10

1.3.11 Một số độc tính của chi Cnestis 10

1.4 Kinh nghiệm sử dụng các loài thuộc chi Cnestis trong kinh nghiệm dân gian của các nước trên thế giới 11

1.4.1 Trên thế giới 10

1.4.2 Tại Việt Nam 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 12

2.2 Phương tiện nghiên cứu 12

2.2.1 Hóa chất – Thuốc thử 12

2.2.2 Máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu 12

2.2.3 Chủng vi khuẩn kiểm định 13

2.3 Nội dung nghiên cứu 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 13

2.4.2 Nghiên cứu về hóa học 14

2.4.3 Nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật, nấm 19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 24

3.1.1 Đặc điểm hình thái cây Lở leo 24

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 25

3.1.3 Đặc điểm soi bột 29

3.2 Định tính thành phần hóa học của thân và lá Lở leo 30

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học 30

3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 36

3.3 Tác dụng kháng vi khuẩn và nấm của dịch chiết thân Lở leo 37

BÀN LUẬN 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2, 2-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

MBC Minimum bactericidal concentration

MIC Minimal inhibitory concentration

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng VSV dùng để thử nghiệm và kháng sinh sử dụng làm

chứng dương 21

Bảng 3.1 Kết quả định tính nhóm chất bằng phản ứng hóa học 31

Bảng 3.2 Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ 37

Bảng 3.3 Khối lượng cắn thu được của mẫu nghiên cứu 37

Bảng 3.4 Kết quả thử tác dụng kháng vi sinh vật 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Một số hợp chất phenolic trong chi Cnestis

3

Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Cấu trúc hóa học β-sitosterol 3

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học β-sitosterol-glucosid 4

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học afrormosin-7-O-betasD-galactosid 4

Hình 1.5 Một số acid béo và dẫn chất acid béo trong chi Cnestis 4

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học triacontanol 5

Hình 1.7 Một số hợp chất coumarin trong chi Cnestis 5

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học methionin sulfoximin 6

Hình 3.1 Hình thái Lở leo 24

Hình 3.2 Hình thái hoa cây Lở leo 25

Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân Lở leo 26

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá Lở leo 28

Hình 3.5 Đặc điểm bột thân Lở leo 29

Hình 3.6 Đặc điểm bột lá Lở leo 30

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu thử thân, lá hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 ở ánh sáng thường 37

Hình 3.8 Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết Lở leo trên các chủng Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm quanh năm, với địa hình phức tạp, hệ thực vật đa dạng với khoảng hơn 10000 loài thực vật bậc cao, 600 loài nấm và 800 loài rêu [7] Với tài nguyên thực vật và kho tàng tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc đa dạng, nước ta được biết đến là nước có nền y học cổ truyền phong phú và đặc sắc

Người Mường là một trong những dân tộc thiểu số ở nước ta, nổi tiếng với nhiều bài thuốc nam độc đáo Văn hóa và xã hội của cộng đồng người Mường luôn gắn liền với cây thuốc và bài thuốc Họ sử dụng cây cỏ để chữa trị nhiều bệnh thông thường trong đó có các bệnh ngoài da Bên cạnh một số cây thuốc

có tác dụng chữa bệnh ngoài da đã được nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học

và tác dụng sinh học, Lở leo là một cây thuốc được sử dụng lâu đời tại Hòa Bình với tác dụng kháng khuẩn Theo kết quả điều tra sơ bộ về các cây thuốc của người Mường ở Hoà Bình, Lở leo có thể được xác định là một loài thuộc chi

Cnestis tuy nhiên các thông tin về điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng

sinh học của cây thuốc này vẫn còn chưa được đầy đủ [11]

Để góp phần nâng cao giá trị khoa học của một cây thuốc đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, đồng thời giúp cho việc sử dụng cây Lở leo hiệu quả

hơn, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng

kháng vi sinh vật của cây Lở leo thu hái ở Hòa Bình” được thực hiện với các

mục tiêu như sau:

1 Hoàn thiện mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

2 Định tính thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng

3 Thử tác dụng kháng vi khuẩn và nấm của dịch chiết toàn phần mẫu nghiên cứu

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

1.1.1 Đặc điểm thực vật họ Dây khế (Connaraceae)

Cây gỗ nhỏ, cây bụi hoặc dây leo Lá mọc so le, không lá kèm, có cuống lá; phiến lá lông chim lẻ, kép 3 lá hoặc 1 lá; các lá chét mọc gần đối hoặc so le Cụm hoa đầu cành, giả đầu cành, hoặc ở nách lá Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, đối xứng tỏa tia, hoặc đối xứng hai bên Đài hoa gồm 5 lá đài, rời hoặc chỉ hợp nhất

ở rất gần gốc, xếp lợp hoặc xếp rời Tràng hoa gồm 5 cánh hoa xếp lợp hoặc rời

Bộ nhị gồm 5-10, các bao phấn mở dọc Lá noãn (1-)5(-8), rời, 1 ngăn, rậm lông Vòi nhụy hình dùi hoặc hình chỉ; đầu nhụy gần giống hình đầu, đơn hoặc 2 thùy Noãn 2 trong mỗi lá noãn, ở bên, thẳng đứng Quả thường là quả đại đơn độc [23] [49]

Họ Dây khế có 19 chi gồm: Agelaea, Burttia, Cnestidium, Cnestis,

Connarus, Ellipanthus, Hemandradenia, Jaundea, Jollydora, Manotes, Paxia, Pseudoconnarus, Rourea, Roureopsis, Santalodes, Santaloides, Spiropetalum, Taeniochlaena, Vismianthus và gồm khoảng 350 loài [51]

1.1.2 Vị trí phân loại chi Cnestis Jussieu

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [45], vị trí phân loại của chi Cnestis

Chi Cnestis Jussieu

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Cnestis

Dây leo hay cây nhỡ có cành leo, có khi mọc đứng lúc đầu Lá kép lông chim

lẻ với lá chét nguyên Cụm hoa ở nách hoặc ở ngọn, đơn độc hoặc thành bó Hoa mẫu 5, lưỡng tính, lá đài hơi bị dính ở gốc Cánh hoa ngắn và dài hơn lá đài Nhị

2

10 rời hoặc hơi dính ở gốc, 5 cái đối diện với đài hơi dài hơn 5 cái đối diện với cánh hoa Lá noãn 5, bầu có lông nhung; vòi nhụy dài nhiều hay ít Quả gồm 1-5 quả tại mỗi hoa, dạng quả lê nhiều hay ít và có sừng nhiều hay ít, mở dọc trong,

có lông mềm ở ngoài, có lông áp sát ở trong; đài tồn tại, không đồng trưởng [6]

Trên thế giới, chi Cnestis có 13 loài gồm: Cnestis bomiensis Lemmens,

Merr., Cnestis polyphylla Lam., Cnestis racemosa G.Don, Cnestis uncata Lemmens, Cnestis urens Gilg và Cnestis yangambiensis Louis ex

Troupin [51] Tại Việt Nam, chi Cnestis có 1 loài là Cnestis palala (Lour.) Merr

[7]

1.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Cnestis Jussieu

Các nghiên cứu đã phân lập được các chất chính trong lá, quả và thân các

loài trong chi Cnestis gồm: coumarin, flavonoid, saponin, glycosid, sterol, tanin

và acid amin [46] [22] [41]

1.2.1 Flavonoid

Theo nghiên cứu của Ismail O.I và cộng sự, chiết xuất từ rễ C ferruginea có

chứa hợp chất amentoflavon với nhiều tác dụng dược lý [37] [29]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học amentoflavon

3

1.2.2 Ester của acid hydroxycinnamic

Năm 2011, trong một nghiên cứu về thành phần hóa học của C ferruginea,

Adisa và cộng sự đã phân lập được chất robustasid B

(6'-3",4"-dihydroxycinnamoyl) từ dịch chiết lá C ferruginea [16] Năm 2015, một ester của acid hydroxycinnamic khác được phân lập từ dịch chiết lá C palala có cấu trúc

được xác định là: ethyl caffeate [21]

Robustasid B

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học một số ester của acid hydroxycinnamic

1.2.3 Hydroxyquinon

Kết quả của một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy, hydroxyquinon được

phát hiện ở hai loài trong chi Cnestic: C ferruginea [15] và C palala [21]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học hydroxyquinon

1.2.4 Sterol

Năm 1982, Olugbade và cộng sự đã phân lập thành công β-sitosterol từ dịch

chiết ether lá cây C ferruginea bằng bằng sắc ký kết hợp khối phổ [43] Năm

2015, hợp chất này cũng được tìm thấy trong dịch chiết ethanol lá C palala [21]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học β-sitosterol

4

1.2.5 Dẫn chất glucosid

Năm 2015, một sterol glucosid được phân lập từ lá C palala, có cấu trúc

được xác định là β-sitosterol-glucosid (daucosterin) [21]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học β-sitosterol-glucosid

Trong nghiên cứu của Parvez và cộng sự, một isoflavon glycosid với cấu trúc

afrormosin-7-O-betasD-galactosid được phân lập từ quả C ferruginea [44]

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học afrormosin-7-O-betasD-galactosid

1.2.6 Acid béo và dẫn chất

Hỗn hợp acid béo bão hòa với hai thành phần chính là acid hexadecanoic,

acid octadecanoic được phân lập từ C palala [21] Bên cạnh đó, hợp chất octacosanyl stearat cũng được phân lập từ dịch chiết ether quả C ferruginea [40]

5

1.2.7 Alcol

Nghiên cứu của Olugbade và cộng sự đã phân lập thành công alcol có trong

dịch chiết lá cây C ferruginea với cấu trúc được xác định là: triacontanol [43]

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học triacontanol

1.2.8 Coumarin

Năm 1980, nghiên cứu về một số loài trong họ Connaraceae được thực hiện, nghiên cứu này đã xác định được hai chất: Dicoumarol and 4-hydroxycoumarin

có trong hai loài C corniculatac, C ferruginea Năm 2015, một hợp chất nhóm

courmarin khác: scopoletin (7-(hydroxy-6-methoxycoumarin) được phân lập từ

dịch chiết thân của C palala bằng sắc kí khí khối phổ [21]

6

Dẫn chất acid amin này sau đó được tìm thấy ở một số loại khác thuộc chi

Cnestis như C palala [30], C polyphylla [34], C ferruginea [25]

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học methionin sulfoximin 1.3 Tác dụng sinh học của chi Cnestis

Tác dụng sinh học của chi Cnestis chỉ mới được nghiên cứu chủ yếu trên hai loài C ferruginea và C palala

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol thân C ferruginea đã được thử

nghiệm trên vi khuẩn đa kháng thuốc phân lập từ thịt sống Nghiên cứu sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch và phương pháp vi định lượng trong vi môi

trường lỏng với ba chủng Escherichia Coli, Staphylococcus aureus và Salmonella

spp phân lập từ thịt sống Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá qua một số chỉ

tiêu: đường kính vòng vô khuẩn (IZD), nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng

độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết ethanol

thân C ferruginea có tác dụng kháng khuẩn trên cả 3 chủng

Staphylococcus aureus (MIC, MBC khoảng 3.2-6.3 mg/ml), Escherichia Coli

(MIC, MBC khoảng 150 mg/mL) và Salmonella spp (MIC, MBC khoảng 6.2 mg/mL) với IZD trong khoảng 13-18 mm [22]

Một nghiên cứu khác cũng đã chứng minh dịch chiết C ferruginea nồng độ

cao ức chế tốt các chủng Staphylococcus aureus, Escherichia Coli và Candida

albicans (ức chế từ 40% đến 75% đối với nồng độ dao động từ 1 đến 5 mg/mL)

[44]

Một nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của C palala của Dej-adisai và cộng sự cho thấy: bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, các dịch chiết ethanol lá, thân và vỏ thân cây C palala có tác dụng kháng khuẩn đối với các chủng Staphylococcus aureus (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 7,96±0,70

7

mm; 7,05±0,43 mm; 10,9±0,60 mm) và Staphylococcus epidermidis (kích thước

vòng vô khuẩn lần lượt là: 13,83±0,90 mm; 7,00±0,21 mm; 13,42±0,67 mm) [21] Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Lar MSM, khi sử dụng phương pháp khuếch

tán trên đĩa thạch; các dịch chiết cloroform, ethyl acetate và ethanol rễ cây C

(kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 17 mm; 13 mm; 13 mm), Staphylococcus

aureus (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 18 mm; 12 mm; 16 mm), Pseudomonas aeruglnosa (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 20 mm; 15 mm;

15 mm) , Bacillus pumalis (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 18 mm; 14 mm;

17 mm), Candida albicans (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 18 mm; 14 mm;

16 mm) và Escherichia coli (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 18 mm; 11

mm; 13 mm) Mặt khác, dịch chiết methanol và aceton chỉ có tác dụng trên ba

chủng vi sinh vật là Pseudomonas aeruglnosa (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 16 mm; 17 mm), Bacillus pumalis (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 15 mm; 18 mm) và Candida albicans (kích thước vòng vô khuẩn lần lượt là: 15 mm;

16 mm) [35].

1.3.2 Chống co giật

Tác giả Ismail và cộng sự đã điều tra tác dụng chống co giật củaC

ferruginea bằng mô hình gây co giật trên chuột bạch với các tác nhân: tác nhân

sốc điện tối đa (MES), strychnin (4 mg/kg, tiêm màng bụng), picrotoxin (7,5 mg/kg, tiêm màng bụng), bicucullin (2,7 mg/kg, tiêm màng bụng), isoniazid (250 mg/kg, tiêm màng bụng) và yohimbin (45 mg/kg, tiêm dưới da) Kết quả nghiên

cứu cho thấy dịch chiết ethanol rễ cây C ferruginea (200 mg/kg) có tác dụng

chống co giật với mô hình sử dụng các tác nhân strychnin và isoniazid (p < 0,05), đặc biệt trong mô hình sử dụng tác nhân bicucullin và MES, dịch chiết có tác dụng tương đương của thuốc chống động kinh tiêu chuẩn (clonazepam - 0,5 mg/kg, uống) [27]

1.3.3 Hoạt động chống oxy hóa

Basil N Ita và cộng sự đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết

ethanol hạt C ferruginea bằng phương pháp sử dụng các gốc tự do DPPH và

8

ABTS Trong thí nghiệm với DPPH và ABTS, dịch chiết ethanol hạt C ferruginea

(100 μg/ml) thể hiện rõ khả năng dọn gốc tự do Đặc biệt, trong thí nghiệm với ABTS, dịch chiết thể hiện tác dụng dọn gốc tự do ngay ở nồng độ 10 μg/mL và tác dụng tăng đáng kể ở nồng độ 100 μg/mL [18]

Trong một nghiên cứu khác, Adisa và cộng sự đã được phân lập thành công

các chất chống oxy hóa tiềm năng robasid B và para-hydroxyphenol từ lá C

ferruginea Kết quả cho thấy, robasid B và para-hydroxyphenol làm giảm đáng

kể (p < 0,05) lượng acid thiobarbituric tạo ra từ hỗn hợp Fe2+/ascorbat, điều này

đã khẳng định hoạt động chống oxy hóa của C ferruginea [15]

1.3.4 Chống tế bào ung thư

Nghiên cứu của Dej-adisai và cộng sự đã chứng minh C palala có tác dụng

ức chế dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và dòng tế bào ung thư đại tràng 29) Kết quả nghiên cứu cho thấy: các loại dịch chiết n-hexan của lá và hạt, dịch chiết ether dầu hoả của vỏ thân và rễ C palala có tác dụng ức chế mạnh đối với

(HT-dòng tế bào MCF-7 với khả năng ức chế lần lượt là : 79,97 ± 6,09 %, 83,91 ±

13,74%, 93,58 ± 1,87% và 83,36 ± 7,44%; dịch chiết ether dầu hoả thân C palala

có tác dụng ức chế 92,16 ± 2,38% đối với HT-29 [21]

1.3.5 Tác dụng an thần, giải tỏa căng thẳng

Năm 1984, một nghiên cứu của Jeannoda V L và cộng sự đã đánh giá tác

dụng chống căng thẳng của dịch chiết nước rễ C ferruginea qua một số mô hình

động vật trên chuột như: thử nghiệm bơi cưỡng bức, thử nghiệm giới hạn anoxic

và thử nghiệm căng thẳng bất động gây loét dạ dày Trong thử nghiệm bơi cưỡng

bức, C ferruginea (300-500 mg/kg, uống) làm giảm đáng kể (p < 0,05) thời gian

bất động, tác dụng này phụ thuộc liều Trong thử nghiệm giới hạn anoxic, dịch chiết làm tăng thời gian trung bình (phút) (p <0,05) trước khi co giật ở chuột [31]

1.3.6 Giảm đau chống viêm

Những phát hiện trong nghiên cứu của Ishola IO và cộng sự cho thấy dịch

chiết methanol rễ C ferruginea có tác dụng giảm đau và chống viêm với cơ chế

liên quan đến ức chế giải phóng và ức chế hoạt động của các chất trung gian hóa học (histamin, serotonin và kinin) [30]

9

Năm 2012, Ibironke và cộng sự đã điều tra tác dụng giảm đau và chống viêm

của dịch chiết methanol thân C ferruginea trên chuột bạch Nghiên cứu sử dụng

phương pháp vật lý - sử dụng nhiệt, phương pháp hóa học - sử dụng acid acetic

để đánh giá tác dụng giảm đau, và sử dụng mô hình gây u hạt, mô hình gây

phù bàn chân để đánh giá tác dụng chống viêm của dịch chiết methanol thân C

ferruginea Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết methanol thân C ferruginea

(300-500 mg/kg, đường uống) có tác dụng kéo dài thời gian bắt đầu liếm chân của chuột khi chuột được đặt trên một tấm nóng duy trì ở 55 ± 2oC Bên cạnh dó, dịch chiết còn có tác dụng ức chế phù chân (p < 0,05) do carrageenan và giảm khối lượng u hạt ở mô hình gây u hạt [26]

1.3.7 Hạ đường huyết

Năm 2010, Adisa R A và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết

của các dịch chiết methanol và ethylacetat lá cây C ferruginea trên chuột bạch sử

dụng streptozotocin (STZ) Các dịch chiết được dùng bằng đường uống một liều duy nhất (250 mg/kg) trong 10 ngày liên tiếp Kết quả nghiên cứu cho thấy, FBG

ở nhóm thử đã giảm đáng kể (p < 0,005) sau 4 h từ khi sử dụng dịch chiết Sau 10

ngày, nhóm thử sử dụng các dịch chiết methanol và ethylacetat lá C ferruginea

có mức độ giảm FBG lần lượt là 74% và 68% trong khi nhóm chứng - nhóm chuột

sử dụng thuốc đái tháo đường tiêu chuẩn glibenclamid có kết quả giảm FBG là 60% [14]

1.3.8 Tác dụng chống trầm cảm

Năm 2007, Ishola IO và cộng sự đã nghiên cứu hoạt động chống trầm cảm

của C ferruginea Nghiên cứu sử dụng các mô hình bơi cưỡng bức (FST), thử

nghiệm treo đuôi (TST), mô hình chữ thập nâng cao (EPM) và mô hình 2 ngăn sáng tối (LDB) để đánh giá hiệu quả giải lo âu Kết quả nghiên cứu cho thấy điều

trị bằng chiết xuất C ferruginea làm giảm đáng kể (p > 0,001) thời gian bất động trong hai mô hình FST và TST Tác dụng chống trầm cảm của C ferruginea cao

hơn imipramin (p > 0,05) trong mô hình FST và tương đương fluoxetin trong mô hình TST [31]

1.3.9 Tác dụng bảo vệ gan

10

Năm 2012, Akharaiyi và cộng sự đã báo cáo tác dụng bảo vệ gan của dịch

chiết ethanol lá C ferruginea trên chuột bị tổn thương gan bởi paracetamon Các

thông số đánh giá bao gồm: Aspartat Aminotransferase (AST), Alanin Aminotransferase (ALT), Phosphatase kiềm (ALP) và mô bệnh học Kết quả

nghiên cứu cho thấy sử dụng dịch chiết ethanol lá của C ferruginea (liều

400-2000 mg/kg, đường uống) có tác dụng cải thiện tình trạng tổn thương gan được thể hiện qua hình ảnh mô bệnh học của lô chuột thử [17]

1.3.10 Tác dụng nhuận tràng

Nghiên cứu của Yakubu và cộng sự đã chứng minh dịch chiết nước rễ C

ferruginea có hoạt tính nhuận tràng ở các liều khác nhau đối với chuột bị táo bón

do loperamid, tác dụng này cho hiệu quả tối ưu ở mức liều 100 mg/kg [49]

1.3.11 Một số nghiên cứu về độc tính của chi Cnestis

* Độc tính đối với chức năng sinh sản

Nghiên cứu của Olayemi và cộng sự đã báo cáo độc tính sinh sản trên chuột

đực của các quinolizidin alkaloid từ chiết xuất rễ của C ferruginea Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết rễ C ferruginea làm giảm đáng kể (p < 0,05) số lượng, khả

năng vận động, khả năng sống, hình thái tinh trùng và nồng độ testosteron trong

huyết tương Tuy nhiên, những tác dụng gây hại này sẽ biến mất sau 60 ngày ngưng sử dụng dịch chiết [42]

* Độc thần kinh, ức chế tổng hợp protein trong nuôi cấy tế bào

Theo một số nghiên cứu trên thế giới, một số loài trong chi Cnestis như: C

glabra [32], C polyphylla [50], C palala [39] và C ferruginea [25] có chứa

methionin sulfoximin - một yếu tố độc hại do tác động của nitơ trichlorid

Kết quả nghiên cứu của Jeannoda và cộng sự cho thấy với liều tương ứng 0,5

g hạt, dịch chiết nước hạt C glabra gây chết trên chuột sau các cơn co giật Bên

cạnh đó dịch chiết này gây ức chế tổng hợp protein trong các mô hình RRL và HTC [50]

11

1.4 Kinh nghiệm sử dụng các loài thuộc chi Cnestis trong kinh nghiệm dân gian

1.4.1 Trên thế giới

Một số loài thuộc chi Cnestis được sử dụng làm theo kinh nghiệm dân gian

ở một số địa phương trên thế giới

Tại Malaysia, vỏ rễ của loài C palala (Lour.) Merr được dùng đường uống

để trị bệnh đau dạ dày, rối loạn tiêu hoá và các bệnh đường tiết niệu [35] Ngoài

ra, cây này còn được dùng như thuốc bổ cho phụ nữ sau sinh Khi dùng ngoài, C

palala được sử dụng để đắp chữa bong gân hoặc các chỗ bị sưng ngoài da [48]

Ở Lào, dịch chiết rễ C palala được dùng trong để điều trị kiết lị, nước sắc

của lá được dùng ngoài để điều trị ghẻ và các vết thương ngoài da

Trong y học cổ truyền châu Phi, rễ của C ferruginea sử dụng trong việc quản

lý các rối loạn tâm thần [28], cây này cũng được sử dụng ở một số nước tây Phi với tác dụng giảm đau, chữa bệnh ngoài da, cải thiện các triệu chứng suy nhược,

sử dụng làm thuốc xổ, thuốc an thần [19] Bên cạnh đó, dịch chiết lá cây C

corniculata được sử dụng như bài thuốc trị lậu hiệu quả [20]

Ngoài ra, dịch chiết hạt và rễ của cây C glabra, C polyphylla còn được sử dụng bởi người bản địa châu Phi để đặt bẫy chuột và chó đi lạc [32]

1.4.2 Tại Việt Nam

Lở leo là tên địa phương của một loài thuộc chi Cnestis ở Việt Nam, được

người dân địa phương ở Hoà Bình sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa các bệnh ngoài da hoặc chữa các chứng nóng trong người Cây có thể được dùng đơn lẻ hoặc phối hợp với các dược liệu khác, thường được dùng dưới dạng nước sắc dùng đường uống hoặc dùng ngoài [11] Mặc dù cây Lở leo đã được sử dụng lâu đời tại địa phương nhưng vẫn còn thiếu các thông tin về thực vật, thành phần hoá học và tác dụng sinh học của cây thuốc này Các nghiên cứu về Lở leo hiện đang là vấn đề mới, chưa từng có tài liệu nào công bố tại Việt Nam Hơn nữa, cây

Lở leo vẫn được người dân sử dụng rộng rãi trong cộng đồng địa phương tại Hoà Bình Xuất phát từ thực tế đó, việc nghiên cứu của đề tài là rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học

- Mã số tiêu bản: HNIP/18618/20

- Thời điểm thu mẫu tháng 10/2019

- Mẫu để nghiên cứu đặc điểm hình thái và làm tiêu bản mẫu khô: Mẫu cành mang hoa

- Mẫu để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học: Mẫu cành mang

lá

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất – Thuốc thử

- Dung môi: methanol, ethanol, acid formic, ethyl acetat, nước cất, toluen

- Thuốc thử: vanilin - dung dịch acid sulfuric

Thử theo tiêu chuẩn DĐVN-V và các tài liệu phân tích quy định

2.2.2 Máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Tủ sấy Memmert

- Cân phân tích AC ADAPTER

- Kính hiển vi A Kruss Optronic GmbH

- Bếp cách thủy WiseBathTủ ấm nuôi cấy VSV

- Tủ an toàn sinh học cấp II

- Nồi hấp tiệt trùng HIRAYAMA HV50

- Máy lắc votex

- Máy ly tâm Centrifuge 5415 R

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D + Tamron 60mm f.2.8 Macro

- Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 (Merck)

13

- Hệ thống máy HPTLC - CAMAG gồm: máy chấm sắc ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, máy nhúng thuốc thử CAMAG, buồng phát hiện TLC Visualizer, phân mềm phân tính winCATS và VideoScan

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, giấy lọc, ống đong, đĩa petri, dụng cụ đục thạch,…

- Các dụng cụ khác: micropipette, đầu côn, ống eppendorf, kim mũi mác, quả bóp, giá ống nghiệm,…

2.2.3 Chủng vi khuẩn kiểm định

Do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Bộ môn Vi sinh & Sinh học - Trường đại học Dược Hà Nội cung cấp

- Vi khuẩn gram (+)

Bacillus subtilis ATCC 6633

Staphylococcus aureus ATCC 6538

- Vi khuẩn gram (-)

Escherichia coli ATCC 8739

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Shigella flexneri DT112

- Nấm

Candida albicans ATCC 10231

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu mẫu và mô tả đặc điểm thực vật, vi phẫu, bột dược liệu và giám định tên khoa học của mẫu Lở leo thu hái tại Hòa Bình

- Định tính thành phần hóa học trong thân và lá cây Lở leo bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

- Thử tác dụng kháng khuẩn và nấm của dịch chiết thân cây Lở leo

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

* Thu mẫu:

- Thu mẫu Lở leo tại xã Long Sơn - Huyện Lương Sơn - tỉnh Hòa Bình

14

- Lấy mẫu cây thời kì ra hoa, có quả để quan sát đặc điểm thực vật

- Lấy mẫu cây tươi sử dụng cắt vi phẫu thân, lá

- Mẫu thân, lá khô được sấy ở 50-55°C, nghiền nhỏ để soi bột

* Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái:

Tiến hành phân tích hình thái các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản theo phương pháp mô tả phân tích [2]

* Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: Tiến hành theo các tài liệu [8] [9]

- Cấu tạo giải phẫu thân, lá:

Lá và cành ngâm trong cồn 70%, được làm theo phương pháp tiêu bản thực vật thông thường, bao gồm: cắt, tẩy và nhuộm kép Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi Kruss ở các vật kính x4, x10, x40 sử dụng máy ảnh kỹ thuật số Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được mô tả và phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu

2.4.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng

Các phản ứng được thực hiện theo nhiều tài liệu tham khảo [1], [3], [10]:

a Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hỏa

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình chiết Soxhlet Chiết bằng 50 ml ether dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu Dịch chiết đem cất

15

thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu và sterol

Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy

Định tính sterol (phản ứng Liebermann – Burchardt)

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa Bốc hơi dung môi đến cắn Thêm 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá

b Định tính các thành phần có trong dịch chiết cồn

Cân khoảng 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 50 ml cồn 90%, đun sôi cách thủy vài phút Dịch chiết được lọc và cô còn khoảng 10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin và acid amin

Định tính coumarin

- Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn:

Ống 1: Để nguyên

Ống 2: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

Đun 2 ống nghiệm đến sôi Để nguội rồi quan sát:

Ống 1: Trong suốt

Ống 2: Xuất hiện đục

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát:

Ống 1: Xuất hiện tủa đục

Ống 2: Trong suốt

Acid hóa ống 2 bằng vài giọt HCl đặc thì ống 1 trở lại đục

Định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda):

16

Cho 1ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) Để yên một vài phút, dung dịch chuyển màu đỏ/ đỏ hồng/ đỏ tím,…

c Định tính các thành phần trong dịch chiết nước

Lấy 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi cách thủy trong vài phút, để nguội, lọc lấy dịch chiết để định tính nhóm đường khử, acid hữu cơ và tanin

Định tính đường khử

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A

và 0,5 ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch

Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm vài tinh thể natri carbonat thấy xuất hiện bọt khí

- Ống 2: thêm 2 giọt chì acetat 10%, thấy xuất hiện tủa bông

- Ống 3: thêm 5 giọt gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa bông trắng

17

Định tính saponin (phản ứng tạo bọt)

Cho vào ống nghiệm 0,1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất Lắc mạnh trong 5 phút, để yên Nếu còn bọt bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

d Định tính các nhóm chất khác

Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch

H2SO4 1 N, đun đến sôi trong vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 6 N đến pH = 9 – 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng) Chiết alcaloid base bằng ether hoặc cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết ether hoặc cloroform được gộp lại, lắc với acid sulfuric 1 N hai lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết nước, cho vào 3 ống nghiệm, mối ống 1

ml, nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

- Ống 1: thuốc thử Mayer, cho tủa màu trắng đến vàng

- Ống 2: thuốc thử Bouchardat, cho tủa nâu đến đỏ nâu

- Ống 3: thuốc thử Dragendorff, cho tủa cam đến đỏ

Định tính anthranoid (phản ứng Borntraeger)

Cho vào ống nghiệm 0,5 g bột dược liệu, thêm 5 ml dung dịch H2SO4 1 N, đun sôi trực tiếp trên nguồn nhiệt, lọc dịch chiết còn nóng vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml ether hoặc cloroform Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm

1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ thấy lớp nước có màu đỏ sim

18

Gạn dịch chiết Chloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và đem bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng định tính

- Phản ứng Liebermann – Burchardt: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên

1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 45° Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá

- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 90% , lắc đều cho cắn tan hết Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha đến khi thấy xuất hiện màu đỏ cam Làm song song với một ống chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 90% , lắc đều cho cắn tan hết Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều thấy xuất hiện màu đỏ cam Làm song song với một ống chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

- Phản ứng Keller- Kiliani

Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0.5ml ethanol 90 Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống nghiệm 45° cho từ từ theo thành ống 0.5 ml H 2SO 4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá

- Tiến hành: Thí nghiệm thực hiện trên hệ thống HPTLC - CAMAG LINOMAT

19

+ Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel F254 hoạt hóa ở 110°C trong 1 giờ + Pha động: Khảo sát sắc ký với một số hệ dung môi để các tách các chất tốt nhất

+ Bình sắc kỹ rửa sách, sấy khô, lót một lớp giấy lọc cao gần miệng bình và kín mặt thành trong của bình, đưa vào hệ thống, đậy kín nắp

+ Bão hòa dung môi: Dung môi đã chuẩn bị rót vào hệ thống, cài đặt chế độ bão hòa dung môi

+ Chấm sắc ký: Sử dụng hệ thống HPTLC - CAMAG LINOMAT Lấy một thể tích mẫu thích hợp vào xilanh, đưa xilanh vào hệ thống bơm mẫu tự động Lập tập tin quản lý cho mỗi mẫu phân tích Nhập các thông số cần thiết: độ rộng vết,

số lượng vết, thể tích mẫu chấm

+ Triển khai sắc ký: Đặt thẳng bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín bình, để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

+ Quan sát, chụp ảnh và phân tích bản mỏng sắc ký bằng phần mềm winCATS và VideoScan dưới ánh sáng trắng, ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254

nm, 366 nm và sau khi phun thuốc thử hiện màu vanilin 2,5%/10%H2SO4/EtOH dưới ánh sáng trắng

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật, nấm

- Nguyên liệu: Bột thân cây Lở leo xay thô

- Chiết xuất: Mẫu nghiên cứu được chiết trong các dung môi: nước cất,

ethanol 30%, ethanol 50%, ethanol 70% và ethanol 96%

+ Cân chính xác 5 phần bột dược liệu, mỗi phần khoảng 50,0 g Thấm ẩm mỗi phần với các dung môi trên trong 1 h

• Với dung môi nước cất: chiết nóng 3 lần Thể tích chiết lần lượt là

500 - 200 - 150 trong 1 h, mỗi lần

và CP5

- Môi trường nuôi cấy:

• Môi trường Luria-Bertani thạch (nuôi cấy vi khuẩn):

• Môi trường Yeast-Malt dịch thể:

Bacillus subtilis ATCC 6633 Penicillin G

Vi khuẩn

Gram (-)

- Phương pháp:

Thử tác dụng kháng khuẩn và chống nấm của dịch chiết thân Lở leo bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch tại phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh & Sinh học - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Tiến hành:

+ Chuẩn bị mẫu thử, đối chứng dương:

Mẫu thử: hòa tan 200 mg cắn (CP1; CP2; CP3; CP4; CP5) trong 2,0 ml dimethyl sulfoxid 2% (DMSO 2%)

Đối chứng dương: Dung dịch kháng sinh penicillin G đối với các vi khuẩn

gram (+), gentamicin đối với vi khuẩn gram (-), nystatin đối với nấm Candida

albicans

22

+ Chuẩn bị môi trường: Cân đầy đủ các hóa chất môi trường cho vào bình nón, lắc đều cho hóa chất tan hoàn toàn Điều chỉnh pH về 7,0 bằng HCl và NaOH

1 N Hấp tiệt trùng tại 121ᴼC trong 20 phút

+ Chuẩn bị đĩa thạch: Đổ môi trường thạch vào các hộp petri (20 ml/hộp) + Các chủng VSV được nuôi trong môi trường dịch thể ở 37ᴼC đối với vi khuẩn và 32ᴼC đối với nấm men trong 18 h trước khi thử hoạt tính

+ Pha loãng môi trường dịch thể chứa VSV đến khi đạt độ đục trong khoảng 0,5 độ McFarland Dùng tăm bông vô trùng cấy VSV lên bề mặt môi trường thạch chứa trong đĩa petri

+ Trên đĩa môi trường thạch, tạo các giếng có đường kính 6 mm sau đó nhỏ vào mỗi giếng 100 μl mẫu thử, nhỏ đối chứng dương vào 1 giếng: penicillin G (2,5 μg/giếng), gentamicin (5 μg/giếng), nystatin (2,5 μg/giếng)

+ Các đĩa được ủ ở 37ᴼC đối với vi khuẩn và 32ᴼC đối với nấm men

Thí nghiệm lặp lại 3 lần

- Đánh giá kết quả:

• Đánh giá hoạt tính kháng VSV sau 18 h: quan sát đĩa thạch xem có vòng

vô khuẩn hay không Nếu có, đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác ± 0,1 mm

• Đường kính vòng vô khuẩn được xác định bằng phương pháp thống kê

d = x̅ ± SD (mm) Trong đó:

𝑥̅ = ∑𝑛𝑖=1,𝑛𝑥𝑖

SD = √∑𝑛𝑖=1,𝑛(𝑥𝑖−𝑥̅)

d: đường kính trung bình vòng vô khuẩn

𝑥̅: trung bình cộng các đường kính vòng vô khuẩn của mẫu thử

𝑆𝐷: độ lệch chuẩn

23 𝑛: cỡ mẫu nghiên cứu

𝑥𝑖: đường kính vòng vô khuẩn thứ i (i: 1→ n, n Є N*)

24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái cây Lở leo

Cây Lở leo là cây bụi nhỏ, sau lớn phát triển thành dây leo nhờ thân quấn, cao 2-10 m, thân non phủ lông mịn, màu trắng Lá kép lông chim lẻ một lần, dài 20-30 cm, gồm 5-15 cặp lá chét mọc đối Cuống lá chét dài 1-2 mm, phủ đầy lông ngắn màu xám nâu Lá chét hình bầu dục, dài 2-5 cm, rộng 0,5-1 cm; mặt dưới màu xanh nhạt, mặt trên màu xanh đậm; 2 mặt lá phủ lông ngắn, màu xám nâu, mặt dưới nhiều lông hơn mặt trên; gốc lá tròn hoặc hình tim, ngọn lá tù hoặc ngọn, mép lá nguyên Gân lá kiểu lông chim nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ 8-10 đôi hợp với nhau ở gần mép lá, bề mặt gân phủ lông ngắn, màu xám nâu dày đặc

Hình 3.1 Đặc điểm các cơ quan sinh dưỡng của mẫu Lở leo

1 Cành mang lá; 2 Lá kép; 3 Cành mang hoa; 4 Mặt trên lá; 5 Mặt trên lá; 6 Gốc lá; 7 Cuống lá; 8 Đỉnh lá; 9 Mép lá

Cụm hoa chùm kép, dài 4-6 cm, mọc từ nách lá Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, mẫu 5, đường kính khoảng 0,2-1,0 cm Cuống hoa hình trụ, cuống chính dài 1-2

cm, có lông trắng mịn bao phủ, nối với đài hoa bằng khớp nối dài 0-3 mm Lá bắc

25

nhỏ, hình tam giác, dài 0,5-1 mm, rộng 0,1-0,3 mm, màu xanh, có lông trắng mịn phủ mặt ngoài Đài 5, hình bầu dục kích thước khoảng 2 x 0,5 mm, màu vàng xanh, có lông trắng phủ kín 2 mặt Tràng 5, hình bầu dục, kích thước khoảng 3x1

mm, màu trắng, bề mặt nhẵn Nhị 10, đều, rời, dài 0,5-1 mm, chỉ nhị trắng, dài mang bao phấn hai ô kích thước 0,2x0,3 mm, đính gốc Nhụy 5, rời, mỗi nhụy dài 0,5-1 mm, nhiều lông bao quanh bầu nhụy, vòi nhụy ở trên đỉnh bầu nhụy

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái hoa của cây Lở leo

1.Cụm hoa; 2 Lá đài; 3 Cánh hoa; 4 Hoa và lá bắc; 5 Lá bắc, 6 Bộ nhụy; 7 Nhụy hoa; 8 Bộ nhị, 9 Nhị hoa

Qua các đặc điểm hình thái, kết hợp với các khoá phân loại tham khảo “Cây

cỏ Việt Nam” tập 1 [2], Thực vật chí Trung Quốc [36], giám định tên khoa học

của mẫu nghiên cứu là Cnestis palala (Lour.) Merr., họ Dây khế (Connaraceae)

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân Lở leo

Hình ảnh vi phẫu thân Lở leo được thể hiện ở hình 3.3:

26

Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân Lở leo

1 Biểu bì; 2 Mô mềm vỏ; 3 Mô cứng; 4 Tinh thể calci oxalat; 5 Sợi libe;

6 Libe; 7 Gỗ; 8 Mô mềm ruột; 9 Lông tiết đa bào; 10 Lông che chở

Vi phẫu thân Lở leo có tiết diện hình tròn, từ ngoài vào trong bao gồm: Biểu

bì (1) có 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật dẹt, xếp sít nhau, vách mỏng hóa cutin ở

27

mặt ngoài; trên biểu bì mang các lông che chở đa bào (10) và lông tiết đa bào (9)

Mô mềm vỏ (2) gồm 4-6 lớp tế bào đa giác, không đều, vách mỏng, xếp lộn xộn

để hở nhiều gian bào Cung mô cứng (3) gồm các tế bào sợi vách dày, xếp thành vòng khép kín nằm trong mô mềm vỏ, bắt màu xanh Tinh thể calci oxalat (4) hình khối rải rác trong phần mô mềm vỏ và tập trung chủ yếu ở vòng tế bào mô cứng

Bó libe - gỗ cấp 2 có libe ở ngoài, gỗ ở trong Các bó libe cấp 2 (6) gồm các tế bào vách mỏng, trong libe có xuất hiện các tế bào sợi libe (5) đứng riêng lẻ hoặc phân bố thành cụm 2-5 tế bào, vách dày, bắt màu xanh Gỗ cấp 2 (7) gồm các mạch gỗ xếp thẳng hàng thành vòng tròn đồng tâm và dãy xuyên tâm, rải rác có các mạch gỗ có kích thước lớn, tia ruột hẹp, bắt màu xanh Mô mềm ruột (8) gồm các tế bào tròn, kích thước khác nhau

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá Lở leo

Gân lá: Phía trên lõm ít, phía dưới lồi Biều bì dười (2) gồm 1 lớp tế bào

hình trứng, không đều, xếp sát nhau, có phủ lớp cutin mỏng, bắt màu hồng Trên biểu bì có nhiều lông che chở (13) đa bào và lông tiết đa bào (14), mật độ nhiều hơn biểu bì trên Mô dày (3) gồm 1-2 lớp tế bào có vách dày đều xung quanh Bó libe - gỗ hình cung chia thành 3 múi, nằm chính giữa gân chính: libe (6) ở dưới, gồm nhiều tế bào xếp xít nhau, tế bào hình dẹt, bắt màu hồng, gỗ (7) ở trên, gồm nhiều tế bào hình dạng khác nhau, bắt màu xanh Mô cứng (5) gồm 2-3 lớp tế bào vách dày, bắt màu xanh, tạo thành vòng bao quanh các múi libe - gỗ Mô mềm ruột (4) hình trứng, xếp xít nhau, kích thước không đều, bắt màu hồng Tinh thể calci oxalat (8) hình khối tập, kích thước khác nhau, phân bố rải rác ở phần libe,

và tập trung nhiều xung quanh vòng mô cứng Mô dày trên (11) gồm 1-3 lớp tế bào phân bố ở vị trí lõm của gân lá Biểu bì trên (12) có tấu tạo tương tự biểu bì dưới, có lông che chở và lông tiết

Phiến lá: từ dưới lên trên gồm: biểu bì dưới (1) gồm các tế bào hình trứng,

xếp sát nhau, bắt màu hồng, biều bì có nhiều lông che chở đa bào (13) và lông tiết

đa bào (14) mật độ nhiều hơn so với biểu bì trên Mô giậu (10) gồm 2-3 lớp tế bào hình chữ nhật thuôn dài, xếp khít nhau và thẳng góc với biểu bì trên và biểu bì dưới, chiếm 2/3 chiều dày phiến lá Mô khuyết (9) không đều, sắp xếp rải rác

28

Tinh thể calci oxalat (8) hình khối rải rác, kích thước khác nhau Biểu bì trên (12) hình trứng, to hơn tế bào biểu bì dưới, xếp sát nhau, mang lông che chở và lông tiết đa bào

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá Lở leo

1 Biểu bì phiến lá dưới; 2 Biểu bì gân lá dưới; 3 Mô dày dưới; 4 Mô mềm ruột,5 Mô cứng, 6 Libe; 7 Gỗ; 8 Tinh thể calci oxalat; 9 Mô khuyết; 10 Mô

giậu;