BÙI THỊ MAI HƯƠNG NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG KHÁNG VI SINH vật của củ HÀNH tăm KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI HƯƠNG Mã sinh viên: 1701238 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CỦ HÀNH TĂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thái An Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thành khóa luận em nhận giúp đỡ, hỗ trợ từ nhiều thầy cơ, bạn bè gia đình Với tình cảm chân thành, em xin phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất Thầy Cô, anh chị, bạn, phịng ban mơn Nhà trường tạo điều kiện cho em suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Trước hết, với lịng kính trọng biết ơn, cho phép em gửi lời cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Thái An bảo, định hướng, giải đáp thắc mắc, ln dìu dắt em q trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thanh Tùng – Bộ môn Dược liệu, Ths Đỗ Ngọc Quang – Bộ môn Vi sinh & Sinh học, Ths Đỗ Hồng Anh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, anh chị Phịng Cơng nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) giúp đỡ, hỗ trợ em q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy cô anh chị kỹ thuật viên thuộc mơn Dược liệu nói riêng ln tạo điều kiện tốt giúp em trình nghiên cứu Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè tin tưởng, nguồn động viên to lớn chỗ dựa tinh thần cho em suốt trình học tập, nghiên cứu trường Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Bùi Thị Mai Hương MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tên khoa học vị trí, phân loại Hành tăm 1.2 Đặc điểm thực vật 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm sinh thái 1.2.3 Đặc điểm phân bố 1.3 Thành phần hóa học 1.3.1 Flavonoid 1.3.2 Anthocyanin 1.3.3 Tinh dầu 1.3.4 Hợp chất phenolic 1.3.5 Steroid 1.4 Tác dụng sinh học 1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn 1.4.2 Tác dụng chống oxy hóa 1.4.3 Tác dụng kháng nấm 10 1.4.4 Tác dụng chống giun sán 10 1.4.5 Tác dụng chống viêm 10 1.4.6 Tác dụng hạ huyết áp 11 1.4.7 Tác dụng chống ung thư 11 1.5 Công dụng 12 1.6 Một số thuốc từ Hành tăm 12 1.7 Một số phương pháp đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật………………… 13 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Thu mẫu Hành tăm xác định hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu…… 15 2.2.2 Phân tích thành phần hóa học Hành tăm 16 2.2.3 Phân tích thành phần tinh dầu Hành tăm 16 2.2.4 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật tinh dầu Hành tăm 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Thu mẫu nghiên cứu 16 2.3.2 Xác định hàm lượng nước dược liệu 16 2.3.3 Xác định hàm lượng tinh dầu 16 2.3.4 Định tính sơ nhóm chất thường có dược liệu 17 2.3.5 Định tính Hành tăm sắc ký lớp mỏng 17 2.3.6 Phân tích thành phần tinh dầu sắc ký lớp mỏng 18 2.3.7 Phân tích thành phần tinh dầu sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS) 18 2.3.8 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật tinh dầu Hành tăm 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Kết quan sát đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu 21 3.2 Hàm lượng tinh dầu 21 3.2.1 Tiến hành 21 3.2.2 Kết 21 3.3 Định tính nhóm chất thường gặp Hành tăm 22 3.4 Định tính dịch chiết thân (củ) Hành tăm sắc ký lớp mỏng 23 3.4.1 Tiến hành định tính 23 3.4.2 Kết định tính sắc ký lớp mỏng 24 3.5 Kết phân tích tinh dầu sắc ký lớp mỏng 27 3.6 Phân tích thành phần tinh dầu sắc ký kết hợp khối phổ (GC/MS) 29 3.7 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật tinh dầu Hành tăm 31 CHƯƠNG BÀN LUẬN 33 KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT GC/MS Gas chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký khí kết hợp khối phổ) LB Lysogeny broth MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ) RI Retention index (Chỉ số lưu giữ) RT Retention time (Thời gian lưu) SKLM Sắc ký lớp mỏng SKĐ Sắc ký đồ TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu…………………………… 21 Bảng 3.2 Kết định tính nhóm chất thường gặp Hành tăm…………… 22 Bảng 3.3 Kết định tính thành phần tinh dầu Hành tăm SKLM sau màu vanilin/H2SO4, quan sát ánh sáng thường………………………… 28 Bảng 3.4 Kết phân tích thành phần tinh dầu Hành tăm………………………… 29 Bảng 3.5 Giá trị MIC (µg/ml) tinh dầu Hành tăm chủng vi sinh vật kiểm định ………………………………………………………………………………… 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Ảnh chụp phần thân (củ) Hành tăm (Allium schoenoprasum L.).………… 21 Hình 3.2 Sắc ký đồ cắn chiết Hành tăm……………………….…………… 24 Hình 3.3 Sắc ký đồ cắn toàn phần Hành tăm (H0)………………………………… 25 Hình 3.4 Sắc ký đồ cắn cloroform dịch chiết tồn phần Hành tăm (H1) 26 Hình 3.5 Sắc ký đồ cắn cloroform dịch nước Hành tăm (H2)………………… 27 Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu Hành tăm ánh sáng thường sau màu vanilin/H2SO4………………………………………………………………………… 28 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu tinh dầu Hành tăm…………………………………… 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ tinh dầu Hành tăm……………………………………………… 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, khoa học công nghệ ngày phát triển, bên cạnh thuốc hóa dược, thuốc, vị thuốc dân gian nghiên cứu sử dụng rộng rãi để phòng chữa bệnh Nhiều bệnh truyền nhiễm chữa khỏi thuốc có nguồn gốc thảo dược, đặc biệt với trợ giúp khoa học công nghệ giúp xác định chiết xuất hợp chất dùng phòng điều trị bệnh Chi Hành Allium L chi lớn, phân bố rộng rãi Bắc bán cầu Việt Nam với đặc điểm nước nhiệt đới gió mùa, thiên nhiên ưu đãi, dành tặng kho tàng thực vật phong phú, đa dạng lồi thuộc chi Allium L Các loài thuộc chi Allium L từ lâu sử dụng phổ biến để làm gia vị, rau ăn Các loài thuộc chi Allium L cịn giàu chất dinh dưỡng, có khả điều trị phòng ngừa số bệnh rối loạn tiêu hóa, ung thư, béo phì, tim mạch, tăng cholesterol máu Ngoài ra, tinh dầu loài thuộc chi Allium L cho có khả kháng khuẩn, chống oxy hóa, thành phần giàu hợp chất chứa lưu huỳnh, hợp chất polyphenol Hành tăm trồng quen thuộc, phổ biến khu vực miền Trung Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Ngãi… Cũng giống loài thuộc chi Allium L khác, việc biết đến loại gia vị thơm ngon ăn, Hành tăm cịn vị thuốc sử dụng phổ biến y học cổ truyền thuốc dân gian Một thuốc từ củ Hành tăm người dân hay sử dụng dùng để kích thích tiêu hóa chữa ngộ độc thực phẩm Tác dụng liên quan tới hoạt tính kháng vi sinh vật Hành tăm, nhiên số lượng nghiên cứu khả kháng vi sinh vật loài này, đặc biệt củ tinh dầu Hành tăm hạn chế, Việt Nam Với khả kháng khuẩn tiềm năng, Hành tăm tinh dầu cần nghiên cứu phát triển nhiều tương lai Để góp phần làm phong phú thêm khả ứng dụng Hành tăm nâng cao giá trị tiềm củ Hành tăm, tinh dầu Hành tăm Allium schoenoprasum L., đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật củ Hành tăm” thực với mục tiêu sau: - Nghiên cứu thành phần hóa học củ Hành tăm - Nghiên cứu thành phần tinh dầu Hành tăm - Lựa chọn tinh dầu Hành tăm để đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tên khoa học vị trí, phân loại Hành tăm Tên thường gặp: Hành trắng, Hành tăm, Ném, Nén, (Việt Nam), Chive (Anh - Mỹ) Tên khoa học: Allium schoenoprasum L [6] Theo tài liệu [2], [5], Hành tăm Allium schoenoprasum L thuộc họ Hành (Alliaceae) phân loại [43] sau: Giới thực vật - Plantae Ngành Ngọc Lan - Magnoliophyta Lớp Hành - Liliopsida Bộ Măng Tây - Asparagales Họ Hành - Alliaceae Chi Hành - Allium L Loài - Allium schoenoprasum L Tuy nhiên, theo phân loại APG III, loài thuộc chi Allium L thuộc họ Alliaceae xếp vào họ Amaryllidaceae phân họ Allioideae [43], [46] Do đó, Hành tăm có phân loại sau: Giới thực vật - Plantae Ngành Ngọc Lan - Magnoliophyta Lớp Hành - Liliopsida Bộ Măng Tây - Asparagales Họ Thủy Tiên - Amaryllidaceae Phân họ - Allioideae Chi Hành - Allium L Loài - Allium schoenoprasum L 1.2 Đặc điểm thực vật 1.2.1 Đặc điểm hình thái Hành tăm thảo nhỏ, sống lâu năm [5], mọc thành chùm, giống Hành hương (A fistulosum L.), thường cao 10 - 15 cm tới 20 - 30 cm, cao đến 60 cm thành bụi cỡ 30 cm [6] Thân (củ) Hành tăm màu trắng, lớn cỡ đầu ngón tay út hay hạt ngơ, hình nón, thn dài, đường kính khoảng cm, bao bọc vẩy dai (bẹ trắng, chắc, bẹ bên ngồi đơi có màu xám) [2], [22] Các củ mọc gần thành chùm chùm dày đặc [22] Lá nhiều, màu xanh lục đậm, mỏng khoảng - mm [6] Lá cuống hoa hình trụ rỗng, nhỏ tăm (do gọi Hành tăm) [2], [6] Cụm hoa tán, gần hình đầu, cuống hoa chung, dài 10 - 40 cm, đường kính - mm Lá bắc tổng mỏng, màu đỏ tím, dài gần cụm hoa Mỗi cụm hoa thường gồm 10 - 40 Hoa nhỏ, màu tím, đều, cuống hoa dài khơng Bao hoa mảnh, hình mũi giáo, dài khoảng cm, rộng 0,3 - 0,4 cm, xếp vòng [3] Quả Hành tăm dạng nang nhỏ, hình tam giác, chín vào mùa hè Quả có chiều dài nửa hoa giấu hoàn toàn bên cánh hoa Bên có chứa hạt, chín có màu đen, tương tự hạt hành tây [22] Lá Hành tăm cắt đặn tiếp tục phát triển cọng mềm mại (mỗi đợt nên cắt ngắn cịn chừng 10 cm, mùa hè cắt tỉa từ - đợt) Những không cắt lá, cọng trở thành cứng bắt đầu trổ hoa, Hành giảm bớt mùi hương [6], [7] 1.2.2 Đặc điểm sinh thái Hành tăm thích hợp với nhiệt độ từ 15oC đến 21oC, nhiều ánh sáng, đất thơng thống, khơng ứ nước, có tính acid nhẹ Cây hoa vào tháng - Hành tăm thường trồng vào tháng đến tháng 10 âm lịch, bắt đầu xuống giống từ khu vực Quảng Ngãi kéo dài đến khu vực Nghệ An, Thanh Hóa [7] Người ta thường trồng Hành tăm cách gieo hạt dùng củ làm giống, trồng sau - 2,5 tháng cho thu hoạch [5] Thời gian nảy mầm từ 10 - 14 ngày [6] Hành tăm trồng nhiều loại đất vùng đất khác nhau, từ ruộng lúa, đồng đến đồi, cát, đất rừng [7], thích hợp đất cát pha thịt có hàm lượng cao chất hữu cơ, pH - 6,5 [46] 1.2.3 Đặc điểm phân bố Hành tăm có nguồn gốc Bắc Á, Bắc Âu Bắc Mỹ, trồng sử dụng từ 5000 năm [6] Cây gần mọc hoang vùng Địa Trung Hải, mang vào nước ta để trồng làm rau ăn lấy củ làm thuốc [2] Hành tăm Việt Nam gồm nhiều giống, thích hợp trồng vùng, từ vùng núi cao đến đồng từ Bắc vào Nam [5], phổ biến vùng đất cát từ Thanh Hóa đến Quảng Ngãi [10] 1.3 Thành phần hóa học Theo [30], kết nghiên cứu thành phần hóa học Hành tăm cho thấy, Hành tăm có hợp chất phenolic, flavonoid, anthocyanin, steroid, hợp chất chứa lưu huỳnh tinh dầu Từ cao dịch chiết Hành tăm A schoenoprasum L., nhà khoa học xác định số hợp chất bis-(2-sulfhydryethyl)-disulfid, 2,4,5-trithiahexan, tris-(methyl thio)-methan (Buitrago cộng sự, năm 2011 [16]), quercetin, kaempferol, myricetin, catechin, rutin, acid chlorogenic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid caffeic (Beretta cộng sự, năm 2017 [14]), sitosterol, stigmasterol, campesterol, cholesterol, acid béo tự do, monoacylglycerin, diacylglycerin, triacylglycerin, acid linoleic, acid 33 Najjaa, H., Neffati, M., Zouari, S., Ammar, E (2007), “Essential oil composition and antibacterial activity of different extracts of Allium roseum L., a North African endemic species”, Comptes Rendus Chimie, 10(9), pp 820–826 34 Parvu, A.E., Pârvu, M., Vlase, L., Miclea, P., Mot, A., Silaghi, R.D (2014), “Anti-inflammatory effects of Allium schoenoprasum L leaves”, Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society, 65(2), pp 309-315 35 Parvu, M., Rusu, I., Rosca, C.O (2013), “The antifungal activity of Allium schoenoprasum L leaves”, Contrib Bot, 48, pp 75-82 36 Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P (2008), “Diallyl sulfide content and antimicrobial activity against food-borne pathogenic bacteria of chives (Allium schoenoprasum)”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 72(11), pp 2987-2991 37 Sanei, D.A., Soleimani, A.M., Abadi, Y.S., Paksa, A (2019), “Wild chive oil is an extremely effective larvicide against malaria mosquito vector Anopheles stephensi”, Asian Pac J Trop Med, 12(4), pp 170-174 38 Setiawan, V.W., Yu, G.P., Lu, M.L., Yu, S.Z., Mu, L., Zhang, J.G., Kurtz, R.C., Cai, L., Hsieh, C.C., Zhang, Z.F (2005), “Allium vegetables and stomach cancer risk in China”, Asian Pac J Cancer Prev, 6(3), pp 387-395 39 Shirshova, T.I., Beshlei, I.V., Deryagina, V.P., Ryzhova, N.I., Matistov, N.V (2013), “Chemical composition of Allium schoenoprasum leaves and inhibitory effect of their extract on tumor growth in mice”, Pharmaceutical Chemistry Journal, 46(11), pp 672-675 40 Štajner, D., Čanadanović, B.J., Pavlović, A (2004), “Allium schoenoprasum L., as a natural antioxidant”, Phytotherapy Research, 18(7), pp 522-524 41 Štajner, D., Milić, N., Čanadanović, B.J., Kapor, A., Štajner, M., Popović, B.M (2006), “Exploring Allium species as a source of potential medicinal agents”, Phytotherapy Research, 20(7), pp 581-584 42 Štajner, D., Popović, B.M., Ćalić, D.D., Malenčić, Đ., Zdravković, K.S (2011), “Comparative study on Allium schoenoprasum cultivated plant and Allium schoenoprasum tissue culture organs antioxidant status”, Phytotherapy Research, 25(11), pp 1618-1622 43 Simpson, M.G (2010), “Diversity and classification of flowering plants”, Plant Systematics, pp 181-274 44 Timité, G., Mitaine-Offer, A.C., Miyamoto, T., Tanaka, C., Mirjolet, J.F., Duchamp, O., Lacaille-Dubois, M.A (2013), “Structure and cytotoxicity of steroidal glycosides from Allium schoenoprasum”, Phytochemistry, 88, pp 6166 45 Tran Nguyen An Sa, Nguyen Van Muoi Mot, Nguyen Tri Thuc, Nguyen Thi Diem Thu (2019), “GC/MS-TOF analysis of essential oil composition of the Allium schoenoprasum L bulbs cultivated from Quang Tri - Viet Nam”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm, 18(1), pp 12-22 46 Varinder S., Gargi C., Pawan K., Richa S (2018), “Allium schoenoprasum L.: a review of phytochemistry, pharmacology and future directions”, NaturalProduct Research, 32(18), pp 2202-2216 47 Vlase, L., Parvu, M., Parvu, E., Toiu, A (2012), “chemical constituents of three Allium species from Romania”, Molecules, 18(1), pp 114-127 48 You, W.C., Blot, W.J., Chang, Y.S., Ershow, A., Yang, Z.T., An, Q., Wang, T.G (1989), “Allium vegetables and reduced risk of stomach cancer”, JNCI Journal of the National Cancer Institute, 81(2), pp 162-164 49 Zheng, W., Wang, S.Y (2001), “Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(11), pp 5165-5170 PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC PHỤ LỤC HÌNH ẢNH CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN TỒN PHẦN BẰNG SKLM PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN BẰNG SKLM PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH NƯỚC BẰNG SKLM PHỤ LỤC HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ TINH DẦU HÀNH TĂM PHỤ LỤC CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC Định tính nhóm chất dịch chiết tồn phần 1.1 Định tính alkaloid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ đến cắn Hịa tan cắn khoảng 4ml acid hydroclorid 5%, chia dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Bouchardat, Dragendorff - Phản ứng với thuốc thử Mayer: tủa trắng – vàng nhạt - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ cam - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ gạch So sánh với ống chứng khơng có thuốc thử Nếu dung dịch đục có tủa: Có alkaloid 1.2 Định tính glycosid tim Lấy 20 ml dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 1ml dung dịch chì acetat 30% (TT), khuấy Lọc loại tủa, thử dịch lọc tủa với chì acetat (TT), cho thêm khoảng 0,5ml dung dịch chì acetat vào dịch chiết, khuấy lọc lại Tiếp tục thử tới dịch chiết khơng cịn tủa với chì acetat Cho tồn dịch lọc vào bình gạn lắc với hỗn hợp cloroform : methanol (4:1) (TT) (3 lần, lần ml), gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ khơ Cho dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, bốc dung môi cách thủy đến khơ Cắn cịn lại làm để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng Liebermann – Burchard: Hòa tan cắn ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 1ml acid sulfuric đặc, tránh làm xáo trộn chất lỏng ống Quan sát thấy mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vòng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp màu xanh phản ứng dương tính - Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn ống nghiệm 1ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha (1 phần dung dịch acid picric 1%, phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) So sánh màu với ống chứng ống không chứa cắn thử thấy ống thử màu cam đậm chứng tỏ phản ứng dương tính - Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc Nhỏ giọt TT natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc thấy màu đỏ cam đậm ống chứng (ống không chứa cắn thử) chứng tỏ phản ứng dương tính 1.3 Định tính flavonoid - Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10%, đa số flavonoid làm cho dung dịch từ không màu hay vàng nhạt chuyển thành màu vàng hay vàng cam - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm Thêm 23 giọt dung dịch FeCl3 5% lắc, thấy xuất tủa xanh lục, xanh nâu chứng tỏ có mặt flavonoid - Phản ứng Cyanidin: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm khoảng 10mg bột magie kim loại, nhỏ giọt HCl đậm đặc Để yên, sau vài phút dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ chứng tỏ có mặt flavonoid 1.4 Định tính saponin Thí nghiệm tạo bọt: Cho 10ml dịch chiết vào ống nghiệm, bốc dung mơi đến cịn khoảng 5ml Lấy dịch cho vào ống nghiệm lớn chứa sẵn 5ml nước Dùng ngón tay bịt miệng ống lắc mạnh theo chiều thẳng đứng phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Nếu cột bọt bền vững sau 15 phút sơ kết luận dược liệu có saponin 1.5 Định tính đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling: Cho khoảng 0,5ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5ml thuốc thử Fehling A 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy khoảng 10 phút Phản ứng dương tính xuất kết tủa đỏ gạch lắng đáy ống nghiệm 1.6 Định tính acid hữu - Thử giấy thị với dịch chiết: chấm vài giọt dịch chiết lên giấy thị so sánh màu giấy thị với bảng màu độ pH - Phản ứng với Na2CO3: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm vào dung dịch tinh thể Na2CO3 Nếu có bọt khí nhỏ lên từ tinh thể Na2CO3: có acid hữu 1.7 Định tính tanin - Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: lấy ml dịch chiết, thêm giọt dung dịch - gelatin 1%, xuất tủa bơng trắng chứng tỏ có mặt tanin Phản ứng với muối kim loại:  Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất tủa xanh đen xanh nâu nhạt chứng tỏ có mặt tanin  Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt dung dịch chì acetate 10%, xuất tủa bơng chứng tỏ có mặt tanin Định tính nhóm chất dịch nước 2.1 Định tính glycosid tim Lấy 20ml dịch nước vào cốc có mỏ, thêm khoảng 1ml dung dịch chì acetat 30% (TT), khuấy Lọc loại tủa, thử dịch lọc cịn tủa với chì acetat (TT), cho thêm khoảng 0,5ml dung dịch chì acetat vào dịch chiết, khuấy lọc lại Tiếp tục thử tới dịch chiết khơng cịn tủa với chì acetat Cho tồn dịch lọc vào bình gạn lắc với hỗn hợp cloroform: methanol (4:1) (TT) (3 lần, lần 3ml), gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ khơ Cho dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, bốc dung mơi cách thủy đến khơ Cắn cịn lại làm để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng Liebermann – Burchard: Hòa tan cắn ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 1ml acid sulfuric đặc, tránh làm xáo trộn chất lỏng ống Quan sát thấy mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp màu xanh phản ứng dương tính - Phản ứng Baljet: Hịa tan cắn ống nghiệm 1ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha (1 phần dung dịch acid picric 1%, phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) So sánh màu với ống chứng ống không chứa cắn chiết thấy ống thử màu cam đậm chứng tỏ phản ứng dương tính - Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc Nhỏ giọt TT natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc thấy màu đỏ cam đậm ống chứng (ống không chứa cắn thử) chứng tỏ phản ứng dương tính 2.2 Định tính alkaloid Lấy khoảng 10ml dịch nước cho vào bình gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết đến pH 10 dung dịch NH4OH 10% chiết cloroform (10ml x lần) Gộp chung rửa lớp dung môi hữu với 10ml nước cất Lắc lớp cloroform với dung dịch acid hydroclorid 5% (2ml x lần) Chia dung dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Bouchardat, Dragendorff - Phản ứng với thuốc thử Mayer: tủa trắng – vàng nhạt - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ cam - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ gạch So sánh với ống chứng khơng có thuốc thử Nếu dung dịch đục có tủa: Có alkaloid 2.3 Định tính flavonoid - Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 2ml dịch nước vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10%, đa số flavonoid làm cho dung dịch từ không màu hay vàng nhạt chuyển thành màu vàng hay vàng cam - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1ml dịch nước vào ống nghiệm Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% lắc, thấy xuất tủa xanh lục, xanh nâu chứng tỏ có mặt flavonoid - Phản ứng Cyanidin: Cho 1ml dịch nước vào ống nghiệm, thêm khoảng 10mg bột magie kim loại, nhỏ giọt HCl đậm đặc Để yên, sau vài phút dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ chứng tỏ có mặt flavonoid 2.4 Định tính saponin Thí nghiệm tạo bọt: Cho 10ml dịch nước vào ống nghiệm, bốc dung mơi đến cịn khoảng 5ml Lấy dịch cho vào ống nghiệm lớn chứa sẵn 5ml nước Dùng ngón tay bịt miệng ống lắc mạnh theo chiều thẳng đứng phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Nếu cột bọt bền vững sau 15 phút sơ kết luận dược liệu có saponin 2.5 Định tính tanin - Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch nước, thêm giọt dung dịch gelatin 1%, xuất tủa bơng trắng chứng tỏ có mặt tanin - Phản ứng với muối kim loại:  Lấy ml dịch nước thêm giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất tủa xanh đen xanh nâu nhạt chứng tỏ có mặt tanin  Lấy ml dịch thêm giọt dung dịch chì acetate 10%, xuất tủa bơng chứng tỏ có mặt tanin 2.6 Định tính đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling: Lấy 5ml dịch chiết cô cách thủy đến cắn Hòa tan cắn cồn 25%, lọc Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5ml Fehling A 0,5ml Fehling B Đun sôi cách thủy 10 phút Nếu xuất kết tủa đỏ gạch lắng đáy ống nghiệm: có đường khử 2.7 Định tính acid hữu - Thử giấy thị với dịch chiết: chấm vài giọt dịch chiết lên giấy thị so sánh màu giấy thị với bảng màu độ pH - Phản ứng với Na2CO3: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm vào dung dịch tinh thể Na2CO3 Nếu có bọt khí nhỏ lên từ tinh thể Na2CO3: có acid hữu Định tính nhóm chất dịch chiết bã dược liệu 3.1 Định tính alkaloid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ đến cắn Hịa tan cắn khoảng 4ml dung dịch acid hydroclorid 5%, chia dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Bouchardat, Dragendorff - Phản ứng với thuốc thử Mayer: tủa trắng – vàng nhạt - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ cam - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ gạch So sánh với ống chứng khơng có thuốc thử Nếu dung dịch đục có tủa: có alkaloid 3.2 Định tính glycosid tim Lấy 20ml dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 1ml dung dịch chì acetat 30% (TT), khuấy Lọc loại tủa, thử dịch lọc tủa với chì acetat (TT), cho thêm khoảng 0,5ml dung dịch chì acetat vào dịch chiết, khuấy lọc lại Tiếp tục thử tới dịch chiết khơng cịn tủa với chì acetat Cho tồn dịch lọc vào bình gạn lắc với hỗn hợp cloroform : methanol (4:1) (TT) (3 lần, lần 3ml), gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ khơ Cho dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, bốc dung môi cách thủy đến khơ Cắn cịn lại làm để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng Liebermann – Burchard: Hịa tan cắn ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 1ml acid sulfuric đặc, tránh làm xáo trộn chất lỏng ống Quan sát thấy mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp màu xanh phản ứng dương tính - Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn ống nghiệm 1ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha (1 phần dung dịch acid picric 1%, phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) So sánh màu với ống chứng ống không chứa cắn thử thấy ống thử màu cam đậm chứng tỏ phản ứng dương tính - Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc Nhỏ giọt TT natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc thấy màu đỏ cam đậm ống chứng (ống không chứa cắn thử) chứng tỏ phản ứng dương tính 3.3 Định tính flavonoid - Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10%, đa số flavonoid làm cho dung dịch từ không màu hay vàng nhạt chuyển thành màu vàng hay vàng cam - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm Thêm 23 giọt dung dịch FeCl3 5% lắc, thấy xuất tủa xanh lục, xanh nâu chứng tỏ có mặt flavonoid - Phản ứng Cyanidin: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm khoảng 10mg bột magie kim loại, nhỏ giọt HCl đậm đặc Để yên, sau vài phút dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ chứng tỏ có mặt flavonoid 3.4 Định tính saponin Thí nghiệm tạo bọt: Cho 10ml dịch chiết vào ống nghiệm, bốc dung mơi đến cịn khoảng 5ml Lấy dịch cho vào ống nghiệm lớn chứa sẵn 5ml nước Dùng ngón tay bịt miệng ống lắc mạnh theo chiều thẳng đứng phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Nếu cột bọt bền vững sau 15 phút sơ kết luận có saponin 3.5 Định tính đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling: Cho khoảng 0,5ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5ml thuốc thử Fehling A 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy khoảng 10 phút Phản ứng dương tính xuất kết tủa đỏ gạch lắng đáy ống nghiệm 3.6 Định tính acid hữu - Thử giấy thị với dịch chiết: chấm vài giọt dịch chiết lên giấy thị so sánh màu giấy thị với bảng màu độ pH - Phản ứng với Na2CO3: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm vào dung dịch tinh thể Na2CO3 Nếu có bọt khí nhỏ lên từ tinh thể Na2CO3: có acid hữu 3.7 Định tính tanin - Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch chiết, thêm giọt dd gelatin 1%, xuất tủa trắng chứng tỏ có mặt tanin - Phản ứng với muối kim loại:  Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất tủa xanh đen xanh nâu nhạt chứng tỏ có mặt tanin  Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt dung dịch chì acetate 10%, xuất tủa bơng chứng tỏ có mặt tanin PHỤ LỤC HÌNH ẢNH CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC Nhóm Phản ứng chất định tính Flavonoid Phản ứng với dung dịch kiềm Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Phản ứng Cyanidin Saponin Thí nghiệm tạo bọt Tanin Phản ứng với dung dịch gelatin 1% (1) Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% (2) Phản ứng với dung dịch chì acetat 10% (3) Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling Acid hữu Thử giấy thị màu Phản ứng với Na2CO3 Kết Dịch chiết toàn phần Dịch nước Dịch chiết cồn PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN TỒN PHẦN BẰNG SKLM Màu sắc STT Rf x100 Trước màu Sau màu UV 254 nm UV 366 nm AST UV 366 nm Nâu đen Xanh lam nhạt Nâu nhạt Vàng nhạt 0,9 3,9 Xám nhạt Vàng nhạt 5,4 Vàng nhạt Vàng 9,2 19,3 Hồng nhạt Vàng nhạt 27,4 44,1 47,1 52,0 10 75,0 11 85,3 Nâu nhạt Xanh lam Xanh dương Nâu nhạt nhạt Xanh dương Xanh lam nhạt nhạt Tím nhạt Nâu nhạt Hồng Hồng nhạt Nâu nhạt Hồng nhạt Xanh dương Xanh nhạt dương nhạt PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN BẰNG SKLM Màu sắc STT Rfx100 Trước màu Sau màu UV 254 nm UV 366 nm AST Nâu Xanh lam nhạt Vàng 0,9 5,4 9,2 18,2 20,5 23,5 Tím nhạt 28,2 Tím nhạt 31,7 37,9 10 42,8 11 44,1 12 48,4 13 52,0 14 75,0 15 86,0 Vàng UV 366 nm Vàng Xanh lục Vàng Nâu nhạt Xanh lục Cam Cam Xanh lam nhạt Nâu nhạt Xanh lam nhạt Tím Nâu Xanh dương Xanh lam Xanh lam Tím nhạt Nâu nhạt Tím Nâu Xanh dương Hồng Xanh dương PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH NƯỚC BẰNG SKLM Màu sắc STT Rfx100 Trước màu UV 254 nm UV 366 nm Sau màu AST UV 366 nm Vàng nhạt 0,9 Nâu 5,4 Vàng nhạt 7,0 Vàng 9,2 13,6 18,2 Nâu nhạt 20,5 Nâu nhạt 23,5 29,0 10 31,7 Vàng nhạt 11 34,5 Hồng nhạt 12 37,9 Nâu nhạt 13 44,1 Nâu 14 46,8 15 48,4 16 52,0 Nâu nhạt 17 64,8 Nâu nhạt 18 84,8 19 87,0 Vàng Xanh dương Xanh lục nhạt Xanh lam nhạt Vàng nhạt Xanh lục Vàng Tím nhạt Nâu nhạt Xanh lam nhạt Hồng Xanh dương Xanh lam Tím nhạt Xanh lam Xanh lam nhạt Nâu nhạt Xanh dương Hồng nhạt Xanh dương PHỤ LỤC HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ TINH DẦU HÀNH TĂM BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CỦ HÀNH TĂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 HÀ NỘI – 2022 ... tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật củ Hành tăm? ?? thực với mục tiêu sau: - Nghiên cứu thành phần hóa học củ Hành tăm - Nghiên cứu thành phần tinh dầu Hành tăm. .. ứng dụng tác dụng sinh học Hành tăm thực tế 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Vi? ??t Lăng Thị Vân Anh (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hố học Hành tăm, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, ... phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS) 2.2.4 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật tinh dầu Hành tăm - Lựa chọn tinh dầu Hành tăm để đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật - Đánh giá tác dụng