LƯU VIỆT HOÀNG NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG bảo vệ GAN TRÊN mô HÌNH gây VIÊM GAN cấp BẰNG PARACETAMOL của CAO CHIẾT một LOÀI NGŨ vị tử THU hái ở NGỌC LINH KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯU VIỆT HỒNG MÃ SINH VIÊN:1701211 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN MƠ HÌNH GÂY VIÊM GAN CẤP BẰNG PARACETAMOL CỦA CAO CHIẾT MỘT LOÀI NGŨ VỊ TỬ THU HÁI Ở NGỌC LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS ĐÀO THỊ THANH HIỀN ThS NGUYỄN THỊ PHƯỢNG Nơi thực hiện: Viện Dược liệu HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp khoa Dược lý Hóa sinh khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu, em nhận giúp đỡ, động viên vô lớn từ thầy cơ, anh chị, bạn bè gia đình Lời em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo trường Đại học Dược Hà Nội; khoa Dược lý – Hóa sinh, khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu tạo điều kiện cho em tham gia học tập hoàn thành khóa luận suốt thời gian qua Đặc biệt em xin gửi tới lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Phượng khoa Dược lý – Hóa sinh Viện Dược liệu, người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em xuyên suốt q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Tiếp đến em xin cảm ơn TS Hà Vân Oanh môn Dược học Cổ truyền trường Đại học Dược Hà Nội Cô tạo điều kiện cho phép em tiếp cận tham gia nghiên cứu khoa học, cảm ơn động viên quan tâm sát q trình em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Đào Thị Thanh Hiền giúp đỡ em q trình hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Hà Ly khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu tạo điều kiện tối đa sở vật chất cho em hoàn thành việc nghiên cứu thực nghiệm đề tài khóa luận tốt nghiệp Trong suốt thời gian học tập nghiên cứu, em nhận giúp đỡ to lớn từ anh Nguyễn Văn Hiệp, chị Trần Thị Hồng Vân anh chị khoa Dược lý – Hóa Sinh khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln đồng hành suốt q trình học tập cơng tác, chỗ dựa vững vật chất lẫn tinh thần em gặp khó khăn sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Sinh viên Lưu Việt Hoàng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ngũ vị tử 1.1.1 Thực vật học .2 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng công dụng y học cổ truyền 1.1.4 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học .8 1.2 Mơ hình gây viêm gan cấp 10 1.2.1 Các mơ hình gây tổn thương gan cấp .10 1.2.2 Mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol 11 1.2.3 Mơ hình gây viêm gan tác nhân CCl4 .12 1.2.3 Các thông số đánh giá 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Hóa chất 13 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 14 2.1.4 Động vật nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp định tính nhóm chất thường gặp mẫu dược liệu 15 2.3.2 Phương pháp định lượng polyphenol, flavonoid có mẫu cao dược liệu 17 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Ngũ vị tử .20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu thường gặp Ngũ vị tử 23 3.2 Kết định lượng số hoạt chất Ngũ vị tử 25 3.2.1 Xác định hàm ẩm mẫu cao dược liệu 25 3.2.2 Định lượng polyphenol 25 3.2.3 Định lượng flavonoid .27 3.3 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol 28 3.3.1 Kết hình ảnh gan đại thể 28 3.3.2 Kết đo hoạt độ AST 29 3.3.3 Kết đo hoạt độ ALT 30 3.3.4 Kết định lượng TBARs 31 3.3.5 Kết định lượng GSH 32 CHƯƠNG BÀN LUẬN 34 4.1 Về kết định tính nhóm chất dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh 34 4.2 Về kết định lượng polyphenol, flavonoid 34 4.3 Về tác dụng bảo vệ gan cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 Kết luận 36 Đề xuất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO: DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ, kí hiệu viết tắt Ý nghĩa chữ viết đầy đủ ALT Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Caki-1 CCl4 Dịng tế bào ung thư biểu mơ thận người Carbontetraclorid CMC Carboxymethyl cellulose CNVT Cao chiết Ngũ vị tử DPHH gốc tự diphenyl picryl hydrazinyl DTNB 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) GSH Glutathion HDL High density lipoprotein cholesterol HepG2 Dòng tế bào ung thư gan người IC50 Nồng độ ức chế tối đa nửa LDL Low density lipoprotein cholesterol MDA Malondialdehyde NAFLD Viêm gan nhiễm mỡ khơng rượu NAPQI N-acetyl-p-benzoquinoneimine PAR Paracetamol PC3, MCF7 Dịng tế bào ung thư vú người SCP-0-1, SCPP11 Polysaccharide từ khô S.chinensis SGPT Glutamate-pyruvate transaminase (ALT) SOD Superoxide dismutase TBA Acid thiobarbituric TBARs TC Các chất phản ứng với acid thiobarbituric Total cholesterol TG Triglycerid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất phân lập từ Schisandra sphenanthera…………… Bảng 2.1 Các chất độc với gan dùng để gây tổn thương gan thực nghiệm chuột……………………………………………………………………………… 11 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất Ngũ vị tử Ngọc Linh……….… 24 Bảng 3.2 Kết xác định hàm ẩm mẫu cao dược liệu………… ………… 25 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn polyphenol ………… ………….…… 25 Bảng 3.4 Kết định lượng polyphenol.………… ………… ………… …… 26 Bảng 3.5 Kết xây dựng đường chuẩn flavonoid ………… …………… … 27 Bảng 3.6 Kết định lượng flavonoid.………… ………… ………………… 28 Bảng 3.7 Ảnh hưởng CNVT lên hoạt độ AST huyết chuột……… 29 Bảng 3.8 Ảnh hưởng CNVT lên hoạt độ ALT huyết chuột……… 30 Bảng 3.9 Ảnh hưởng CNVT lên giá trị TBARs gan chuột…… ……… 31 Bảng 3.10 Ảnh hưởng CNVT lên giá trị GSH gan chuột……………… 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số hình ảnh Ngũ vị tử thu vùng núi Ngọc Linh…………………….2 Hình 1.2 Cấu trúc lignan dibenzocyclooctadien từ Schisandra sphenanthera… Hình 1.3 Cấu trúc lignan khác từ Schisandra sphenanthera…………………5 Hình 1.4 Cấu trúc triterpene S.sphenanthera………………… Hình 1.5 Cấu trúc hóa học nortriterpenoid lignan phân lập từ S.sphenanthera …………………………………………………………………… Hình 2.1 Quy trình bào chế cao chiết cồn Ngũ vị tử Ngọc Linh… …………….….13 Hình 3.1 Kết định tính nhóm chất Ngũ vị tử Ngọc Linh………… …24 Hình 3.2 Đường chuẩn polyphenol …………………………………………… 26 Hình 3.3 Đường chuẩn flavonoid…………………………………………… … 27 Hình 3.4 Hình ảnh gan đại thể lơ chuột………………………….…… …29 Hình 3.5 Kết phân tích hoạt độ AST……………………………….………….30 Hình 3.6 Kết phân tích hoạt độ ALT………………………………………… 31 Hình 3.7 Kết phân tích hàm lượng TBARs………………………………… 32 Hình 3.8 Kết phân tích hàm lượng GSH………………………………………33 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Schisandra (Ngũ vị tử) có khoảng 22-25 lồi phân bố giới chủ yếu tìm thấy Trung Quốc [12], [16], [39] Trước năm 2000, Việt Nam phát loài Schisandra cocinea Schisandra sinensis với tên gọi chung Ngũ vị tử phân bố chủ yếu tỉnh biên giới giáp với Trung Quốc Lào Cai Lai Châu [2] Năm 2006, Viện Dược liệu công bố lồi Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils tìm thấy vùng núi Ngọc Linh thuộc địa phận hai tỉnh Kon Tum Quảng Nam Trong y học cổ truyền Ngũ vị tử vị thuốc bổ giúp phục hồi sức khỏe, trị lỵ, lậu, cảm lạnh, say nóng, viêm phế quản, hen phế quản, chữa ho, liệt dương,…[1], [2] Hiện nghiên cứu xác định thành phần hóa học Schisandra sphenanthera hợp chất lignan, ngồi cịn có chứa thành phần tinh dầu, triterpene, acid hữu cơ,…[1], [2], [13] Một số nghiên cứu tác dụng dược lý Schisandra sphenanthera có tác dụng ức chế tế bào ung thư, chống oxy hóa,…[11], [14] Tuy nhiên Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera) loài tương đối Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý tương đối hạn chế Theo thống kê Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng triệu người mắc vấn đề gan có viêm gan Do nhu cầu chăm sóc chi phí điều trị lớn Trên giới có nhiều sản phẩm chiết xuất từ Ngũ vị tử có tác dụng bảo vệ gan Tuy nhiên Việt Nam có nghiên cứu chuyên sâu tác dụng bảo vệ gan từ Ngũ vị tử Điều bỏ phí hội phát triển sản phẩm tiềm điều trị viêm gan có tác dụng, an tồn chi phí thấp từ vị dược liệu quý Việt Nam Từ vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol cao chiết loài Ngũ vị tử thu hái Ngọc Linh” thực với mục tiêu nghiên cứu thành phần hóa học làm sáng tỏ tác dụng bảo vệ gan cao chiết Ngũ vị tử Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm: Định tính nhóm chất có dược liệu Ngũ vị tử phản ứng hóa học đặc trưng Định lượng số hoạt chất có cao chiết Ngũ vị tử Đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao chiết Ngũ vị tử mơ hình gây viêm gan cấp Paracetamol CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ngũ vị tử Ngọc Linh 1.1.1 Thực vật học 1.1.1.1 Vị trí phân loại Ngũ vị tử thu hái Ngọc Linh, Việt Nam có tên khoa học Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils., thuộc chi Ngũ vị tử (Schisandra), họ Ngũ vị (Schisandraceae), Hồi (Illiciales), phân lớp Hoàng liên (Rancunulidae), lớp Hai mầm (Dicotyledones), ngành Hạt kín (Angiospermae) A B C Hình 1.1 Một số hình ảnh Ngũ vị tử thu vùng núi Ngọc Linh (A - Quả chưa chín; B: Hoa; C: Quả chín) 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.) loại thân leo gỗ, dài – m rụng vào mùa khơ (tháng 10-11) Tồn khơng lơng, gặp gân, mặt non có lơng nhỏ mềm thưa thớt Khi đâm chồi (tháng 2) vẩy chồi có lơng mềm Cành nhỏ có mầu hồng cánh gián Thân cành có nốt sần, cành non có cạnh Lá mọc so le, hình trứng đảo, rộng phía cuối lá, gốc hình nêm, đỉnh nhọn, kích thước trung bình dài 5-11 cm, rộng 3-7 cm Mặt xanh đậm, mặt nhạt mầu Mép có cưa thơ phía cuối Lá có gân hình lơng chim Cuống mầu hồng nhạt, dài 2-3 cm Gân 4-5 đôi, lồi mặt dưới, lõm mặt Hoa đơn tính, khác gốc, tràng có 6-9 cánh, màu vàng trắng, có mùi thơm, nhị Hoa mọc nách lá, cuống dài 2-4 cm, gốc có phiến bao (vẩy) dài 3-4 mm Cánh hoa 5-9 màu cam, hình trứng đảo dạng trịn dài, kích thước 6-12 x 58 mm Hoa đực nhị nhiều, thành bó hình trứng đảo, đường kính 4-5mm Đế hoa lồi hình trụ trịn, nhị nhiều, phấn hướng nội, Hoa có 30-60 tâm bì tập hợp thành bó hình cầu dạng trứng, đường kính 5cm Trục đế hoa tập hợp dài 6-17 cm, đường kính 4mm, cuống dài 5-10cm Quả mọng chín có mầu hồng sau đỏ sẫm, hình cầu dạng trứng, đường kính 5-7 mm Hạt trịn màu vàng, hình thận dài mm, rộng 3,8 mm, rốn hạt hình chữ V, vỏ hạt lưng có vân sần sùi [12], [16], [39] 1.1.1.3 Phân bố Trên giới Schisandra sphenanthera phân bố chủ yếu miền trung nam Trung Quốc [12] Ở Việt Nam Schisandra sphenanthera loài phát phân bố chủ yếu vùng núi Ngọc Linh thuộc địa phận hai tỉnh Kon Tum Quảng Nam 1.1.2 Thành phần hóa học Ngũ vị tử có chứa tinh dầu mùi chanh, thành phần tinh dầu gồm 30% secquiterpen, 20% aldehyd aceton Quả chứa 11% acid citric, 7% acid malic 0.8% acid tartric, vitamin C Hạt chứa khoảng 34% chất béo Thành phần Ngũ vị tử dẫn chất lignan [1], [2], [13] phân loại thành nhóm bao gồm lignan dibenzocyclooctadiene (loại A)(1-16), lignan spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadiene (loại B), lignan 4-aryltetralin (loại C)(17), lignan 2,3dimethyl-1,4-diarylbutane (loại D)(18-20), lignan 2,5- diaryltetrahydrofuran (loại E)(21-23) [13] Hàm lượng nhóm lignan Ngũ vị tử dao động từ 7.2-19.2% [1], [2] Có triterpene phân lập từ S.sphenanthera bao gồm acid schizandronic (acid ganwuweizic)(24), acid anwuweizic(25) schisanol(26) [13] Ngoài ra, vào năm 2019, Nguyen Thi Mai cộng phân lập hợp chất nortriterpenoid (27-32) lignan (33-37) [14] Bảng 3.6 Kết định lượng flavonoid Mẫu Khối lượng cân (mg) Thể tích Nồng độ C pha lỗng (mg/ml) (ml) Mật độ Hàm quang lượng Abs (%) 196,9 50 0,23594 0,691 6,61 213,5 50 0,264222 0,778 6,83 217,8 50 0,263247 0,775 6,67 Trung bình 6,70 Từ kết thu cho thấy cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh có hàm lượng flavonoid 6,70% 3.3 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol 3.3.1 Kết hình ảnh gan đại thể Lơ 1: Sinh lý Lô 2: Bệnh lý Lô 3: Chứng dương Lô 4: CNVT 500 28 Lơ 5: CNVT 1000 Hình 3.4 Hình ảnh gan đại thể lô chuột Nhận xét: Từ Hình 3.4 ta thấy: + Lơ (sinh lý): Gan màu sẫm, mặt nhẵn, mềm, không phù nề, không sung huyết + Lô (bệnh lý): Gan bạc màu, bề mặt sần, gan xốp, nhẹ, khối gan to + Lơ (chứng dương): Nhiều gan sẫm màu, có số bạc màu, mặt nhẵn, xốp + Lơ (CNVT 500): Gan bạc màu, số sẫm màu, bề mặt sần, gan xốp + Lô (CNVT 1000): Gan sẫm màu, bạc màu, bề mặt nhẵn, phù nề, sung huyết 3.3.2 Kết đo hoạt độ AST Bảng 3.7 Ảnh hưởng CNVT lên hoạt độ AST huyết chuột Lô Tên lô n AST (U/l) p Sinh lý 193,3±9,4 p1-2 = 0,000 Bệnh lý 11 2292,3±369.5 Chứng dương 11 1211,8±102,0 p2-3 = 0,042 CNVT 500 1981,6±267,6 p2-4 = 0,950 CNVT 1000 10 1087,7±146,3 p2-5 = 0,010 29 Hoạt độ AST 3000 Hoạt độ AST (U/l) 2500 2000 * * CNVT1000 Silymarin 1500 1000 500 *** Sinh lý Bệnh lý CNVT500 Hình 3.5 Kết phân tích hoạt độ AST * p