18 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG ĐỘC TẾ BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MDA MB 468 CỦA VỎ QUẢ DÓ BẦU (AQ[.]
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG ĐỘC TẾ BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MDA-MB-468 CỦA VỎ QUẢ DÓ BẦU (AQUILARIA CRASSNA Pierre ex Lecomte) Nguyễn Thị Thu Thảo*, Lê Thị Hồng Vân Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: nguyenthuthao1996ak@gmail.com TĨM TẮT Nghiên cứu, phát triển sản xuất thuốc điều trị ung thư từ dược liệu định hướng phát triển ngành dược Việt Nam Nghiên cứu thực nhằm khảo sát tác động độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-468 vỏ Dó bầu, phân lập, xác định cấu trúc tác dụng độc tế bào chất phân lập Kết sàng lọc tác dụng độc tế bào cao chiết phân đoạn vỏ Dó bầu cho thấy vỏ Dó bầu dược liệu đầy tiềm năng, hoạt tính độc tế bào mạnh phân đoạn phân cực Từ phân đoạn phân cực kỹ thuật sắc kí cột phân lập 11 hợp chất Tiến hành biện giải, so sánh với liệu phổ xác định cấu trúc hợp chất gồm hợp chất có hợp chất lần đầu phân lập chi Aquilaria, hợp chất lần phân lập loài A crassna Kết thử độc tính tế bào cho thấy hợp chất triterpen khung cucurbitacin mà đề tài phân lập cho hoạt tính độc tế bào mạnh dịng tế bào đề tài nghiên cứu Các hợp chất cucurbtacin neocucurbitacin báo cáo có hoạt tính độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư hoạt tính sinh học khác, từ cho thấy vỏ Dó bầu dược liệu tiềm để sàng lọc hợp chất thiên nhiên có tác dụng sinh học đặc biệt tác dụng kháng ung thư Từ khóa: Dó bầu, Aquilaria crassna, độc tế bào, MDA-MB-468 ISOLATION AND IDENTIFICATION OF CYTOTOXIC SAPONIN ON BREAST CANCER CELL LINE MDA-MB-468 FROM AQUILARIA CRASSNA Pierre ex Lecomte Nguyen Thi Thu Thao*, Le Thi Hong Van University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City *Corresponding Author: nguyenthuthao1996ak@gmail.com ABSTRACT Research, development and production of drugs for cancer treatment from medicinal herbs is one of the development orientations of Vietnam's pharmaceutical industry This study was conducted to investigate the cytotoxic effect on MDA-MB-468 breast cancer cell line of A.crassna fruit, isolation, determine the structure and cytotoxic effect of substances isolated The results of screening the cytotoxic effect of A.crsanna fruit extract showed that it is a potential medicinal, the strongest cytotoxic activity is in the less polar segment By column chromatography technique, 11 compounds were isolated Proceed with justifying and comparing with spectral data to determine the structure of compounds in which the first compounds are isolated in genus Aquilaria, the first are isolated in A crassna The cytotoxic test results show that triterpen cucurbitacin compounds, which the subject is isolated, showed strong cytotoxic activity on the studied cell line These cucurbtacin and neocucurbitacin compounds have been reported to have strong cytotoxic activity on cancer cell lines and other biological activities, thus showing A crassna as a potential medicinal ingredient for screening of natural compounds with special biological effects against cancer Keywords: Aquilaria crassna, agarwood, MDA-MB-468, cytotoxic nước ta với diện tích lên đến hàng trăm hecta Lồi quan tâm đầu tư phát triển có khả hình thành Trầm hương có ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Dó Bầu (Aquilaria crassna Piere ex Lecomte) trồng nhiều tỉnh thành 18 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học giá trị lớn mặt hương liệu dược liệu, người dân tận dụng nguồn để làm trà với tác dụng an thần, chống oxy hóa, nhuận trường Trên nghiên cứu gần đối tượng loài A sinensis (một lồi Dó Trung Quốc) cho thấy giàu saponin triterpen với tác dụng độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư, chưa có nghiên cứu thêm đối tượng loài chi loài A crassna Do vậy, nghiên cứu thực nhằm khảo sát tác động độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-468 vỏ Dó bầu, phân lập, xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính hợp chất phân lập từ phân đoạn có hoạt tính vỏ Dó bầu MeOH, phân tách cao MeOH tồn phần thành phân đoạn có độ phân cực tăng dần kỹ thuật phân bố lỏng – lỏng Phân lập tinh chế: Sử dụng phương pháp sắc kí cột chân khơng, sắc kí cột cổ điển, phương pháp kết tinh phân đoạn kết tinh lại dung mơi thích hợp Xác định cấu trúc chất phân lập được: Dựa vào tính chất hóa lý (màu sắc, độ tan) Các chất dự đốn trùng với chất phân lập trước xác định SKLM UPLC (mẫu phân lập, mẫu chuẩn, mẫu phân lập thêm chuẩn) Các chất chưa biết xác định cấu trúc dựa vào liệu phổ UV, MS NMR đối chiếu với liệu phổ tài liệu tham khảo ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Quả Dó bầu thu hái xã Đồng Tâm, huyện Đồng Phú, Bình Phước tháng 06/2018 (công ty TNHH Tiến Phước) Quả tách bỏ hạt, lấy phần vỏ quả, sấy khơ Dịng tế bào ung thư vú MDA-MB-468 Phương pháp nghiên cứu Hoạt tính độc tế bào: Hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào thực theo phương pháp mơ tả Moore cộng Dịng tế bào ung thư vú MDA-MB-468 nuôi cấy môi trường DMEM giàu glucose, bổ sung 10% huyết thai bò (FCS), Lglutamin natri pyruvate, không bổ sung kháng sinh điều kiện 5% CO2 37 oC Mẫu thử hòa hòa tan DMEM chứa 0,5% DMSO Thử nghiệm tiến hành đĩa 384 giếng theo quy trình: cho 10 μl mẫu thử nồng độ khác nhau, tiếp cho vào 60 μl tế bào mật độ 1,7 104 tế bào/giếng, ủ 48 Sau 72 nuôi cấy, loại bỏ 80 l môi trường nuôi cấy cũ, thêm 40 l hỗn hợp phẩm nhuộm nhân màng tế bào Sytox (1:10.000) Hoechst (1:10.000) Tiếp tục ủ 30 phút 37oC trước đếm số lượng nhân tế bào sống chết kính hiển vi huỳnh quang (Incell analyzer 2200) Sử dụng chứng dương actinomycin D (ActD) nồng độ 0,0025 g/mL (~0,2 nM) Nghiên cứu thành phần hóa học Chiết xuất tách phân đoạn: Dược liệu chiết phương pháp ngấm kiệt KẾT QUẢ Tác dụng độc tế bào cao chiết MeOH toàn phần cao chiết phân đoạn Cao chiết cao phân đoạn thử nồng độ 1; 5; 10; 25; 50 µg/mL Kết cho thấy hoạt tính giảm theo thứ tự sau: Cao DCM ~ cao n-hexan > cao EtOAc > cao n-BuOH> cao MeOH Hoạt tính cao chiết phân cực (cao hexan DCM) mạnh nồng độ g/mL cho tác dụng ức chế tăng trưởng 99% Phần phân cực chọn để khảo sát thành phần hóa học Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học vỏ Dó bầu Chiết xuất tách phân đoạn: Chiết ngấm kiệt 1,3 kg vỏ Dó bầu với MeOH thu 116 g MeOH;1,62 g tủa MeOH Bằng kỹ thuật phân bố lỏng - lỏng thu 30 g cao DCM; 1,46 g tủa EtOAc; 8,08 g cao EtOAc; 1,48 g tủa nBuOH; 7,74 g cao n-BuOH 66,34 g cao nước Phân tách cao DCM: Cao DCM (30 g) phân tách phương pháp sắc kí cột chân khơng thành phân đoạn (D1-D7) phân đoạn D1 thu AQf1 (39 mg) Phân lập phân đoạn D5: Phân đoạn D5 (2,9 g) phân lập sắc ký cột cổ điển thành 20 phân đoạn (D5.1-D5.20) Bằng phương pháp thay đổi dung môi, kết tinh lại dung mơi thích hợp, phân đoạn D5.7 thu AQf2 (32 mg); phân đoạn D 5.10-12 thu AQf4 (90,6 mg) Phân lập phân đoạn D5.9: Bằng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển, từ phân đoạn D5.9 phân lập AQf3 (4 mg) 19 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học với liệu phổ tài liệu tham khảo [6] kết luận AQf5 5-hydroxy-7,4’dimethoxyflavon (4) AQf6: Tinh thể hình kim, khơng màu, tan MeOH, dễ tan n-hexan, DCM Khơng có UV 254 nm 365 nm, cho vết màu tím có vịng nhân với TT VS Dự đốn AQf6 phystoserol Tiến hành định danh với stigmasterol chuẩn sắc kí lớp mỏng kết luận AQf6 stigmasterol (5) AQf7: Bột vơ định hình màu vàng nhạt, tan MeOH, tan nhiều DCM Từ liệu phổ MS, MNR tiến hành so sánh với liệu phổ tài liệu tham khảo [6] kết luận AQf7 velutin (6) AQf8: Tinh thể hình kim, màu trắng, dễ tan MeOH, DCM Từ liệu phổ MS NMR, so sánh với liệu phổ tài liệu tham khảo [7] kết luận AQf8 neocucurbitan A (7) AQf9: Bột vơ đinh hình, màu trắng, dễ tan MeOH, DCM Từ liệu phổ MS NMR so sánh với liệu phổ tài liệu tham khảo [2] kết luận AQf8 neocucurbitan B (8) AQf10: Bột vơ đinh hình, màu trắng, dễ tan MeOH, DCM Từ liệu phổ MS NMR, so sánh với liệu phổ tài liệu tham khảo [8] kết luận AQf10 cucurbitacin E 2-O--D-glucopyranosid (9) Phân lập phân đoạn D6: Phân đoạn D6 (12 g) phân lập sắc ký cột thành 25 phân đoạn (D6.1-D6.25) Bằng phương pháp thay đổi dung mơi, kết tinh lại dung mơi thích hợp từ phân đoạn D6.2 thu AQf5 (1,6 mg) AQf6 (4 mg); D6.4 thu AQf7 (1,2 mg); D6.10 thu AQf8 (15,8 mg); D6.22 thu AQf9 (27 mg); D6.25 thu AQf10 (8 mg) Phân lập phân đoạn D6.16: Bằng kĩ thuật sắc kí cột cổ điển từ phân đoạn D6.16 phân lập AQf11 (4,2 mg) Định danh xác định cấu trúc AQf2: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt, tan MeOH, dễ tan DCM Phổ UV cho đỉnh hấp thu 267 334 nm, dự đoán AQf6 flavon Tiến hành định danh với genkwanin chuẩn sắc kí lớp mỏng UPLC kết luận AQf2 genkwanin (1) AQf3: Bột vơ định hình màu trắng, tan MeOH, dễ tan DCM Từ liệu phổ MS NMR, so sánh với liệu phổ tài liệu tham khảo [4] kết luận AQf3 7-hydroxy-2-2-phenylethychromon (2) AQf4: Bột vơ định hình màu trắng, tan MeOH, dễ tan DCM Từ liệu phổ MS NMR, đối chiếu với liệu phổ tài liệu tham khảo [5] kết luận AQf4 cucurbitacin E (3) AQf5: Tinh thể hình kim, màu vàng, tan MeOH, tan nhiều DCM Từ liệu phổ MS NMR, so sánh (7) R=OAc (8) R=H (4) (2) (9) (1) R =H, R =OH, R =OH 2 (6) R =H, R = OH, R =OCH3 (4) R =H, R =OCH3, R =H Hình Cấu trúc hóa học hợp chất 1-9 20 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Thử hoạt tính độc tế bào số chất tiềm phân lập Các chất (3) (9) thể hoạt tính ức chế tăng trưởng mạnh dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-468 Hợp chất cucurbitacin E 2- Kỷ yếu khoa học O--D-glucopyranosid (9) có IC50=21,88 µM Trong aglycon (3) thể hoạt tính mạnh với nồng độ 0,5 µg/ml (~ 0,89 nM) cho tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào 90% CurcubitacinE Cucurbitacin E 2-O- -D-glucopyranosid Hình Kết thử nghiệm độc tính hợp chất (3) (9) dòng tế bào ung thư vú MDA-MB 468 glycodsid nó, điều cho thấy gắn phân tử đường vào cấu trúc saponin làm tăng tính phân cực nên qua màng phospholipid khó hơn, từ hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào giảm so với aglycon BÀN LUẬN Từ phân đoạn DCM cho hoạt tính độc tế bào mạnh đề tài phân lập 11 hợp chất xác định cấu trúc hợp chất (4 hợp chất triterpen cucurbitacin, hợp chất khung chrommon, hợp chất nhóm flavon, hợp chất phytosterol), lần hợp chất cucurbitancin E, cucurbitacin E 2-O-D-glucopyranosid, neocucurbitacin A tìm thấy chi Aquilaria neocucurbitacin B, 7-hydroxy-22phenylethychromon, 5-hydroxy-7,4’dimethoxyflavon, velutin tìm thấy loài A crassna Các hợp chất khung chrommon thành phần đặc trưng cho phần gỗ trầm hương tìm thấy phận Các hợp chất triterpen khung cucurbitacin neocucurbitacin đặc trưng cho họ Cucurbitaceace, nhóm chất báo cáo có hoạt tính độc tế bào mạnh dịng tế bào ung thư hoạt tính sinh học khác, từ cho thấy vỏ Dó bầu dược liệu tiềm để sàng lọc hợp chất thiên nhiên có tác dụng sinh học đặc biệt tác dụng kháng ung thư Hoạt tính hợp chất cucurbitacin E tác dụng mạnh nhiều so với với dạng KẾT LUẬN Từ phân đoạn DCM cho hoạt tính độc tế bào mạnh đề tài phân lập 11 hợp chất xác định cấu trúc hợp chất đó: chất cucurbitancin E, cucurbitacin E 2O--D-glucopyranosid, neocucurbitacin A lần phân lập chi Aquilaria chất neocucurbitacin B, 7-hydroxy-22phenylethychromon, 5-hydroxy-7,4’dimethoxyflavon velutin lần phân lập loài A.crassna Xác định hoạt tính độc tế bào dịng ung thư vú MDA-MB-468 cucurbitacin E ức chế tăng trưởng > 90% nồng độ 0,89 nM cucurbitacin E 2-O--D-glucopyranosid với IC50 = 21,88 µM Các hợp chất neocucurbitacin A B hợp chất khó phân lập tự nhiên, có tiềm lớn để tiếp tục nghiên cứu tác động độc tế bào dòng ung thư khác TÀI LIỆU THAM KHẢO NGUYỄN HUY SƠN (2015), “Nghiên cứu đánh giá thực trạng phát triển bền vững Dó trầm (Aquilarria spp.)”, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam MEI WEN-LI, LIN FENG, ZUO WEN-JIAN, WANG HUI, DAI HAO-FU (2012), “Cucurbitacins from fruits of Aquilaria sinensis”, Chinese Journal of Natural Medicines, 10 (3), 234-237 21 ... nghiên cứu thêm đối tượng loài chi loài A crassna Do vậy, nghiên cứu thực nhằm khảo sát tác động độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MDA- MB- 468 vỏ Dó bầu, phân lập, xác định cấu trúc đánh giá hoạt... ung thư vú MDA- MB- 468 Phương pháp nghiên cứu Hoạt tính độc tế bào: Hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào thực theo phương pháp mơ tả Moore cộng Dịng tế bào ung thư vú MDA- MB- 468 nuôi cấy môi trường... PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Quả Dó bầu thu hái xã Đồng Tâm, huyện Đồng Phú, Bình Phước tháng 06/2018 (cơng ty TNHH Tiến Phước) Quả tách bỏ hạt, lấy phần vỏ quả, sấy khơ Dịng tế bào ung thư vú MDA- MB- 468