Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học (in vitro) của hoa thanh long hylocereus undatus (haw ) britton rose, cactaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÝ KIỀU HƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC (IN VITRO) CỦA HOA THANH LONG Hylocereus undatus (Haw.) Britton  Rose, Cactaceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÝ KIỀU HƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC (IN VITRO) CỦA HOA THANH LONG Hylocereus undatus (Haw.) Britton  Rose, Cactaceae Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Lý Kiều Hương TĨM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Năm học 2017-2019 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC (IN VITRO) CỦA HOA THANH LONG Hylocereus undatus (Haw.) Britton  Rose, Cactaceae Lý Kiều Hương Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề: Thanh long trồng có suất cao, hoa long sau nở vài ngày, phần bao hoa loại bỏ để tập trung nuôi trái hoa sử dụng nhiều y học dân gian Hoa Thanh long nguyên liệu tiềm tận dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm làm thuốc Để tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng hoa Thanh long, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học (in vitro) Hylocereus undatus (Haw.) Britton  Rose, Cactaceae” thực Phương pháp nghiên cứu: Hoa Thanh long cho ruột trắng sau thụ phấn ngày thu hái tỉnh Bình Thuận Nghiên cứu thành phần hóa học sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng - lỏng, phương pháp sắc kí cột nhanh phương pháp tinh chế, kết tinh dung mơi thích hợp Cấu trúc chất phân lập xác định phổ MS NMR Khảo sát tác dụng chống oxy hóa DPPH SKLM Khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase HMG – CoA reductase in vitro Kết quả: Từ kg bột hoa long chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu 500 ml dịch chiết đậm đặc 53,87 g tủa Tiến hành lắc phân bố lỏng-lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần thu 73,80 g cao petro ether (Hylo A); 10,28 g cao DCM (Hylo B); 3,26 g cao ethyl acetat (Hylo C); 12,42 g cao n-butanol (Hylo D); 50,60 g cao E (Hylo E) Các mẫu cao khơng có tác dụng chống oxi hóa tốt, tác dụng ức chế enzym tyrosinase mức trung bình (Cao H2O (Hylo E) có hoạt tính tốt nhất, nồng độ 100 µg/ml ức chế 36,76 %) Tác dụng ức chế HMG-CoA reductase nồng độ thử nghiệm 100 µg/ml, mẫu thử biểu hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase Sắc ký cột nhanh Hylo T thu chất xác định hexacosan (269,8 mg), chalinasterol (13,53 g), daucosterol (4,13 g), nonacosanol (32 mg), ergost 4,24-(28)dien-3one (11 mg), p-hydroxybenzoic acid (5,8 mg) Sắc ký cột sephadex Hylo C thu benzyl -glucopyranoside (49 mg) Sắc ký cột Hylo B thu chất Hylo (34 mg) dự đoán hợp chất có chứa nitơ Kết luận: Các cao chiết phân đoạn có tác dụng ức chế HMG-CoA reductase nồng độ 100 µg/ml Nghiên cứu thành phần hóa học hoa Thanh long xác định hợp chất hexacosan, chalinasterol, daucosterol, nonacosanol, ergost 4,24(28)dien-3-one, phydroxybenzoic acid, benzyl -glucopyranosid ABSTRACT Thesis of Master of Pharmacy, course: 2017– 2019 INVESTIGATION OF THE CHEMICAL CONSTITUENTS AND BIOLOGICAL EFFECTS OF THE FLOWERS FROM HYLOCEREUS UNDATUS Ly Kieu Huong Supervisor: Dr Tran Thi Van Anh Background: Dargon fruit (Hylocereus undatus) is one of high productivity fruit plants in Vietnam The flower of Hylocereus undatus is commonly used in traditional medicine After a few days of pollination, the sack of flowers were removed to keep the nutrition for the growth of the fruits Therefore, the flower of Hylocereus undatus could be used to make food, cosmetics or medicine The purpose of this study was to investigate the chemical constituents and biological effects of Hylocereus undatus (Haw.) Britton  Rose, Cactaceae for having scientific evidences to prepare for further studies to make product from this plant Materials and methods: The flowers of dragon fruit (white flesh) after 3-days pollination were collected (Binh Thuan province) Phytochemical study: percolation, liquid – liquid extraction, liquid chromatography and recrystallization in suitable solvents The structures of isolated coumpounds were identified by MS, NMR spectroscopy methods Bioactical studies: antioxidant activity using DPPH in TLC; inhibition effects of tyrosinase and HMG - CoA reductase were investigated Results: kg of flower powder was percolated with 96% ethanol to obtain 500 ml of concentrated extract and 53.87 g of precipitate (Hylo T) The ethanol residue was suspended in water and successively extracted with petroleum ether, dicloromethane, ethyl acetate and n-butanol to yield 73.80 g of petroleum ether extract (Hylo A); 10.28 g of DCM extract (Hylo B); 3.26 g of ethyl acetate extract (Hylo C); 12.42 g of n-butanol extract (Hylo D); 50.60 g of the residual (Hylo E) All extracts at concentrations of 50 and 100 µg/ml showed mild tyrosinase inhibitory activity with the strongest is Hylo E (inhibition 36.76 % at concentration of 100 µg/ml) All the extracts also exhibited HMG-CoA reductase at the concentration of 100 µg/ml The precipitate was separated by column chromatography to get six compounds that were elucidated as hexacosane (269.8 mg), chalinasterol (13.53 g), daucosterol (4.13 g), nonacosanol (32 mg), ergost 4,24(28)dien-3-one (11 mg), p-hydroxybenzoic acid (5.8 mg) The ethyl acetate extract was separated by Sephadex chromatography to yield benzyl glucopyranoside (49 mg) The dicloromethane extract was separated by column chromatography to obtain Hylo which was estimated as the compound contained nito Conclusion: All the fractions of Hylocereus undatus exhibited HMG-CoA reductase inhibitory activity at concentration of 100 µg/ml The chemical studies of Hylocereus undatus led to the isolation of hexacosane, chalinasterol, daucosterol, nonacosanol, ergost 4,24(28)dien-3-one, p-hydroxybenzoic acid, benzyl -glucopyranoside MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC SƠ ĐỒ ix MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan chi Hylocereus Vị trí phân loại chi Hylocereus .3 Đặc điểm thực vật Tổng quan Thanh long (Hylocereus undatus) Đặc điểm thực vật Phân bố thu hái Thành phần hóa học Tác dụng dược lý Công dụng dân gian 10 Tổng quan tác dụng chống oxy hóa 10 Khái niệm stress oxy hóa 10 Bản chất hóa học gốc tự 11 Sự hình thành gốc tự oxy thể 11 Một số phương pháp thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa 11 Tổng quan tác dụng ức chế tyrosinase .13 Vai trò tyrosinase 13 Phương pháp nghiên cứu tác dụng ức chế tyrosinase 14 Tổng quan tác động ức chế HMG-CoA reductase 14 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Đối tượng nghiên cứu 18 Nguyên vật liệu, trang thiết bị .18 Phương pháp nghiên cứu .19 Kiểm tra nguyên liệu 19 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 20 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 27 Kiểm tra nguyên liệu 27 So sánh thành phần hóa học hoa các thời điểm 27 Đặc điểm hình thái thực vật 28 Khảo sát vi học .29 Xác định độ tinh khiết 30 Hàm lượng chất chiết 30 Xác định sơ thành phần hóa thực vật hoa long 30 Chiết xuất – tách phân đoạn 31 Khảo sát tác dụng cao toàn phần cao phân đoạn .34 Tác dụng chống oxy hóa DPPH SKLM .34 Tác dụng ức chế tyrosinase 34 Tác động ức chế HMG-CoA reductase .35 Nghiên cứu thành phần hóa học hoa Thanh long 36 Phân tách tủa Hylo T 36 Phân tách cao Hylo C 46 Phân tách cao Hylo B 51 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 53 Hợp chất Hylo 53 Hợp chất Hylo 54 Hợp chất Hylo 57 Hợp chất Hylo 60 Hợp chất Hylo 60 Hợp chất Hylo 63 Hợp chất Hylo 65 i Bàn luận .67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 Kết luận 69 Khảo sát tác dụng sinh học 69 Nghiên cứu thành phần hóa học 70 Kiến nghị .71 Tài liệu tham khảo 72 PHỤ LỤC 76 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ nguyên Ý nghĩa C - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân C13 H - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton Chữ tắt 13 13 HMG-CoA -hydroxyl--methylglutaryl Coenzym A BuOH Butanol CHCl3 Cloroform COSY Correlation spectroscopy DCM Dicloromethan DMSO Dimethyl sulfoxide DEPT Distortionless Enhancement by polarization Transfer 10 DĐVN Dược điểnViệt Nam 11 EtOAc Ethylacetat 12 HSQC Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence 13 HPLC High performance liquid chromatography 14 HMGR HMG-CoA reductase 15 MS Mass spectrometry 16 MeOH Methanol 17 NADPH Nicotiamide adenine dinucleotide phosphate 18 NMR Nuclear Magnetic Resonance 19 SKLM Sắc ký lớp mỏng 20 SEM Standard Error of the Mean C-NMR H-NMR Sắc ký lỏng hiệu cao Khối phổ Cộng hưởng từ hạt nhân Độ sai chuẩn trị số trung bình 21 TT Thuốc thử 22 UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến 23 VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký cột chân không 24 VS Vanillin- acid sulfuric Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-71 Phụ lục 72 Phổ HSQC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-72 Phụ lục 73 Phổ HSQC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-73 Phụ lục 74 Phổ HSQC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-74 Phụ lục 75 Phổ HMBC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-75 Phụ lục 76 Phổ HMBC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-76 Phụ lục 77 Phổ HMBC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-77 Phụ lục 78 Phổ HMBC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-78 Phụ lục 79 Phổ COSY Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-79 Phụ lục 80 Phổ COSY Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-80 Phụ lục 81 Phổ COSY Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-81 Phụ lục 82 Phổ 13C-NMR (DMSO,100 MHz) Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-82 Phụ lục 83 Phổ 1H-NMR (DMSO; 400 MHz) Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-83 Phụ lục 84 Phổ HSQC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-84 Phụ lục 85 Phổ HMBC Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-85 Phụ lục 86 Phổ COSY Hylo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... góp phần nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Hylocereus undatus làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học (in vitro) hoa Thanh. .. cho nghiên cứu ứng dụng hoa Thanh long, đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học (in vitro) Hylocereus undatus (Haw. ) Britton  Rose, Cactaceae? ?? thực Phương pháp nghiên cứu: Hoa. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - LÝ KIỀU HƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC (IN VITRO) CỦA HOA THANH LONG Hylocereus undatus (Haw. )