Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn clorororm của thân xáo tam phân (paramignya trimera) trồng ở đồng nai

Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN CLORORORM CỦA THÂN XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA) TRỒNG Ở ĐỒNG NAI Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đơng Phương Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN CLORORORM CỦA THÂN XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA) TRỒNG Ở ĐỒNG NAI Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương Ký tên Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 2.1 Ngun vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu…… 2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………….4 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………………………….4 3.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn……………………………… 3.2 Khảo sát hệ dung mơi phân tích cao cloroform……………………….6 3.3 Phân lập chất cao CHCl3……………………………………7 3.4 Xác định cấu trúc chất phân lập được……………………………12 III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………………… 17 IV TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh I ĐẶT VẤN ĐỀ: Cây Xáo tam phân có tên khoa học Paramignyatrimera (Oliv.) Burkill, thuộc họ Cam (Rutaceae) phân bố chủ yếu Việt Nam Thái Lan [12] Tại Việt Nam, Xáo tam phân mọc chủ yếu Khánh Hòa, Ninh Thuận Vào năm 2013, tin đồn Xáo tam phân chữa năm loại bệnh ung thư nở rộ, người dân khắp nơi “đua nhau” tìm mua sử dụng, và xem “thần dược” Do nhu cầu Xáo tam phân tăng cao, người dân địa phương nói đổ xơ thu hái Xáo tam phân tự nhiên để bán Hệ của việc khai thác tràn lan này làm cho Xáo tam phân bị tận diệt tự nhiên Do nhu cầu sử dụng Xáo tam phân cao nên số người dân nghiên cứu nhân giống thành công và trồng tập trung vùng đất ven đồi vài huyện của tỉnh Đồng Nai Việc trồng Xáo tam phân mang lại hiệu kinh tế cao, trồng khoảng 3-5 năm là thu hoạch Hiện tại, thị trường giá của Xáo tam phân cao khoảng (5 – triệu đồng/ kg rễ tươi loại tốt; triệu đồng/ kg thân, tươi) Cho tới nay, báo cáo về Xáo tam phân thực hiện chủ yếu rễ mọc tự nhiên về thực vật, hóa học, tác dụng dược lý kiểm nghiệm với nội dung cụ thể sau: - Về thực vật: Báo cáo về hình thái vi học của Xáo tam phân [18] - Về hóa học: Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của số hợp chất thuộc nhóm coumarin, triterpenoid acridon alkaloid [14], [7], [3], [16], [15], [6] - Về tác dụng dược lí: Về tác dụng: Cao chiết methanol, phân đoạn n-hexan hợp chất ostruthin phân lập từ Xáo tam phân có tác dụng ức chế tốt viêm gan cấp thử nghiệm nhuột nhắt trắng; có tác dụng ức chế tiêu diệt dòng tế bào ung thư gồm: ung thư gan Hep-G2, ung thư đại tràng HTC116, ung thư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng OVCAR-8 và ung thư cổ tử cung Hela, tác dụng mạnh ung thư cổ từ cung Hela và ung thư gan Hep-G2 nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan, tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư của Xáo tam phân [13] - Về kiểm nghiệm: Đã có cơng trình nước cơng bố về định lượng ostruthin [1] định lượng đồng thời ostruthin 8-methoxxy ostruthin rễ Xáo tam phân HPLC [5] Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Theo kinh nghiệm dân gian, phận dùng chủ yếu của Xáo tam phân rễ Còn phần mặt đất của Xáo tam phân sử dụng Nếu phần thân có tác dụng tốt phần rễ nâng cao giá trị của Xáo tam phân.Vấn đề đặt phận mặt đất có tác dụng khơng thành phần hóa học của chúng nào? Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn clorororm của thân Xáo tam phân Paramignyatrimera (Oliv.) Burkill Rutaceae” tiến hành góp phần giải đáp phần câu hỏi Đề tài thực hiện với nội dung sau: - Chiết xuất cao toàn phần từ thân Xáo tam phân thu hái Đồng Nai - Tách cao toàn phần thành các phân đoạn đơn giản phân bố lỏng – lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần - Phân lập tinh chế hợp chất phân đoạn CHCl3 - Xác định cấu trúc và định danh hợp chất phân lập Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Ngun vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu thân Xáo tam phân trồng năm lấy mẫu trực tiếp Đồng Nai Sau thu hái, rửa sạch, thái lát mỏng (bằng máy thái dược liệu của sở trồng trọt), sấy nhẹ cho khô xay bột thơ cho chiết xuất (Hình 1.) Thân xáo tam phân trồng Đồng Nai thái lát 2.1.2 Nguyên liệu, dung mơi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu Dung mơi: cồn 96%, n-butanol, diethyl ether, n-hexan, cloroform, ethyl acetat, methanol,… dùng loại AR Trung Quốc sản xuất - Thuốc thử FeCl3 1% KOH 5%/cồn, vanilin-sulfuric (VS) số hóa chất khác - Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn nền nhôm (Merck, Art 1.05554) - Silica gel (HiMedia Laboratories) cỡ hạt 40-63 μm 2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị: - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; àm) v tiờn ct Sunfire C18 (12,5 ì 4,6 mm; µm) - SKLM dùng silica gel F254 tráng sẵn nền nhôm (Merck, Art 1.05554) - SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn (Merck) cỡ hạt 15- 40µm) Máy quay Buchi R300 (Nhật Bản) Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức) Tủ sấy Gallentkamp (Anh) Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức) Cột sắc ký dụng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh cụ thí nghiệm thơng thường phịng thí nghiệm của Bộ mơn Dược liệu Phịng nghiên cứu hóa hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo nghiên cứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH Y Dược Tp HCM - Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters) - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt nam - Hà nội - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; àm) v tiờn ct Sunfire C18 (12,5 ì 4,6 mm; µm) - Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng máy HPLC 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn - Bột thân Xáo tam phân chiết ngấm kiệt với cồn 96%, cô thu hồi dung môi áp suất giảm, thu cao lỏng - Cao lỏng lắc phân bố với dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, bao gồm: n-hexan, cloroform, n-butanol, cô áp suất giảm cho cao tương ứng: n-hexan, cao cloroform, cao n-butanol và cao nước Sử dụng cao CHCl3 để phân lập hợp chất 2.2.2 Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform - Tiến hành SKLM khảo sát hệ dung môi khác - Chọn hệ dung mơi phân tích cho kiểm tra phân đoạn chất tinh khiết - Chọn hệ dung môi cho SKC 2.2.4 Phân lập 2.2.4.1 SKC chân không (VLC): Điều kiện SK phần thực nghiệm 2.2.4.2 Phân lập SKC cổ điển: Điều kiện SK phần thực nghiệm - Tinh chế: Các phân đoạn sau cô quay kết tinh hay kết tinh phân đoạn lượng tối thiểu dung mơi thích hợp (có gia nhiệt) Kiểm tra chất kết tinh SKLM với hệ dung môi khác 2.2.5 Kiểm tra độ tinh khiết SKLM: Điều kiện SK phần thực nghiệm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2.2.6 Xác định cấu trúc chất phân lập - Chất tinh khiết phân tích phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA, NMR, so sánh đối chiếu với liệu về phổ NMR, MS của chất tương tự công bố tài liệu - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo máy BRUKER – AV – 500, Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội Mẫu hòa tan CD3OD CD3COCD3 với TMS chất chuẩn nội Phổ proton (1H-NMR) đo 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) đo 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn tín hiệu của TMS Các số ghép (J) tính Hertz (Hz) III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn Bột thân Xáo tam phân (5,3 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 96% (90 lít), thu hồi dung mơi áp suất giảm, thu 430 ml cao lỏng (d = g/ml) Cao lỏng lắc phân bố với dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, bao gồm: nhexan, cloroform, n-butanol Các dịch sau lắc phân bố cô áp suất giảm cho cao n-hexan (Ho, 36g), cao cloroform (19 g), cao n-butanol (39,7g) và cao nước (92g) Sơ đồ chiết xuất trình bày Hình 3.1 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình 0.1 Sơ đồ chiết xuất thân xáo tam phân 3.2 Khảo sát hệ dung mơi phân tích cao cloroform Tiến hành phân tích cao CHCl3 SKLM với hệ dung môi khác nhau, phát hiện soi UV 365, 254 nm và phun thuốc thử VS Kết bảng đây: Bảng 0.1 Thăm dò hệ dung mơi sắc kí phân tích cao cloroform Hệ dung môi Số vết Rf Khả tách Ghi n-hexan 0 n-hexan – CHCl3 (2:8) 0,45 + Kéo vệt n-hexan – EtOAc (6:4) 0,4 Kéo vệt CHCl3 0,55 + Kéo vệt EtOAc 0,8 + Kéo vệt CHCl3 – EtOAc (9:1) 0,7 ++ Khá tốt CHCl3 – EtOAc (8:2) 10 0,85 +++ Tốt Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CHCl3 – EtOAc (7:3) 0,9 Khá tốt ++ Từ kết thăm dò trên, chọn hệ dung môi CHCl3 – EtOAc (8:2) làm hệ dung mơi phân tích cho tồn q trình phân lập chất cao CHCl3 3.3 Phân lập chất cao CHCl3 Tiến hành phân lập chất cao CHCl3 sắc ký cột chân không (VLC) 3.3.1 Thăm dị dung mơi cho VLC SKLM cao CHCl3 với hệ dung môi: n-hexan – cloroform (5:5), n-hexan – CHCl3 (2:8) CHCl3 (100%) Kết chọn hệ n-hexan – cloroform (5:5) có khả tách tốt chất cao - Phát hiện: soi UV 365 nm, UV 254 nm, thuốc thử VS Dựa vào UV 365 nm, đặt tên vết có giá trị Rf từ cao đến Rf thấp hệ cloroform – EtOAc (8:2) Kết trình bày Bảng 3.2 Bảng 0.2 Kết phân tách qua cột VLC Phân đoạn P (mg) 1-4 (I) 100 mg n-hexan – CHCl3 5-7 (II) 195 mg (5 : 5) 8-9 (III) 110 mg 10-13 (IV) 280 mg 14-20 (V) 210 mg 21-24 (VI) 140 mg 25-27 (VII) 95 mg 28-32 (VIII) 420 mg 33-40 (IX) 360 mg n-hexan – CHCl3 41-45 (X) 450 mg (0:10) 4650 (XI) 360 Dung môi n-hexan – CHCl3 (4:6) n-hexan – CHCl3 (3:7) n-hexan – CHCl3 (2:8) n-hexan – CHCl3 (1:9) Thành phần 7 8 9 10 10 Tạp Nhận xét: - Phân đoạn V giàu vết tiếp tục phân lập chất cột cổ điển Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Phân đoạn VIII giàu vết 7, 9, 10 tiếp tục phân lập qua cột cổ điển - Phân đoạn IX giàu vết 9, 10 tiếp tục phân lập qua cột cổ điển - Các phân đoạn cịn lại có thành phần phức tạp hay có khối lượng nhỏ 3.3.2 Phân lập chất từ phân đoạn V VLC cột cổ điển (CĐ1) Thăm dị dung mơi sắc ký: Phân đoạn V sắc ký lớp mỏng với số hệ dung môi và chọn hệ dung môi n-hexan – EtOAc (6:4) có khả tách tốt cho hợp chất phân đoạn của cột VLC Phân đoạn V sắc ký cột cổ điển (SKC) với điều kiện: - - Cột 2×25 cm, nạp 12 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch dung môi n-hexan – EtOAc (6:4) Mẫu thử: 210 mg phân đoạn V hòa lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ giọt lên 200 mg silica gel hạt vừa (40-63 μm), trộn đều sấy tủ sấy chân không để tạo bột khô, tơi xốp nạp mẫu khơ Pha động: n-hexan – EtOAc (6:4) Thể tích hứng phân đoạn ml Theo dõi thành phần của phân đoạn SKLM với dung môi khai triển CHCl3-EtOAc (8:2), phát hiện UV 254, 365 nm thuốc thử VS Gộp phân đoạn chứa riêng chất - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS Kết sắc ký: Sau sắc ký thu phân đoạn (VA → VF), đó: - Phân đoạn VD (50 mg) có thành phần chất 8, xử lý tiếp tục để lấy chất tinh khiết - Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay phức tạp, khơng tiếp tục xử lý Tinh chế chất 8: Phân đoạn VD quay tủa hình cầu gai vàu vàng xanh, kết tinh lại methanol tinh thể hình cầu gai của chất 8, lọc rửa với nhexan, MeOH lạnh thu chất (12 mg) dạng tinh khiết Đặt tên PT-T8 3.3.2 Phân lập chất từ phân đoạn VIII VLC cột cổ điển (CĐ2) • Thăm dị dung mơi sắc ký: Phân đoạn VIII SKLM với nhiều hệ dung môi và chọn dung môi n-hexan : EtOAc (6:4) chạy lặp lại có khả tách tốt Phát hiện UV 254, 365 nm thuốc thử VS • Tiến hành phân lập phân đoạn VIII sắc ký cột cổ điển với điều kiện: - 400 mg phân đoạn VIII hòa lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ giọt Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh lên 400 mg silica gel hạt vừa (40-63 μm), trộn đều tạo bột khô, tơi, sấy tủ sấy chân không nạp mẫu khô lên cột - Cột SK, 2×25 cm, nạp 24 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch dung môi n-hexan – EtOAc (6:4) - Pha động: n-hexan – EtOAc (6:4) Thể tích hứng phân đoạn ml - Theo dõi thành phần của phân đoạn SKLM với dung môi khai triển CHCl3 – EtOAc (8:2), phát hiện UV 254, 365 nm thuốc thử VS Gộp phân đoạn chứa chất - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm thuốc thử VS - Kết sắc ký phân đoạn VIII: Thu phân đoạn VIIIA → VIIIG Nhận xét - Phân đoạn VIIID (80 mg) có thành phần vết xử lý tiếp tục để lấy chất tinh khiết - Các phân đoạn khác phức tạp, khơng tiếp tục xử lý • Phân lập chất từ phân đoạn VIIID của cột CĐ2 SKC cổ điển - Thăm dị dung mơi sắc ký: Phân đoạn VIIID sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi và chọn hệ dung môi CHCl3 : EtOAc (8:2), khai triển lặp lại lần có khả tách tốt, phát hiện UV 254, 365 nm, thuốc thử VS Tiến hành phân lập phân đoạn VIIID SKC cổ điển (SKC) với điều kiện: - Mẫu sắc ký: Phân đoạn VIIID (80 mg) hòa lượng tối thiểu dung môi CHCl3 - EtOAc (8:2) nạp mẫu ướt - Cột 1×20 cm, nạp g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch dung môi CHCl3 : EtOAc (8:2) - Pha động: CHCl3 : EtOAc (8:2) Thể tích hứng phân đoạn ml - Tiến hành SKC theo dõi thành phần của phân đoạn SKLM với dung môi CHCl3 – EtOAc (6:4), phát hiện UV 254, 365 nm thuốc thử VS Gộp phân đoạn chứa riêng chất - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS Kết quả: Sau SKC thu phân đoạn từ D1 đến D3, đó: - Phân đoạn D3 chứa chất (20mg), kết tinh lại ethylacetat, lọc rửa với n- Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 10 hexan, MeOH lạnh thu chất (10mg) dạng tinh khiết, đặt tên PT-T9 - Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay phức tạp, không tiếp tục xử lý 3.3.3 Phân lập chất từ phân đoạn IX của cột VLC cột cổ điển (CĐ4) - Thăm dị dung mơi sắc ký: Phân đoạn IX sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, chọn dung mơi CHCl3 : EtOAc (9:1) có khả tách tốt Phát hiện UV 254, 365 nm, thuốc thử VS - Tiến hành phân lập phân đoạn IX SKC với với điều kiện sau: - 350 mg IX hòa lượng tối thiểu dung môi CHCl3 : EtOAc (9:1), nạp cột theo phương pháp nạp mẫu ướt - Cột 2×25 cm, nạp 21g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch (dung môi CHCl3 : EtOAc (9:1)) - Pha động: CHCl3 : EtOAc (9:1) Thể tích hứng phân đoạn ml Tiến hành SKC theo dõi thành phần của phân đoạn SKLM với dung môi khai triển CHCl3 – EtOAc (7:3), phát hiện UV 254, 365 nm Gộp phân đoạn chứa chủ yếu chất 10 - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS Kết quả: Sau SKC thu phân đoạn (IXA→IXG), đó: - Phân đoạn IXD chứa chủ yếu chất 10 (90mg) - Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay phức tạp, không tiếp tục xử lý 3.3.4 Phân lập chất từ phân đoạn IXD của cột CĐ4 cột cổ điển (CĐ5) - Thăm dị dung mơi sắc ký: Phân đoạn IXD sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, chọn dung mơi n-hexan : EtOAc (6:4) có khả tách tốt Phát hiện UV 254, 365 nm, thuốc thử VS - Tiến hành phân lập Phân đoạn IXD sắc ký cột cổ điển (SKC) với điều kiện: - 90 mg IXD hòa lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ giọt lên lượng tối thiểu silica gel hạt mịn vừa (40-63 μm), trộn đều tạo bột khô, tơi, sấy tủ sấy chân không Mẫu sau nạp khơ vào cột - Cột 1×20 cm, nạp g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch dung môi n-hexan : EtOAc (6:4) - Pha động: C5 = n-hexan : EtOAc (6:4) Thể tích hứng phân đoạn ml Tiến hành phân lập trê SKC, theo dõi thành phần của phân đoạn SKLM với 10 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 11 dung mơi khai triển n-hexan – EtOAc (3:7), phát hiện UV 254, 365 nm thuốc thử VS Gộp phân đoạn chứa chất 10 Kết quả:Sau sắc ký thu phân đoạn (Da→Dg), đó: - Phân đoạn Dc sau quay dung môi, thu hợp chất PT9 (10 mg) có dạng dầu Các phân đoạn khác phức tạp, khơng tiếp tục xử lý Q trình phân lập tinh chế chất từ cao cloroform của Thân Xáo tam phân tóm tắt qua Hình 3.3 Hình 0.3 Tóm tắt q trình phân lập chất từ cao cloroform 11 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 12 3.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết của PT-T8, PT-T9, PT-T10 Tiến hành: khai triển sắc kí lớp mỏng chất phân lập với hệ dung môi P1, P2, P3 (Bảng 3.3.), phát hiện UV 254, 365 nm nhúng thuốc thử VS; PT-T8, PT-T9, PT-T10 cho vết Kết sắc ký thể hiện Hình 3.4 Bảng 0.3 Các hệ dung môi kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập Hệ dung môi PT-T8 PT-T9 PT-10 CHCl3– EtOAc (8:2) Rf = 0.355 Rf = 0.352 Rf = 0.253 n-hexan – EtOAc (6:4) Rf = 0.165 Rf = 0.175 Rf = 0.125 CHCl3 Rf = 0.125 Rf = 0.075 Rf = 0.05 Nhận xét: - Dưới UV 365 nm, PT-T8, PT-T9, PT-T10 phát quang xanh da trời Khi tác dụng với thuốc thử VS, PT-T8 không cho màu, PT-T9 cho màu xanh lục nhạt, PT-T10 cho màu xanh dương nhạt Có thể sơ kết luận PT-T8, 9, 10 coumarin 3.4 Xác định cấu trúc chất phân lập 3.4.1 Xác định cấu trúc hợp chất PT-T8 - PT-T8 thu dạng tinh thể hình cầu gai (trong methanol) có màu vàng xanh, tan tốt CHCl3, tan ethyl acetat, tan vừa methanol, không tan n-hexan - Dưới UV 254/365 nm; PT-T8 cho vết phát quang màu xanh da trời PT-T8 không cho màu với thuốc thử VS - Phổ UV của PT-T8 đo MeOH cho λmax 202,2 332,9 nm - Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T8 cho mảnh m/z 245 tương ứng với ion [M−H]− [PL-4] Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T8 cho mảnh m/z 247 tương ứng với ion [M+H]+ [PL-4] Suy số khối của PT-T8 M = 246 - Phổ NMR của PT-T8 cho thấy hiện diện của 14 tín hiệu carbon, đó: - nhóm –CH3 (δC 17,7 ppm) - nhóm >CH2 (δC 35,8; 110,1 ppm) - nhóm =CH- (δC 73,4; 101,5; 111,2; 130,5 144,6 ppm) 12 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 13 - carbon bậc 4, đó: nhóm CIV sp3 (δC 110,8; 123,6; 147,9; 153,8; 159,4 ppm) nhóm >C=O (δC 160,6 ppm) - Các liệu phổ NMR của PT-T8 trình bày Bảng 3.4 Bảng 0.4 Dữ liệu phổ NMR PT-T8 PT-T8 (DMSO-d6) C DEPT δc ppm δH ppm, m (J, Hz) HMBC (H → Cn) COSY (H → Hn) C 160,6 − − − CH 111,2 6,16 d (9,5) 2; 10 4 CH 144,6 7.89 d (9,5) 2, 9, 5, 10 CH 130,5 7,39 s 7; 9; 4; 8; 1’ − C 123,6 − − − C 159,4 − − − CH 101,5 6,72 s 7; 9; 6; 10 − C 153,8 − − − 10 C 110,8 − − − 1’ CH2 35,8 2,79 dd (13,5; 5) 2.61 dd (13.5; 7.5) 7; 3’; 5; 6; 2’ 2’ 2’ CH 73,4 4,18 m 3’; 4’; 1’; 5’; 1’ 3’ C 147,9 − − − 4’ CH2 110,1 4,77 m 4,68 m 2’; 5’; − 5’ CH3 17,7 1.72 s 3’; 4’; 2’ − 5' 2' 4' 3' HO 10 1' H HO O O Hình 0.4 Cấu trúc PT-T8 Từ phân tích liệu phổ MS và NMR của PT-T8, xác định chất này là 7-hydroxy6-(2’-hydroxy-3’-methylbut-3’-enyl)coumarin Chất này phân lập từ phần mặt đất Amyris balsamifera [21] 3.4.2 Xác định cấu trúc hợp chất PT-T9 - PT-T9 thu dạng bột vô định hình (trong ethylacetat) có màu vàng nhạt, 13 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 14 tan tốt CHCl3, tan vừa methanol ethylaceatat, không tan nhexan - Dưới UV 254/365 nm; PT-T9 cho vết phát quang màu xanh da trời PT-T9 cho màu xanh lục nhạt với thuốc thử VS - Phổ UV của PT-T9 đo MeOH cho λmax 203,4 334,1 nm [PL-2] - Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T9 cho mảnh m/z 313 tương ứng với ion [M−H]− [PL-5] Suy số khối của PT-T9 M = 314 - Phổ NMR của PT-T9 cho thấy hiện diện của 19 tín hiệu carbon, đó: - nhóm –CH3 (δC 16,1; 17,6 ppm) - nhóm >CH2 (δC 27,3; 33,3; 35,3; 109,9 ppm) - nhóm =CH- (δC 73,5; 101,6; 111,2; 121,5; 128,4 144,6 ppm) - carbon bậc 4, đó: nhóm CIV sp3 (δC 111; 125,6; 136; 148,2; 153,7; 159 ppm) nhóm >C=O (δC 160,6 ppm) - Dữ liệu phổ NMR của PT-T9 trình bày Bảng 3.5 Bảng 0.5 Dữ liệu phở NMR PT-T9 PT-T9 (DMSO-d6) C DEPT δc ppm δH ppm, m (J, Hz) HMBC (H → Cn) COSY (H → Hn) C 160,6 − − − CH 111,2 6,16 d (9) 2; 10 4 CH 144,6 7.9 d (9,5) 2; 9; 5 CH 128,4 7,33 s 7; 9; 4; 1’ − C 125,6 − C 159,0 − − − CH 101,6 6,74 s 7; 9; 6; 10 − C 153,7 − − − 10 C 111 − − − 1’ CH2 27,3 3,24 d (7,5) 2’; 3’; 5; 6; 2’ 2’ CH 121,5 5,28 m 1’; 4’; 10’ 1’ 3’ C 136,0 − 4’ CH2 35,3 2,03 m 1,93 m 2’; 3’; 5’; 10’ 5’ 5’ CH2 33,3 1,51 m 4’; 6’ 4’; 6’ − − 14 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 15 6’ CH 73,5 3,84 m 8’ − 7’ C 148,2 − − − 8’ CH2 109,9 4,83 m 4,71 s 6’; 9’ − 9’ CH3 17,6 1,62 s 6’; 7’; 8’ − 10’ CH3 16,1 1,66 s 2’; 3’; 4’ − − -OH 4,68 d (4) 6’ − − -OH 10,61 s − − 9' 7' 8' HO 10' 2' 4' 6' 5' 3' 10 1' H HO O O Hình 0.5 Cấu trúc PT-T9 Từ phân tích liệu phổ MS NMR của PT-T9, xác định chất 6-(6’hydroxy-3’,7’-dimethylocta-2’,7’-dienyl)-7-hydroxycoumarin Chất này Nguyen Manh Cuong cộng phân lập rễ Xáo tam phân [31] 3.4.3 Xác định cấu trúc hợp chất PT-T10 - PT-T10 thu dạng dầu (trong ethylacetat) có màu vàng nhạt, tan tốt CHCl3, tan vừa methanol ethylaceatat, không tan n-hexan - Dưới UV 254/365 nm; PT-T10 cho vết phát quang màu xanh da trời PT-T10 cho màu xanh lục nhạt với thuốc thử VS - Phổ UV của PT-T10 đo MeOH cho λmax 203,4 332,3 nm [PL-3] - Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T10 cho mảnh m/z 313 tương ứng với ion [M−H]− [PL-6] Suy số khối của PT-T10 M = 314 - Phổ NMR của PT-T10 cho thấy hiện diện của 19 tín hiệu carbon, có: - nhóm –CH3 (δC 15,9; 30,1 ppm) - nhóm >CH2 (δC 27,4; 41,9 ppm) - nhóm =CH- (δC 101,6; 111,3; 123,3; 123; 128,4; 140,8 144,6 ppm) - carbon bậc 4, đó: nhóm CIV sp3 (δC 68,8; 111; 125,5; 135,1; 153,7; 159 ppm) nhóm >C=O (δC 160,6 ppm 15 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 16 - Dữ liệu phổ NMR của PT-T10 trình bày Bảng 3.6 Bảng 0.6 Dữ liệu phở NMR PT-T10 PT-T10 (DMSO-d6) C DEPT C δc ppm 160,6 CH δH ppm, m (J, Hz) HMBC (H → Cn) COSY (H → Hn) − − − 111,3 6,16 d (9,5) 2; 10 CH 144,6 7,88 d (9,5) 2; 9; 5 CH 128,4 7,33 s 7; 9; 4; 1’ − C 125,5 − − − C 159 − − − CH 101,6 6,74 s 6; 7; 9; 10 − C 153,7 − − − 10 C 111 − − − 1’ CH2 27,4 3,25 d (7) 2’; 3’; 5; 6; 10 2’ 2’ CH 122,3 5,32 m 1’; 4’; 10’ 1’ 3’ C 135,1 − − − 4’ CH2 41,9 2,65 d (7) 2’; 3’; 5’; 6’ 5’ 5’ CH 123 5.47 m 4’, 6’, 7’ 4’ 6’ CH 140,8 5,56 4’; 5’; 7’; 8’; 9’ − 7’ C 68,8 − − − 8’, 9’ CH3 30,1 1.15 s 6’ ; 7’ − 10’ CH3 15,9 1,65 s 2’; 3’; 4’ − 10,62 s 6; 7; − OH 9' HO 8' 10' 7' 2' 4' 6' 5' 3' 10 1' HO O O Hình 0.6 Cấu trúc PT-T10 Từ phân tích liệu phổ MS NMR của PT-T10, xác định chất 6-(7′hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,5′-dienyl)-7-hydroxycoumarin Chất này Makio Shibano cộng phân lập Ligusticum involucratum [22] 16 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 17 IV KẾT LUẬN Đề tài đạt kết sau: Chiết xuất: Từ 5,3 kg bột thân Xáo tam phân chiết ngấm kiệt với cồn 96% (90 lít), thu hồi dung mơi áp suất giảm, thu 430 ml cao lỏng Cao lỏng lắc phân bố với dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, cô áp suất giảm cho cao tương ứng, bao gồm: n-hexan (36g), cao cloroform (19 g), cao n-butanol (39,7g) cao nước (92g) Phân lập: Từ 17 g cao CHCl3, kỹ thuật sắc ký VLC, SKC Silica-gel và phương pháp tinh chế phù hợp phân lập hợp chất ký hiệu là PT-T8 (12 mg), PT-T9 (10 mg) và PT-T10 (15 mg) Xác định cấu trúc Bằng khảo sát phổ học (UV, MS, 1D- và 2D-NMR) xác định cấu trúc hóa học của PT-T8, PT-T9 và PT-T10 7-hydroxy-6-(2’-hydroxy-3’-methylbut-3’enyl) coumarin, 6-(6′-hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,7′-dienyl)-7-hydroxycoumarin, 6-(7′hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,5′-dienyl)-7-hydroxycoumarin chất clần báo cáo thành phần của Xáo tam phân Cả chất đều thuộc nhóm coumarin có chung khung cấu trúc umbelliferon Ba chất khác cấu tạo mạch nhánh vị trí số của khung umbelliferon Đây là báo cáo về thành phần hóa học của phần thân Xáo tam phân chưa có cơng trình nghiên cứu về thân của 17 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phạm Huy Bách, Vũ Văn Tuấn, Nguyễn Thị Hà Ly, Nguyễn Minh Khởi , Phạm Thiên Thương (2013), "Phân lập và định lượng ostruthin dược liệu xáo tam phân thu hái Việt Nam", Tạp Chí Dược Liệu 18 (3), pp 173-178 2 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Mạnh Cường, Hồ Việt Đức, Nguyễn Văn Tài, Phạm Ngọc Khanh, Vũ Thị Hà, Trần Thu Hường , Nguyễn Duy Nhất (2013), "Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học Xáo tam phân họ Rutaceae", Tạp Chí Hóa Học 51 (3), pp 292-296 Võ Văn Chi , T.H ( 1999), Cây cỏ có ích Việt Nam, Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thị Ngọc Dung, Trần Thị Thúy Quỳnh, Phạm Đông Phương , Vĩnh Định (2015), "Định lượng đồng thời ostruthin 8-methoxyostruthin rễ xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao", Tạp chí Dược học 476, pp 934-938 Trịnh Hoàng Dương, Trần Thu Phương, Hà Diệu Ly, Nguyễn Thụy Vy, Đặng Văn Sơn , Nguyễn Diệu Liên Hoa (2016), "Coumarin acridon alkaloid từ rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera)", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 32 (4), pp 115-123 Bùi Trọng Đạt, Nguyễn Thanh Hồng, Lê Tiến Dũng, Nguyễn Hữu An , Mai Đình Trị (2013), "Một coumarin chromene phân lập từ rễ Xáo tam phân Paramignya trimera", Tạp Chí Hóa Học 51 (4AB), pp 362-365 Trương Thị Đẹp (2009), Thực vật dược, Nhà xuất giáo dục, pp 250 Trần Giỏi , Lưu Hồng Trường (2012), Cây thuốc quý Hòn Hèo (Khánh Hịa) loại ?, Báo Khoa học phổ thông thứ 6, ngày 11/05/2012, 10 Bùi Thu Hà (2012), Nghiên cứu phân loại họ Cam (Rutaceae Juss.) Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học - Hà Nội 11 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ việt nam, pp 437-439 12 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Vol 2, Nxb Trẻ, 13 Nguyễn Minh Khởi, Phạm Thị Nguyệt Hằng , Đỗ Thị Phương (2013), "Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan tác dụng gây độc tế bào ung thư của Xáo tam phân", Tạp Chí Dược Liệu 18 (1) 14 Bùi Thị Thùy Linh, Đặng Hoàng Phú , Nguyễn Trung Nhân (2015), "Khảo sát thành phần hóa học cao chloroform của thân xáo tam phân - Paramignya trimera (Oliver) Burkill) Họ Rutaceae", Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học 20 (4) 15 Trần Thị Thúy Quỳnh, Lê Thị Kim Thoa , Phạm Đông Phương (2014), "Phân lập số hợp chất coumarin rễ xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill)", Tạp chí Dược học 54 (5), pp 60-66 16 Trần Thị Thúy Quỳnh, Nguyễn Trung Dũng , Phạm Đông Phương (2014), "Phân lập vài 18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 19 hợp chất acridon alcaloid rễ xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill)", Tạp chí Dược học v, pp 61-64 17 Hồng Thị Sản (2003), Phân loại học thực vật, NXB Giáo Dục, pp 147-148 18 Trần Thị Thu Trang, Trần Trung Thạch, Trần Hợp , Trương Thị Đẹp (2016), "Đặc điểm hình thái vi học Xáo tam phân - Paramignya trimera (Oliv.) Guillaumin, họ Rutaceae", Tạp chí Y học TpHCM(2), pp 333-337 19 Lưu Hồng Trường , Võ Duẩn (2013), "Chi Paramignya (Rutaceae) triển vọng dược liệu", Khoa học công nghệ phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, pp 97100 20 Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật – Trung tâm Khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia (2003), Danh lục lồi thực vật Việt Nam, Vol 2, Nơng nghiệp, TÀI LIỆU TIẾNG ANH 21 Burke B A , Parkins H (1978), Phytochemistry, Vol 13, pp 1073—1075 22 Makio Shibano, Ayako Okuno, Masahiko Taniguchi, Kimiye Baba , Nian-He Wang (2005), "Bisabolane-Type Sesquiterpenes: Liginvolones A-D from Ligusticum involucratum", journal of natural products 68 (10) 23 A , J.D.M (1982), "Medicinal Plants (Indigenous and Exotic) Used in Ceylon", A publication of the National Science Council of Sri Lanka Part V 24 Arthur Cronquist (1988), The Evolution and Classification of Flowering Plants,, The New York Botanical Garden, New York, pp 403 25 Armen Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer, 26 Chatchai Wattanapiromsakul , Peter G Waterman (2000), "Flavanone, triterpene and chromene derivatives from the stems of Paramignya griffithii", Phytochemistry 55 (3), pp 269-273 27 D.X Zhang, T.G Hartley , D.J Mabberley (2008), "Rutaceae, Flora of China", pp 11- 88 28 Ian H Bowen , Yogeshkumar N Patel (1998), "Phytochemical analysis of the leaves and stems of Paramignya monophylla Wight (Rutaceae)", Journal of Pharmacy and Pharmacology 50 (S9), pp 232-232 29 Kumar, V., N.M.M Niyaz, S Saminathan , D.B.M Wickramaratne (1998), "Coumarins from stem bark of Paramignya monophylla", Phytochemistry 49 (1), pp 215-218 30 Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Pham Thi Mai Huong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem , Chau Van Minh (2014), "Two tirucallane derivatives from Paramignya sacandens and their cytotoxic activity", Phytochemistry Letters 9, pp 78-81 31 Nguyen Manh Cuong, Tran Thu Huong, Pham Ngoc Khanh , Young Ho Kim (2015), "Paratrimerins A and B, two new dimeric Monoterpene-Linked coumarin glycosides from the roots and stems of Paramignya trimera", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, pp 945949 19 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 20 32 Robert Wight , Might (1839), Illustrations of Indian botany, Vol 1, 33 Vijaya Kumar, N M Mohammed Niyaz, D B Mahinda Wickramaratneand , Sinnathamby Balasubramaniam (1991), "Tirucallane derivatives from Paramignya monophylla fruits", Phytochemistry 30 (4), pp 1231-1233 34 Vijaya Kumar, N M Mohamed Niyaz , D B Mahinda Wickramaratne (1995), "Coumarins from stem bark of Paramignya monophylla", Phytochemistry 38 (3), pp 805-806 35 Vijaya Kumar, N M Mohamed Niyaz , Shanthini Saminathanand D B Mahinda Wickramaratne (1998), "Coumarins from Paramignya monophylla root bark", Phytochemistry 49 (1), pp 215-218 36 Wiart , C (2006), "Medicinal Plant of Asia-Pacific-Drugs for the Future Vol Library Cataloguing-in-Publication Data", World Scientific Publishing Co Pte Ltd., pp 380 20 ... tam phân rễ Còn phần mặt đất của Xáo tam phân sử dụng Nếu phần thân có tác dụng tốt phần rễ nâng cao giá trị của Xáo tam phân. Vấn đề đặt phận mặt đất có tác dụng khơng thành phần hóa học của... chúng nào? Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn clorororm của thân Xáo tam phân Paramignyatrimera (Oliv.) Burkill Rutaceae” tiến hành góp phần giải đáp phần câu hỏi Đề tài thực... toàn phần từ thân Xáo tam phân thu hái Đồng Nai - Tách cao toàn phần thành các phân đoạn đơn giản phân bố lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần - Phân lập tinh chế hợp chất phân đoạn