Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n hexan của thân xáo tam phân (paramignya trimera) trồng tại đồng nai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN N-HEXAN CỦA THÂN XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA) TRỒNG TẠI ĐỒNG NAI Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN N-HEXAN CỦA THÂN XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA) TRỒNG TẠI ĐỒNG NAI Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương Ký tên Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………… II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… .2 2.1 Ngun vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu…… 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………… 3.1 Kết thử tinh khiết và hàm lượng chất chiết được…………… 3.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật của thân Xáo tam phân…6 3.3 Chiết xuất …………………………………………………………7 3.4 Phân lập phân đoạn cao n-hexan……………………… 3.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập ……………………… 14 3.6 Xác định cấu trúc chất phân lập được……………………….14 III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………… 18 IV TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 20 I ĐẶT VẤN ĐỀ: Cây Xáo tam phân có tên khoa học Paramignya trimera (Oliv.) Burkill, thuộc họ Cam (Rutaceae) phân bố chủ yếu Việt Nam Thái Lan [12] Tại Việt Nam, Xáo tam phân mọc chủ yếu Khánh Hòa, Ninh Thuận Vào năm 2013, tin đồn Xáo tam phân chữa năm loại bệnh ung thư nở rộ, người dân khắp nơi “đua nhau” tìm mua sử dụng, và xem “thần dược” Do nhu cầu Xáo tam phân tăng cao, người dân địa phương nói đổ xơ thu hái Xáo tam phân tự nhiên để bán Hệ của việc khai thác tràn lan này làm cho Xáo tam phân bị tận diệt tự nhiên Do nhu cầu sử dụng Xáo tam phân cao nên số người dân nghiên cứu nhân giống thành công và trồng tập trung vùng đất ven đồi vài huyện của tỉnh Đồng Nai Việc trồng Xáo tam phân mang lại hiệu kinh tế cao, trồng khoảng 3-5 năm là thu hoạch Hiện tại, thị trường giá của Xáo tam phân cao khoảng (5 – triệu đồng/ kg rễ tươi loại tốt; triệu đồng/ kg thân, tươi) Cho tới nay, báo cáo về nghiên cứu Xáo tam phân thực hiện rễ về nội dung: - Về thực vật: Báo cáo về hình thái vi học của Xáo tam phân [18] - Về hóa học: Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của số hợp chất thuộc nhóm coumarin, triterpenoid acridon alkaloid [14], [7], [3], [16], [15], [6] - Về tác dụng dược lí: Về tác dụng: Cao chiết methanol, phân đoạn n-hexan hợp chất ostruthin phân lập từ Xáo tam phân có tác dụng ức chế tốt viêm gan cấp thử nghiệm nhuột nhắt trắng; có tác dụng ức chế tiêu diệt dòng tế bào ung thư gồm: ung thư gan Hep-G2, ung thư đại tràng HTC116, ung thư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng OVCAR-8 và ung thư cổ tử cung Hela, tác dụng mạnh ung thư cổ từ cung Hela và ung thư gan Hep-G2 nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan, tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư của Xáo tam phân [13] - Về kiểm nghiệm: Đã có cơng trình nước cơng bố về định lượng ostruthin [1] định lượng đồng thời ostruthin 8-methoxxy ostruthin rễ Xáo tam phân HPLC [5] Theo kinh nghiệm dân gian, phận dùng chủ yếu của Xáo tam phân rễ Còn phần mặt đất của Xáo tam phân sử dụng Nếu phần thân có tác dụng tốt phần rễ nâng cao giá trị của Xáo tam phân.Vấn đề đặt phận mặt đất có tác dụng khơng thành phần hóa học của chúng nào? đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n-hexan từ thân Xáo tam phân Paramignya trimera (Oliv.) Burkill Rutaceae” thực hiện với nội dung sau: - Thử tinh khiết và phân tích sơ thành phần hóa thực vật - Chiết xuất cao toàn phần từ thân Xáo tam phân thu hái Đồng Nai - Tách phân đoạn phân bố lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần - Phân lập tinh chế hợp chất phân đoạn n-hexan - Xác định cấu trúc và định danh hợp chất phân lập II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Ngun vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu - Xáo tam phân (Paramignya trimera) trồng năm thu hái Đồng Nai Sau thu hái, rửa sạch, thái lát mỏng (bằng máy thái dược liệu của sở trồng trọt), sấy nhẹ cho khô xay thành bột với độ mịn vừa phải thích hợp cho chiết xuất Hình 0.1 Thân Xáo tam phân thu hái Đồng Nai 2.1.2 Nguyên liệu, dung mơi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu Stt Tên hóa chất, dung mơi Cồn 96% 2 Hãng sản xuất Xuất xứ VN-CHEMSOL Việt Nam Diethyl eter Xilong Chemical Trung Quốc n-hexan Xilong Chemical Trung Quốc Cloroform Labscan Thái Lan Ethyl acetat Guanghua Sci-Tech Trung Quốc n-butanol VN-CHEMSOL Việt Nam Methanol Xilong Chemical Trung Quốc Methanol Merck Đức Silica gel (37 - 63µm) HiMedia Laboratories Ấn Độ TLC silica gel F254 Merck Đức 10 Vanilin Merck Đức 11 Acetonitril Merck Đức 2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị: Stt - Tên thiết bị Model Xuất xứ CP-2250 Sartorius (Đức) Máy xác định độ ẩm MB45 Ohaus (Thụy Sĩ) Máy cô quay 20 lít R220 Büchi (Nhật Bản) Máy quay lít 210S Büchi (Nhật Bản) Bể siêu âm Sonorex RK – 1028H Bandelin (Đức) Tủ sấy chân không Bếp cách thủy Đèn UV bước sóng 254/ 365 Máy ly tâm Cân phân tích Sartorius Gallentkamp (Anh) WB-14 Memmert (Đức) CN-15_LC Vilber Loumart Nikro 200 Hettich (Đức) Ngoài cịn có dụng cụ phịng thí nghiệm như: bình lắng gạn, bình định mức, bình nón nút mài, micro pipette, pipette xác, eppendorf tube • Thiết bị sắc ký - HPLC Alliance 2695 XE (Waters), đầu dò PDA 2996 (Waters) - Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters) - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, Viện hóa học thuộc Trung tâm Khoa học cơng nghệ Việt Nam – Hà Nội - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột Sephadex LH-20 (2 × 60 cm), ct Sunfire C18 (250 mm ì4,6; àm)v tiờn ct Sunfire C18 (12,5ì 4,6 mm; àm) - Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng máy HPLC 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thu hái định danh mẫu: khảo sát đặc điểm hình thái, định danh mẫu, lưu mẫu Bộ môn Dược liệu – khoa Dược – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2.2.1 Xác định độ tinh khiết - Xác định độ ẩm: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6, PL-182 - Xác định tro tồn phần tro khơng tan HCl: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.8 phụ lục 9.7., phương pháp 2.2.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật: Theo phương pháp Ciuley cải tiến 2.2.3 Chiết xuất và phân tách phân đoạn - Bột thân Xáo tam phân chiết ngấm kiệt với cồn 96%, cô thu hồi dung môi áp suất giảm, thu cao lỏng - Cao lỏng lắc phân bố với dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, bao gồm: n-hexan, cloroform, n-butanol, cô áp suất giảm cho cao tương ứng: n-hexan, cao cloroform, cao n-butanol và cao nước Sử dụng cao CHCl3 để phân lập hợp chất 2.2.4 Phân lập tinh chế 2.2.4.1 Khảo sát hệ dung mơi phân tích cao n-hexan - Tiến hành SKLM khảo sát hệ dung môi khác (như phần Kết nghiên cứu) - Chọn hệ dung mơi phân tích cho kiểm tra phân đoạn chất tinh khiết - Chọn hệ dung môi cho SKC (như phần Kết nghiên cứu) 2.2.4.2 Phân lập hợp chất cao n-hexan - Phân tách phân đoạn sắc kí cột chân không (VLC) Điều kiện SK phân thực nghiệm (Kết nghiên cứu) - Phân lập SKC cổ điển: Điều kiện SK phân thực nghiệm (Kết nghiên cứu) - Kiểm tra gộp phân đoạn: hứng phân đoạn, kiểm tra SKLM, phát hiện đèn UV 254 nm, UV 365 nm TT VS Các phân đoạn gần giống gộp chung lại, thu hồi dung môi áp suất giảm (cô quay chân không) 2.2.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết: Kiểm tra độ tinh khiết SKLM - Thực hiện mỏng silica gel tráng sẵn, chất phân khai triển với hệ dung môi khác đây: n-hexan – cloroform (5:5) n-hexan – ethyl acetat (63: 35) cloroform – ethyl acetat (6:4) 2.2.5 Xác định cấu trúc chất phân lập Chất tinh khiết phân tích phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA, NMR, so sánh đối chiếu với liệu về phổ NMR, MS của chất tương tự công bố tài liệu Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo máy BRUKER – AV – 500, Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội Mẫu hòa tan CD3OD CD3COCD3 với TMS chất chuẩn nội Phổ proton (1H-NMR) đo 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) đo 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn tín hiệu của TMS Các số ghép (J) tính Hertz (Hz) III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết thử tinh khiết và hàm lượng chất chiết • Kết xác định hàm ẩm của thân Xáo tam phân: Xem Bảng 3.1 Bảng 0.1 Kết thử độ ẩm P mẫu (g) Độ ẩm (%) Lần 0,502 8,82 Lần 0,506 8,54 Lần 0,501 8,54 Lần thử Trung bình 8,63 • Kết xác định hàm ẩm của thân Xáo tam phân: Xem Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết tro tồn phần, tro khơng tan acid Lần thử P mẫu (g) Khơi lượng chén có tro (g) Khơi lượng chén khơng tro (g) Tro tồn phần (%) 2,06 24,37 24,27 5,31 2,00 30,55 30,45 5,47 2,08 26,92 26,83 4,74 TB 5,17 • Hàm lượng chất chiết Tiến hành theo phương pháp chiết nóng, Phụ lục 12.10 (trang PL-239, DĐVN IV), kết trình bày Bảng 3.3 Bảng 0.2 Kết hàm lượng chất chiết Dung môi chiết Nước Cồn 96% Lần mdược liệu (g) Hàm lượng chất chiết (%) 3,98 1,75 4,01 1,71 4,00 1,77 3,99 1,98 4,02 2,07 4,01 2,05 Trung bình 1,74 2,03 3.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật của thân Xáo tam phân: Kết thể hiện Bảng 3.4 Bảng 0.3 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật thân Xáo tam phân Kết định tính dịch chiết Thuốc thử/ phản ứng Nhóm hợp chất Dịch chiết ether Chất béo Nhỏ dd lên giấy (-) Carr – Price (-) H2SO4 (-) Tinh dầu Bốc tới cắn (+) Triterpenoid tự Liebermann – Burchard Alkaloid Thuốc thử chung alkaloid Carotenoid Dịch chiết nước (+++) (±) Dịch chiết cồn (±) (-) Coumarin Phát quang kiềm Antraglycosid KOH 10% (-) Flavonoid Mg/HCl đđ (-) Glycosid tim Anthocyanosid Proanthocyanidin Tanin Triterpenoid thủy phân (++) (++++) (-) (-) Thuốc thử vòng lacton (-) (-) TT đường 2-desoxy (-) (-) HCl (-) (-) KOH (-) (-) HCl/t0 (-) (-) Dd FeCl3 (-) (-) Dd gelatin muối (-) (-) Liebermann – Burchard (++) (++) Lắc mạnh dd, nước (++) (++) Liebermann – Burchard Saponin Acid hữu Na2CO3 (-) (-) Chất khử TT Fehling (-) (-) Hợp chất polyuronic Pha loãng với cồn 90% (-) Ghi chú: ( ̶ ) : khơng có (+): có (+++): có nhiều (±): khơng rõ (++): có (++++): có nhiều Có thể có phản ứng khơng thực hiện Khơng có mặt của nhóm hợp chất dịch chiết Kết quả: Kết phân tích sơ thành phần hóa học cho thấy dược liệu chứa nhiều coumarin triterpenoid, chứa saponin nghi ngờ có alkaloid 3.3 Chiết xuất 5,3 kg thân Xáo tam phân (P trimera) xay kích thước phù hợp, chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu 90 lit dịch chiết, cô thu hồi dung môi áp suất giảm thu 430 ml cao lỏng Cao lỏng lắc phân bố với dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, bao gồm: n-hexan, cloroform, n-butanol Các dịch sau lắc phân bố cô áp suất giảm cho cao n-hexan, cao cloroform, cao nbutanol) và cao nước Sơ đồ chiết xuất trình bày Hình 3.2 Dung môi chiết Khối lượng (g) Cao n-hexan Cao n-hexan 36 Cloroform Cao cloroform 19 n-butanol Cao n-butanol 39,7 Phần cịn lại khơng tan dung mơi Cao nước 92 3.4 Phân lập phân đoạn cao n-hexan 3.4.1 Khảo sát hệ dung mơi phân tích cao n-hexan Kết thăm dò hệ dung môi sắc kí phân tích cho cao n-hexan trình bày Bảng 3.5 Bảng 0.6 Kết khảo sát hệ dung môi phân tích cao n-hexan Stt Hệ dung môi Số vết Khả tách Ghi TP1: n-hexan – cloroform (7:3) (-) TP2: n-hexan – cloroform (5:5) (-) TP3: Cloroform (+) TP4: n-hexan – etyl acetat (8:2) (++) Khá tốt TP5: n-hexan – etyl acetat (65:35) 12 (+++) Tốt TP6: Cloroform – etyl acetat (8:2) (++) Kéo vệt Từ kết thăm dò trên, chọn hệ dung môi n-hexan – EtOAc (65:35) làm hệ dung mơi phân tích cho q trình phân lập chất cao n-hexan 3.4.2 Phân lập chất cao n-hexan SKC chân không (VLC) • Thăm dị dung mơi cho VLC Tiến hành: SKLM cao H0 với nhiếu hệ dung môi, chọn hệ có khả tách tốt n-hexan – cloroform (7:3) Bản sắc ký triển khai lần Phát hiện UV 254/ 365 nm thuốc thử VS Kết quả: Hệ dung môi n-hexan – cloroform (7:3) tách tốt (Rf = 0,3) chọn làm hệ làm dung môi phân lập cao H0 VLC Khai triển cách chạy gradient, khởi đầu n-hexan 100% và tăng dần tỉ lệ cloroform • Tiến hành phân lập sắc kí cột chân khơng VLC - Cao n-hexan toàn phần (H0 = 30 g) sắc ký cột chân không với điều kiện: - Chuẩn bị mẫu: 30 g cao H0 hòa tan hoàn toàn lượng tối thiểu cloroform trộn đều với 45 g silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm, cô áp suất giảm cho - dung môi bay hoàn toàn thu bột tơi xốp Chuẩn bị cột VLC: cột x 70 cm, có lưới thủy tinh xốp G1, rửa sạch, sấy khô, nạp 450g silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm, nén chặt hút chân không - Nạp mẫu: Nạp mẫu dạng bột khô lên cột, gõ nhẹ để mẫu phân bố phẳng đều Thêm lớp silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm lên trên, hút cột chân không - cho cột nén thật chặt Pha động: n-hexan – cloroform (100:0) → (9:1) → (8:2) → (7:3) → (6:4) - →(5:5) → (6:4) → (7:3) Thể tích hứng: 200 ml/ lần Theo dõi trình tách bầng SKLM, khai triển với hệ n-hexan – EtOAc (65:35), phát hiện UV 254/365 nm thuốc thử VS Gộp phân đoạn chứa vết có Rf tương tự • Kết Dựa vào UV 365 nm, đặt tên vết theo Rf từ cao đến thấp hệ n-hexan – ethyl acetat (65:35) theo thứ tự từ đến 13 Theo đó, tóm tắt phân đoạn Bảng 3.6 Bảng 0.7 Kết tách qua cột VLC Thành phần (theo SKLM) Phân đoạn P (g) I 5,88 II 0,18 III x x x x x x x x x x x x 0,15 x x x IV 0,21 x x V 0,38 x x VI 0,36 VII 0,21 VIII Ít IX Ít x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Tạp Nhận xét: 10 10 11 12 x x x x x x X x x x x x x x - Các phân đoạn thu sau cô thu hồi dung môi đều dạng dầu - Phân đoạn I: Vết xuất hiện với hàm lượng lớn, có khả tiếp tục phân lập cột cổ điển - Các phân đoạn II, III, IV, V có khối lượng thành phần phức tạp - Phân đoạn VI, VII, VIII có vết, có khả tiếp tục phân lập cột cổ điển 3.4.3 Sắc ký cột cổ điển (SKC-1) từ phân đoạn I của VLC 3.4.3.1 Thăm dị hệ dung mơi sắc ký - Phân đoạn I sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, chọn hệ dung môi nhexan – cloroform (85:15) - Bản sắc ký phân đoạn I triển khai lần với hệ dung môi n-hexan – cloroform tỉ lệ 85:15, phát hiện UV 254/ 365 nm, thuốc thử VS 3.4.3.2 Phân lập SKC-1 - Phân đoạn I (5 g) sắc ký cột cổ điển (SKC-1) với điều kiện: - Chuẩn bị mẫu: g phân đoạn I hịa tan hồn tồn lượng tối thiểu cloroform, trộn với g silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm, trộn đều tạo bột khô, tơi, sấy tủ sấy chân không cho khơ hồn tồn - Chuẩn bị cột SKC-1: cột x 80 cm, nạp 200g silica gel 40 – 63 µm dạng hỗn dịch (dung môi nền n-hexan) - Pha động: n-hexan – cloroform (85:15) Thể tích hứng phân đoạn 100 ml Theo dõi thành phần của phân đoạn SKLM với dung môi khai triển nhexan – ethyl acetat (8:2), phát hiện UV 254/365 nm Gộp phân đoạn chứa vết có Rf tương tự Sắc ký đồ của phân đoạn của cột SKC-1 trình bày Hình 3.7 Nhận xét: - Phân đoạn I-1, chứa vết với lượng lớn, thành phần đơn giản, tiếp tục xử lý để lấy chất - Phân đoạn I-4, xuất hiện kết tủa sau cô thu hồi dung môi 11 - Các phân đoạn lại dạng dầu, có khối lượng khơng nhiều thành phần phức tạp nên khơng tiếp tục xử lý - Q trình phân lập tinh chế chất từ cao n-hexan của Xáo tam phân tóm tắt Hình 3.3 I-1 (26 mg) PT-T1 (12 mg) I-2 (19 mg) I-3 skc1 VLC-I (5 g) I-4 (56 mg) PT-T6 (36 mg) VLC-II I-5 VLC-III I-6 VLC-IV I-7 VLC-V I-8 VLC H0 (30 g) VLC-VI VLC-VII VLC-VIII Hình 0.3 Tóm tắt trình phân lập chất từ cao n-hexan VLC-IX 12 3.4.3.3 Tinh chế phân đoạn I-1 - Tiến hành: Hòa tan phân đoạn I-1 ml n-hexan, siêu âm cho tan hoàn toàn Để yên cho kết tinh lại hoàn toàn - Kết quả: Sau kết tinh lại lần, thu 12 mg tinh thể màu trắng, đặt tên PT-T1 PT-T1 không tan methanol, acetonitril, nước; khó tan ethyl acetat; dễ tan cloroform n-hexan 3.4.3.4 Tinh chế phân đoạn I-2 - Tiến hành: Hòa tan phân đoạn I-2 n-hexan, siêu âm cho tan hoàn toàn Để yên cho kết tinh lại, xuất hiện dạng tủa lơ lửng dung môi Rút phần tủa lơ lửng cho vào eppendorf loại 1,5 ml Tiến hành ly tâm dịch thu với tốc độ 12.000 rpm vòng phút Rút bỏ phần dịch, lặp lại nhiều lần - Kết quả: Thu mg dạng dầu, đặt tên PT-T2 PT-T2 khó tan MeOH acetonitril, dễ tan cloroform, tan n-hexan 3.4.3.5 Tinh chế phân đoạn I-4 - Tiến hành: Từ phân đoạn I-4, sau cô áp suất giảm thu hồi dung môi thu tinh thể màu trắng, hình kim Tiến hành lọc qua phễu thủy tinh xốp Rửa MeOH lạnh nhiều lần Hòa tan tinh thể thu 25 ml n-hexan, siêu âm nhẹ, có gia nhiệt cho tan hồn tồn Để nguội cho kết tinh lại hoàn toàn - Kết quả: Sau kết tinh lại, thu 36 mg tinh thể màu trắng, hình kim, đặt tên PT-T6 PT-T6 khơng tan methanol, acetonitril, nước; tan ethyl acetat; dễ tan cloroform n-hexan Tiến hành kiểm tra sơ độ tinh khiết của PT-T6 SKLM, xác định cấu trúc phổ MS NMR 13 3.5 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập (PT-T1, PT-T2 PT-T6) Các hợp chất PT-T1, PT-T2 PT-T6 sau cho kết tinh lại hòa cloroform, chấm thật đậm mỏng có kích thước x cm Triển khai SKLM với hệ dung mơi có độ phân cực khác nhau, thành phần hệ dung môi sắc ký thể hiện Bảng 3.8 Bảng 0.8 Thành phần hệ dung môi kiểm tra tinh khiết Hệ sắc ký Thành phần TK1 n-hexan – cloroform (5:5) TK2 n-hexan – ethyl acetat (63: 35) TK3 cloroform – ethyl acetat (6:4) Kết quả: - Kiểm tra hệ TK1, TK2 KT3, chất PT-T1, PT-T2 PT-T6 đều cho vết SKLM Cả hai chất PT-T1 PT-T6 đều không hiện UV 254/365; cho màu tím với thuốc thử VS PT-T2 phát quang màu xanh da trời UV 365; không hiện màu với thuốc thử VS 3.6 Xác định cấu trúc chất phân lập 3.6.1 Xác định cấu trúc hợp chất PT-T6 PT-T6 kết tinh dung môi n-hexan dạng tinh thể hình kim, màu trắng; dễ tan n-hexan, cloroform, không tan methanol acetonitril Kiểm tra tinh khiết SKLM với hệ dung môi (TK1, TK2, TK3), nhận thấy PT-T6 hợp chất phân cực, không hiện vết UV 254/ 365 nm hiện màu tím với thuốc thử VS Sơ nhận định PT-T6 thuộc nhóm hợp chất phytosterol Tiến hành đo phổ 1H-NMR 13C-NMR Từ kết phổ, sơ kết luận PTT6 hỗn hợp của chất thuộc nhóm phytosterol là stigmasterol (A, có Δ22) và βsitosterol (B, khơng có Δ22) 14 Từ phổ 1H-NMR (CDCl3) dự đốn phần trăm của chất hỗn hợp nhờ so sánh số tích phân của tín hiệu chung (H-6A + H-6B) với số tích phân của tín hiệu riêng (2-H olefin 22-A 23-A): - (H-3A+H-3B) → tín hiệu 3,53m - (H-6A + H-6B) → tín hiệu với số tích phân = 1,00 5,35 br với số tích phân=1,00 - (H-22A, dd) (H-22B, dd) bên cạnh (δ 5,0 – 5,2) với số tích phân 0,81 0,78 (trung bình 0,80) - Như vậy, stigmasterol (A) chiếm khoảng 80% và β-sitosterol (B) chiếm khoảng 20% hỗn hợp PT-T6 Hình 0.4 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) PT-T6 3.6.2 Xác định cấu trúc hợp chất PT-T1 PT-T1 có dạng kết tinh màu trắng, khơng tan methanol, acetonitril, nước; khó tan ethyl acetat; dễ tan cloroform n-hexan Kiểm tra tinh khiết SKLM, nhận thấy PT-T1 phân cực, không xuất hiện vết UV 254/365 nm, hiện màu tím với thuốc thử VS Tiến hành đo phổ 1H-NMR, kết cho thấy PT-T1 chưa sạch, lẫn tạp 15 Hình 0.53 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) PT-T1 3.6.3 Xác định cấu trúc hợp chất PT-T2 PT-T2 phân lập dạng dầu, khó tan MeOH acetonitril, dễ tan cloroform, tan n-hexan có gia nhiệt Kiểm tra tinh khiết SKLM, nhận thấy PT-T2 phân cực, phát quang xanh dương UV 365 nm; không xuất hiện vết UV 254 nm thuốc thử VS Tiến hành đo phổ 1H-NMR, kết cho thấy PT-T2 không cịn lẫn nhiều tạp: - Cường độ tín hiệu của peak chất chuẩn / dung môi đo lớn - S/N bé – nồng độ mẫu đo thấp (mẫu dạng dầu nên khó xác định khối lượng xác) Kết luận: PT-T2 khơng sạch, khơng xác định cấu trúc 16 Hình 0.6 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) PT-T2 17 IV KẾT LUẬN Đề tài thu kết sau: 4.1 Thử tinh khiết: - Độ ẩm: 8,63 % - Độ tro toàn phần: 5,17 % - Hàm lượng chất chiết được: Chiết nước: 1,74 % Chiết cồn 2,03 % 4.2 Khảo sát hóa học: sơ phân tích thành phần hóa thực vật của thân Xáo tam phân cho thấy thân Xáo tam phân có chứa coumarin, triterpenoid có saponin có alkaloid 4.3 Chiết xuất: Từ 5,3 kg bột thân Xáo tam phân chiết ngấm kiệt với cồn 96%, cô thu hồi dung môi áp suất giảm lắc phân bố với dung mơi có độ phân cực tăng dần, thu hồi dung môi áp suất giảm cho cao tương ứng: nhexan (H0, 36 g), cao cloroform (C0, 19 g), cao n-butanol (B0, 39,7 g) và cao nước (92 g) 4.4 Phân lập: - Tiến hành phân lập chất có phân đoạn phân cực cao n-hexan (30 g) kĩ thuật sắc ký cột chân không thu phân đoạn, PĐ I chiếm khối lượng lớn (5,88 g) - Tiến hành sắc ký cột cổ điển silica gel g PĐ I thu phân đoạn phân đoạn xuất hiện tủa Bằng phương pháp tinh chế kết tinh lại; phân lập hợp chất ký hiệu PT-T1 (12 mg), PT-T2 (6 mg) PT-T6 (36 mg) Xác định cấu trúc PT-T6 xác định hỗn hợp của chất stigmasterol và β-sitosterol Đây là hỗn hợp phytosterol phổ biến thường xuất hiện thực vật, không phân biệt SKLM, xác định hàm lượng chất dựa vào phổ NMR 18 Hình 0.1 Công thức stigmasterol β-sitosterol 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Trọng Đạt, Nguyễn Thanh Hồng, Lê Tiến Dũng, Nguyễn Hữu An, Mai Đình Trị (2013), "Một coumarin chromene phân lập từ rễ Xáo tam phân Paramignya trimera", Tạp chí Hóa học.(41B), tr.292-296 Võ Văn Chi, Từ điển Thực vật thông dụng, tập 2, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr.2175-2176 Võ Văn Chi (2015), "Tên khoa học của Xáo tam phân", Tạp chí Cây thuốc quý tr.10-12 Trương Thị Đẹp (2009), Thực vật dược, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr.250 Nguyễn Thị Ngọc Dung, Trần Thị Thúy Quỳnh, Phạm Đông Phương, Vĩnh Định (2015), "Định lượng đồng thời ostruthin 8-methoxyosstruthin rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao", Tạp chí Dược học tr.934-938 Trịnh Hoàng Dương, Trần Thu Phương, Hà Diệu Ly, Nguyễn Thụy Vy, Đặng Văn Sơn , Nguyễn Diệu Liên Hoa (2016), "Coumarin acridon alkaloid từ rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera)", Tạp Chí Khoa học ĐHQGHN: khoa học tự nhiên công nghệ.(4), tr.115-123 Sở Y tế Khánh Hòa (2012), "Công văn số 2466/SYT-NVD" gửi UBND tỉnh Khánh Hòa Nguyễn Minh Khởi, Phạm Thị Nguyệt Hằng , Đỗ Thị Phương (2013), "Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan tác dụng gây độc tế bào ung thư của Xáo tam phân", Tạp chí Dược liệu.(1), 14-20 Viện Dược liệu (2012), "Công văn số 196/QLKHĐT-VDL gửi Sở Y tế Khánh Hòa" 10 Viện Dược liệu (2012), "Công văn số 539/VDL-QLKHĐT gửi Sở Y tế Khánh Hịa" 11 Phạm Hồng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, 2, Nhà xuất Trẻ, tr.427-429 12 Phạm Huy Bách, Vũ Văn Tuấn, Nguyễn Thị Hà Ly, Nguyễn Minh Khởi , Nguyễn Thiên Hương (2013), "Phân lập và định lượng ostruthin dược liệu Xáo tam phân thu hái Việt Nam", Tạp chí Dược liệu.(3), tr.173-178 20 13 Phạm Đông Phương, Trần Thị Thúy Quỳnh , Nguyễn Trung Dũng (2014), "Phân lập số hợp chất acridon alkaloid rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill)", Tạp chí Dược học tr.61-64 14 Phạm Đơng Phương, Trần Thị Thúy Quỳnh , Lê Thị Kim Thoa (2013), "Phân lập số hợp chất coumarin rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill)", Tạp chí Dược học tr.60-64 15 Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Hà Nội 16 Trần Giỏi , Lưu Hồng Trường (2012), "Cây thuốc quý Hịn Hèo (Khánh Hịa) loại gì?", Báo Khoa học phổ thông thứ 17 Trần Thị Thu Trang, Trần Trung Thạch, Trần Hợp , Trương Thị Đẹp (2016), "Đặc điểm hình thái vi học Xáo tam phân - Paramignya trimera (Oliv.) Guillaumin, họ Rutaceae", Tạp chí Y học TpHCM.(2), tr.333-337 18 Lưu Hồng Trường , Võ Duẩn (2013), "Chi Paramignya (Rutaceae) triển vọng dược liệu", Khoa học công nghệ phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng tr.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG NƯỚC NGOÀI 19 Leucomte M.H (1907), Flore Générale de L'Indo-Chine Tome I, Esditeurs-Paris 20 Takhtajan A (2009), Flowering plants, Springer 21 Wattanapiromsakul C , Waterman P.G (2000), "Flavanone, triterpene and chromene derivatives from stems of Paramignya griffithii", Phytochemistry.(3), pp.269-273 22 Nguyen Manh Cuong, Tran Thu Huong, Pham Ngoc Khanh , Young Ho Kim (2015), "Paratrimerins A and B, two new dimeric Monoterpene-Linked coumarin glycosides from the roots and stems of Paramignya trimera", Chemical and Pharmaceutical Bulletin pp.945-949 23 Mabberley D.J (1998), Autralian Citreae with notes on other Aurantioideae (Rutaceae), 7, Telopea, 334 21 24 Helge Joa, Sylvia Vog, Atanas G Atanasov , et al (2011), "Identification of Ostruthin from Peucedanum ostruthium Rhizomes as an Inhibitor of Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation", Journal of Natural Products pp.1513-1516 25 Bowen I.H , Patel Y.N (1998), "Phytochemical analysis of the leaves and stems of Paramignya monophylla Wight (Rutaceae)", Journal of Pharmacy and Pharmacology.(9), p.232 26 Vijaya Kumar, N.M.Mohamed Niyaz, Shanthini Saminathan , D.B.Manhida Wickramaratne (1999), "Coumarin from Paramignya monophylla root bark ", Phytochemistry.(1), pp.215-218 27 Vijaya Kumar, N.M.Mohamed Niyaz , D.B.Mahinda Wickramaratne (1993), "Coumarins from stem bark of Paramignya trimera", Phytochemistry.(3), pp.805806 28 Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Nguyen Phuong Thao, Sohyun Kim, Young Sang Koh, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Cuong , Nguyen Hoai Nam (2015), "Anti-inflammatory Tirucallane Saponins from Paramignya scandens", Chemical and Pharmaceutical Bulletin pp.558-564 29 Van Tang Nguyen, Quan V Vuong, Michael C Bowyer, Ian A Van Altena , Christopher J Scarlett (2016), "Microwave-assitted extraction for saponins and antioxidant capacity from Xao tam phan (Paramignya trimera) root", Journal of Food Processing ang Presevation 30 Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Ninh Thi Ngoc, Pham Thi Mai Huong , Nguyen Phuong Thao (2014), "Two tirucallane derivatives from Paramignya scandens and their cytotoxic activity", Phytochemical Society of Europe 31 Swingle (1943), "The botany of Citrus and its wild relatives of the orange subfamily (family Rutaceae, subfamily Aurantioideae)", Berkeley Los Angeles pp.268-269 32 Vijaya Kumar, N M Mohamed Niyaz , D B Mahinda Wickramaratne (1995), "Coumarins from stem bark of Paramignya monophylla", Phytochemistry.(3), pp.805-806 22 33 VijayaKumar, N.M.MohammedNiyaz , D.B.MahindaWickramaratne (1991), "Tirucallane derivatives from Paramignya monophylla fruits", Phytochemistry.(4), pp.1231-1233 34 Robert Wight (1840), Illustrations of Indian botany or figures illustrative of each of the natural orders of Indian plants, J B Pharoah, Madras TÀI LIỆU THAM KHẢO TỪ INTERNET 35 The Plant List (2010), http://theplantlist.org/, ngày truy cập 20th June-2017 23 ... trị của Xáo tam ph? ?n. V? ?n đề đặt ph? ?n mặt đất có tác dụng khơng thành ph? ?n hóa học của chúng n? ?o? đề tài: ? ?Nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học ph? ?n đo? ?n n- hexan từ th? ?n Xáo tam ph? ?n Paramignya trimera... ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHI? ?N CỨU THÀNH PH? ?N HÓA HỌC PH? ?N ĐO? ?N N -HEXAN CỦA TH? ?N XÁO TAM PH? ?N (PARAMIGNYA TRIMERA) TRỒNG TẠI... cho Xáo tam ph? ?n bị t? ?n diệt tự nhi? ?n Do nhu cầu sử dụng Xáo tam ph? ?n cao n? ?n số người d? ?n nghi? ?n cứu nh? ?n giống thành công và trồng tập trung vùng đất ven đồi vài huyê? ?n của tỉnh Đồng Nai