Nghiên cứu thanh fphần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây nhục tử gần (sarcosperma affinis gagnep sapotaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA... BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau Đại học, các thầy cô chuyên ngành Dược học cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình học tập và tạo điều kiện cho em được làm luận văn tốt nghiệp

Ban Chủ nhiệm Khoa, các thầy cô và cán bộ trong Khoa Dược đã giúp

đỡ, ủng hộ và tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị để em có thể tiến hành các thử nghiệm trong quá trình làm luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, kỹ thuật viên khoa Vi sinh – Bệnh viện TW Huế đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài

Ths Hồ Việt Đức đã tận tình giúp đỡ trong giải quyết cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được

Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên về tinh thần và hỗ trợ về vật chất để luận văn này được hoàn thành một cách tốt nhất Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hoài, giảng viên bộ môn Dược liệu – Khoa Dược, người đã tận tình hỗ trợ, hướng dẫn và truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Học viên Hoàng Xuân Huyền Trang

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 3

1.1.1 Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae) 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Sarcosperma Hook.f 5

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Sarcosperma affinis Gagnep 7

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 8

1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC 13

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 16

2.1.2 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm 16

2.1.3 Thuốc thử, dung môi, hóa chất 17

2.1.4 Máy móc - thiết bị 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 18

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học 19

2.2.3 Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 24

3.1.1 Đặc điểm hình thái 24

3.1.2 Đặc điểm vi học 25

3.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 32

3.2.1 Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có trong cây 32

3.2.2 Quá trình chiết xuất 33

3.2.3 Quá trình phân lập 35

3.3 Nhận dạng các chất phân lập được 39

3.3.1 Hợp chất SAC8 39

3.3.2 Hợp chất SAC9 41

3.3.3 Hợp chất SAC18 44

3.3.4 Hợp chất SAC22 47

3.4 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 49

3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết toàn phần và các phân đoạn49 3.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết phân lập từ cây Nhục tử gần 51

Chương 4 BÀN LUẬN 55

4.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 55

4.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 56

4.3 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

epithelial cell

Tế bào ung thư biểu mô phế nang người

AMPK AMP-activated protein kinase Enzym hoạt hóa AMP

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleid

ED50 Median effective dose 50 Liều có tác dụng lên 50%

nhóm thử nghiệm FtsZ Filamentous temperature sensitive

correlation

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

2 chiều HMBC HONE-1 Ppithelial tumor cell Tế bào khối u biểu mô HR-EI-MS High-resolution electron

ionizationmass spectrometry

Phổ khối phân giải cao

HSQC Heteronuclear single quantum

Tế bào ung thư vú người

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân SK-MEL-3 Human melanoma cell Tế bào melanoma người SK-OV-3 Ovarian carcinoma cells Tế bào ung thư biểu mô

buồng trứng TNF Tumor necrosis factors Yếu tố hoại tử khối u

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số triterpen phổ biến trong họ Sapotaceae 8

Bảng 1.2 Một số flavonoid đƣợc phân lập từ họ Sapotaceae 12

Bảng 1.3 Một số loài có hoạt tính kháng khuẩn thuộc họ Sapotaceae 14

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ phần trên mặt đất của cây Nhục tử gần 32

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của SAC8 và hợp chất tham khảo 40

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của SAC9 và hợp chất tham khảo 43

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ của SAC18 và hợp chất tham khảo 46

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ của SAC22 và hợp chất tham khảo 48

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết toàn phần và các phân đoạn đối với Staphylococcus aureus 49

Bảng 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết toàn phần và các phân đoạn đối với Escherichia coli 50

Bảng 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết toàn phần và các phân đoạn đối với Pseudomonas aeruginosa 50

Bảng 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng Staphylococcus aureus 52

Bảng 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng Bacillus subtilis 52

Bảng 3.11 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng Escherichia coli 53

Bảng 3.12 Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng Pseudomonas aeruginosa 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc một số triterpen thường gặp ở họ Sapotaceae 11

Hình 1.2 Cấu trúc một số flavonoid thường gặp ở họ Sapotaceae 13

Hình 2.1 Ảnh cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) 16

Hình 2.2 Phân bố các mẫu thử trên đĩa thạch dinh dưỡng 23

Hình 3.1 Ảnh cây Nhục tử gần 24

Hình 3.2 Ảnh một số đặc điểm hình thái cây Nhục tử gần 25

Hình 3.3 Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 10) 26

Hình 3.4 Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 40) 27

Hình 3.5 Các đặc điểm bột cành Nhục tử gần 28

Hình 3.6 Các đặc điểm bột lá Nhục tử gần 29

Hình 3.7 Vi phẫu gân lá Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 10) 30

Hình 3.8 Vi phẫu phiến lá Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 40) 30

Hình 3.9 Vi phẫu gân lá Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 40) 31

Hình 3.10 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ Nhục tử gần 37

Hình 3.11 Sơ đồ phân lập SAC8 và SAC22 từ phân đoạn chloroform 38

Hình 3.12 Sơ đồ phân lập SAC9 và SAC18 từ phân đoạn chloroform 38

Hình 3.13 Cấu trúc hóa học của SAC8 39

Hình 3.14 Tương tác 1H - 13C HMBC chính của hợp chất SAC9 42

Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của SAC9 42

Hình 3.16 Tương tác 1 H - 13C HMBC chính của hợp chất SAC18 45

Hình 3.17 Cấu trúc hóa học của SAC18 45

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của SAC22 49

Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của SAC8 và SAC18 61

sử dụng hiện nay đều có nguồn gốc tự nhiên Hệ sinh thái tự nhiên cung cấp nguồn hợp chất với hoạt tính sinh học cực kì phong phú với số lượng các hợp chất tự nhiên chưa được khám phá theo ước tính là hơn 1 triệu hợp chất [11]

Vì vậy, nghiên cứu phát triển kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên vẫn là một hướng đi đầy hứa hẹn

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo thống kê sơ bộ, ở nước ta hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao, khoảng 800 loài rêu,

600 loài nấm và hơn 2.000 loài tảo [9] Trong đó, Thừa Thiên Huế thuộc khu vực thực vật nhiệt đới vùng đệm có sự giao lưu giữa hệ thực vật phía Bắc và

hệ thực vật phía Nam, đa dạng về thành phần, chủng loại và hệ sinh thái

Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) là một loài đặc hữu

của Việt Nam đã được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế [7] Kết quả sàng lọc ban đầu của nhóm nghiên cứu cho thấy loài này có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có công bố nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam cũng như trên thế giới Nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn, chuẩn hóa nguyên liệu

cũng nhƣ làm sáng tỏ thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây Nhục từ gần, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng

khuẩn của cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae)”

đƣợc tiến hành với các mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của cây

2 Chiết xuất, phân lập 4-5 chất tinh khiết trong cây và xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập được

3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết toàn phần, dịch chiết các phân đoạn và các chất tinh khiết phân lập được từ cây

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ

1.1.1 Đặc điểm chung của họ Sapotaceae (Hồng Xiêm)

Cây gỗ hoặc cây bụi có nhựa mủ, có lông ở thân non Có thể có hoặc

không có lá kèm (chi Chrysophyllum và Pouteria) Lá đơn thường xanh, mọc

so le hay mọc vòng, hiếm khi mọc đối, có cuống lá Phiến lá nguyên, gân lá lông chim, gân nhỏ vắt chéo Mép phiến lá nguyên

Cụm hoa hình xim, hoa hiếm khi mọc đơn, mọc ra từ nách lá hoặc cành già Hoa lưỡng tính, hiếm khi đơn tính, đối xứng tỏa tròn Hoa có lá bắc với kích thước thường nhỏ hay trung bình, phần lớn cân đối hoặc đôi khi hơi không cân đối tới rất không cân đối Bao hoa với đài hoa và tràng hoa riêng biệt, xếp 2 vòng hoặc 3 vòng Đài hoa 4−8 cánh, 1 vòng (5 cánh), hoặc 2 vòng (2+2, 3+3 hay 4+4 cánh), trường hợp 1 vòng thì xếp lợp Tràng hoa 3−10 cánh, 1 vòng hoặc 2 vòng, có phần phụ hoặc không, cánh hợp, xếp lợp

Bộ nhị thường gồm 4−15 nhị, rời nhau, xếp thành 1−3 vòng Bộ nhị có thể chỉ bao gồm các nhị sinh sản hoặc bao gồm cả các nhị lép (vòng ngoài, vòng đối diện với lá đài thường chỉ gồm nhị lép) Nhị lép 2−5, nằm bên ngoài các nhị sinh sản Bộ nhị có thể đẳng số với bao hoa, hoặc gấp đôi hay gấp ba, mọc so le hay đối diện với lá đài, đối diện với các phần của tràng hoa hoặc cả

so le lẫn đối diện với các phần của tràng hoa Các bao phấn nứt theo khe nứt dọc, hướng ngoài, dạng 4 túi bào tử Các hạt phấn có 3−6 khe hở dọc, 2 ngăn hoặc 3 ngăn

Bộ nhụy có số lá noãn bằng với bao hoa, riêng chi Sarcosperma thì thấp

hơn với chỉ 2−3 lá noãn Túi phôi không hình thành các tế bào đối cực (ba nhân nhanh chóng thoái hóa) Hai tế bào nằm cạnh tế bào trứng có móc Quả

dạng quả mọng với cùi thịt dày, không nứt, riêng chi Sarcosperma là quả

hạch Hạt có nội nhũ hoặc không Nội nhũ chứa dầu Phôi phân biệt rõ, có 2 lá mầm (lớn, mỏng, phẳng) Phôi không chứa diệp lục [42]

Họ Sapotaceae gồm 53 chi với 1200 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

đới ẩm và cận nhiệt đới, một vài chi có thể tìm thấy ở vùng bán khô hạn và khô hạn Ở Việt Nam có 16 chi, trên 40 loài Đây là một trong những họ phổ biến nhất của vùng rừng thấp, phân bố từ những vùng gần biển lên độ cao

4000 m [46] Các chi thuộc họ Sapotaceae ở Việt Nam gồm có: Aesandra, Bumelia, Chrysophyllum, Donella, Eberhardtia, Madhuca, Manilkara, Mastichodendron, Mimusops, Palaquium, Payena, Planchonella, Pouteria, Sarcosperma, Sinosideroxylon, Xantolis [5]

Khóa phân loại các chi trong họ Sapotaceae [5]

1a - Đài do 2 luân sinh 3−4 lá đài

2a - Cánh hoa có phụ bộ ở lƣng, tiểu nhụy bằng số cánh hoa, có tiểu nhụy lép

3a - Lá đài 6, cánh hoa 6, sẹo hạt dẹp, dài Manikara 3b - Lá đài 8, cánh hoa 8, sẹo hạt tròn Mimusops

2b - Cánh hoa không có phụ bộ, tiểu nhụy bằng 2−3 số cánh hoa, không có tiểu nhụy lép

3a - Lá đài 6, tiểu nhụy 12, noãn sào 6 buồng Palaquirum

3b - Lá đài 4 4a - cánh hoa 12, tiểu nhụy 24, noãn sào 12 buồng

Aesandra

4b - cánh hoa 5−18, noãn sào (6) 8 (10) buồng

5a - Có phôi nhũ, tiểu nhụy 16 Payena 5b - Phôi nhũ vắng hay gần nhƣ vắng Madhuca

1b - Đài do 1 luân sinh lá đài, hoa 5 phân

2a - cánh hoa có phụ bộ ở lƣng, có tiểu nhụy lép

3a - quả không tự khai, sẹo hạt tròn ở đáy Bumelia

3b - quả tự khai, sẹo hạt tròn dài Eberhardtia

2b - cánh hoa không phụ bộ ở lưng

3a - không tiểu nhụy lép, có phôi nhũ Donella

3b - có tiểu nhụy lép

4a - noãn sào 1−2 buồng, chùm Sarcosperma

4b - noãn sào 5 buồng, phôi nhũ

5a - sẹo hạt ở đáy, mầm đứng Sinosideroxylon

5b - sẹo hạt tròn dài hẹp 6a - quả 1(2) hạt, cây thường có gai, tiểu nhụy gắn

ở miệng hoa Xantolis

6b - quả 5 hạt, tiểu nhụy gắn ở miệng hoa

Planchonella

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Sarcosperma Hook.f

1.1.2.1 Vị trí phân loại chi Sarcosperma Hook.f

Sarcosperma là một chi khá đặc biệt trong họ Sapotaceae, được các nhà

thực vật học tranh luận khá nhiều về vị trí phân loại Vào khoảng những năm

1925, chi Sarcosperma từng được xếp thành một họ riêng biệt mang tên

Sarcospermaceae Luận điểm này dựa trên một số nét khác biệt về mặt thực

vật của Sarcosperma với các loài của họ Sapotaceae như: cụm hoa kéo dài, lá mọc đối [30] Tuy nhiên, tác giả Pennington (1991) lại xếp chi Sarcosperma

là một chi thuộc họ Sapotaceae vì cho rằng những đặc điểm trên vẫn có ở một

số loài trong họ này Ngoài việc xếp chi Sarcosperma vào họ Sapotaceae, tác giả trên còn đặt chi này vào tông Sideroxyleae Cách sắp xếp của Pennington

dựa chủ yếu vào việc phân tích, so sánh đặc điểm hình thái [10]

Trong một nghiên cứu về mối liên hệ tiến hóa giữa những loài trong bộ

Đỗ quyên (Ericales), tác giả Anderberg (2002) dựa vào so sánh dữ liệu DNA

kết luận rằng chi Sarcosperma không chỉ thuộc tông Sideroxyleae mà trên

thực tế còn có mối quan hệ tiến hóa với tất cả các chi trong họ Sapotaceae

Kết luận này càng được củng cố khi tác giả thu hẹp phạm vi nghiên cứu, chỉ phân tích những dữ liệu gen của các loài trong họ Sapotaceae Do đó, hiện

nay chi Sarcosperma được thống nhất xếp vào họ Sapotaceae [10]

Theo hệ thống phân loại của Pennington [41], Takhtajan [50], chi

Sarcosperma có vị trí phân loại như sau:

1.1.2.2 Đặc điểm thực vật chi Sarcosperma Hook.f

Cây gỗ hay cây bụi Lá kèm nhỏ rụng sớm và để lại vết sẹo trên cuống

lá, phiến lá thon Lá mọc đối hay mọc cách, hiếm khi mọc xoắn ốc, có lỗ tiết gần gân bên Gân bên nhỏ dần và biến mất khi gần tới mép lá Cuống lá thường có cặp lá kèm Cụm hoa chùm hay chùy mọc ra từ nách lá Lá bắc nhỏ, hình tam giác Hoa lưỡng tính, đài hoa 5, tròn, xếp chồng lên nhau Tràng hoa rộng hình chuông Cánh hoa 5, nhị 5 nằm trong ống tràng, đối diện với cánh hoa và có 5 nhị lép xen kẽ Bộ nhụy gồm 2−3 lá noãn Quả hạch, có

1 hoặc 2 hạt, vỏ quả rất mỏng Hạt hình elip hoặc hình trứng, không dẹp hai bên, không có nội nhũ [46]

1.1.2.3 Phân bố chi Sarcosperma Hook.f

Chi Sarcosperma gồm khoảng 11 loài, phân bố ở Ấn Độ, Indonesia,

Malaysia, Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc và Philipin Chi này xuất hiện rải rác ở những dạng rừng khác nhau từ mặt nước biển lên đến độ cao 1300 m Ở

Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ [5] có 5 loài thuộc chi Sarcosperma

- Sarcosperma affinis Gagnep - Nhục tử gần, Sến nạc nhỏ

+ Phân bố: Quảng Nam (Gò Ổi)

+ Dạng sống và sinh thái: gỗ nhỏ, cao khoảng 6−7 m, ở độ cao 500 m

Ra hoa tháng 2

- Sarcosperma angustifolium Gagnep - Nhục tử lá hẹp, Sến nạc lá hẹp

+ Phân bố: Hòa Bình (chợ Bờ, núi Biểu)

+ Dạng sống và sinh thái: gỗ nhỏ, mọc ở độ cao 800−900 m Ra hoa tháng 9

- Sarcosperma kachinense (King & Prain) Excell - Nhục tử Cachin,

- Sarcosperma kontumense Gagnep ex Aubr - Nhục tử Kontum, Sến

nạc Kontum

+ Phân bố: Kontum ( Đắc Tô: Ngọc Gu-ga, Konplông)

+ Dạng sống và sinh thái: gỗ, cao 20m Mọc trong rừng dày, ở độ cao

1000 m Ra hoa và quả tháng 11

- Sarcosperma laurinum (Benth.) Hook f - Nhục tử lá quế, Sến nạc

nguyệt quế

+ Phân bố: Quảng Ninh (Tiên Yên, Hà Cối, Chúc Phai)

+ Dạng sống và sinh thái: gỗ, cao 6−15 m Mọc ở rừng thung lũng hoặc ven suối, độ cao 400−500 m

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Sarcosperma affinis Gagnep

Cây gỗ lớn, cao 7 m có mủ trắng Lá chụm ở đầu nhánh, có phiến thon,

to 15 × 3 cm, đầu phiến lá nhọn, không lông, gân phụ 10 cặp, có vài tuyến ở ngách gân trên Cuống 1,5−2,5 cm, không lá bẹ Hoa nhỏ, mọc thành chùm ở

nách lá, dài 5 cm, không lông Lá dài 1,6 cm, vành cao 2,5 mm Tiểu nhụy không chỉ, tiểu nhụy lép 5, nhọn Noãn không lông, 2−3 buồng 1 noãn [5]

Loài Sarcosperma affinis phân bố ở các tỉnh miền Trung Việt Nam như

Quảng Nam, Thừa Thiên Huế Theo tài liệu của tác giả Phan Kế Lộc

Sarcosperma affinis là loài đặc hữu của tiểu vùng địa lý thực vật Trung

Trường Sơn - Việt Nam [7]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Họ Sapotaceae trên thế giới có khoảng 1200 loài, ở Việt Nam có hơn

40 loài Tuy nhiên các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc

họ này vẫn còn rất hạn chế, mới chỉ tập trung vào một số loài như

Chrysophyllum cainito, Manilkara zapota, Madhuca lonigfolia, các loài trong chi Pouteria v.v Hiện nay, vẫn chưa có công bố nào về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Sarcosperma Thông thường, những loài có

mối quan hệ tiến hóa với nhau thường có một số nét tương đồng về thành phần hóa học

Triterpen và flavonoid là hai nhóm hợp chất được phân lập nhiều nhất

từ họ Sapotaceae Đây cũng là hai nhóm hợp chất được tập trung nghiên cứu về hoạt tính sinh học sau khi phân lập Các triterpen tồn tại ở dạng aglycon hoặc glycosid, trong đó phần aglycon chủ yếu thuộc về khung lupan, olean và ursan Một số triterpen phân lập từ các loài thuộc họ Sapotaceae được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số triterpen phổ biến trong họ Sapotaceae

Khung cấu trúc Tên chất Loài TLTK

Pouteria caimito

[15]

Pouteria gardnerii Pouteria tomentosa Pouteria torta

Khung cấu trúc Tên chất Loài TLTK

Khung cấu trúc Tên chất Loài TLTK

Flavonoid cũng là một nhóm chất phổ biến trong họ Sapotaceae Nó có mặt trong hầu hết các loài thuộc họ Sapotaceae đã đƣợc nghiên cứu Bảng 1.2 thống kê một số flavonoid đã phân lập đƣợc từ các loài thuộc họ Sapotaceae

Bảng 1.2 Một số flavonoid đƣợc phân lập từ họ Sapotaceae

Epicatechin (14)

Pouteria campechiana

[15]

Pouteria sapota Pouteria viridis

Quercitrin (17) Chrysophyllum cainito [53] Isoquercitrin (18) Chrysophyllum cainito [53] Quercitol (19) Mimusops elengi [19] Quercetin (20) Argania spinosa [13]

Chrysophyllum cainito [53]

Khung cấu trúc Tên chất Loài TLTK

Pouteria campechiana [14]

Ngoài ra, người ta đã phân lập được một số ít các alkaloid thuộc nhóm

hydroxymethylpyrrolizidine từ các loài thuộc chi Planchonella như benzoyl laburnine (Planchonella thyrsoidea, P anteridifera), isoretronecanol (P equestris), isoretronecyl tiglate (Planchonella sp.) [47]

1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC

Các loài trong họ Sapotaceae có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như

hạ đường huyết, chống ung thư, tăng cường miễn dịch, giảm đau, hạ sốt Đặc biệt trong những năm gần đây, hoạt tính kháng khuẩn của các loài trong họ Sapotaceae rất được chú ý Nhiều nghiên cứu sàng lọc đã được tiến hành và kết quả cho thấy rất nhiều loài trong họ này có hoạt tính kháng khuẩn mạnh

[40] Các nghiên cứu cho thấy Madhuca indica có hoạt tính kháng khuẩn đối

Hình 1.2.Cấu trúc một số flavonoid thường gặp ở họ Sapotaceae

với các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa với đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ 50

mg/mL tương ứng là 9, 7, 10 mm [24] Manilkara zapota có hoạt tính đối với các chủng Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa

với đường kính vòng vô khuẩn tương ứng là 29,0, 28,5, 28,0 mm [44] Dịch

chiết methanol của Vitellaria paradoxa có hoạt tính ức chế các dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E.coli ở nồng độ ức chế tối

thiểu (70 mg/mL) tương ứng là 16, 15, 15 mm [36]

Bảng 1.3 Một số loài có hoạt tính kháng khuẩn thuộc họ Sapotaceae [25]

1 Chrysophyllum cainito 12 Micropholis venulosa

2 Chrysophyllum lucentifolium 13 Mimusops elengi

3 Chrysophyllum

4 Eccliiiusa guianensis 15 Pouteria cayemensis

7 Manilkara bidentata 18 Pouteria niacrophylla

8 Manilkara guyanensis 19 Pouteria oblanceolata

omphalocarpoides

Đối với chi Sarcosperma mới chỉ có duy nhất loài Nhục tử Cachin

(Sarcosperma kachinense Exell.) được nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn

Theo báo cáo của Yang và cộng sự (2012), dịch chiết ethanol của loài Nhục

tử Cachin thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với Staphylococcus aureus kháng methiciline [16]

Sarcosperma affinis Gagnep là một loài đặc hữu của Việt Nam Cho đến

nay vẫn chưa có công bố nào về hoạt tính sinh học của loài này Nhóm nghiên cứu đã tiến hành sàng lọc hoạt tính của dịch chiết loài này tại Viện Nghiên cứu Thuốc Tự nhiên, Trường Đại học Toyama - Nhật Bản Tại đây đang tập trung nghiên cứu, tìm kiếm các loại kháng sinh có nguồn gốc thực vật có đích tác dụng là FtsZ FtsZ là một protein cần thiết cho sự tồn tại và phân chia của

tế bào vi khuẩn Nó có mặt ở hầu hết các loài vi khuẩn nhưng không có ở tế bào nhân thực Do đó, các kháng sinh có đích tác dụng là FtsZ sẽ có tác dụng chọn lọc, ít độc tính và an toàn hơn với cơ thể người Cụ thể, các kháng sinh

sẽ liên kết với FtsZ làm tăng hoạt động của GTPase, ức chế sự lắp ráp FtsZ dẫn đến ức chế sự phân chia tế bào vi khuẩn [17] Kết quả nghiên cứu từ 207 dịch chiết dược liệu được thu mẫu tại miền Trung Việt Nam cho thấy dịch chiết Nhục tử gần có tác dụng tốt nhất, làm ức chế khả năng lắp ráp của protein FtsZ lên đến 88,36 ± 6,5% Đây là một bằng chứng cho thấy Nhục tử gần có có thể chứa một số hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn mạnh Vì vậy, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này sẽ góp phần vào việc tìm kiếm, bổ sung các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, đồng thời làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển cây thuốc, đó là lý do mà cây Nhục tử gần được chọn làm đối tượng nghiên cứu trong đề tài

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) được

thu hái vào tháng 6/2014 tại Vườn Quốc gia Bạch Mã – Thừa Thiên Huế

Mẫu nghiên cứu Nhục tử gần gồm:

- Mẫu cây thu hái mang bộ phận sinh sản để làm giám định tên khoa học và làm tiêu bản khô

- Mẫu cây tươi bao gồm cành và lá, bột khô cành, lá để nghiên cứu đặc điểm vi học

- Cành và lá rửa sạch, thái nhỏ, sấy ở 50 C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản ở nơi khô thoáng để nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Hình 2.1 Ảnh cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae)

2.1.2 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm

Các chủng vi khuẩn kiểm định được dùng trong thí nghiệm gồm:

- Vi khuẩn Gram dương

+ Staphylococcus aureus ATCC 1128

+ Bacillus subtilis ACTT 6633

- Vi khuẩn Gram âm

+ Escherichia coli ACTT 25922

dichloromethan, nước cất, acid acetic v.v

Thuốc thử được sử dụng gồm có: dung dịch H2SO4 10% pha trong ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Dragendoff, Mayer, Bouchardat, các thuốc thử định tính

Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Muller Hinton

Chất nhồi cột sắc ký: silica gel pha thường (silica gel 60, 0,040−0,063

mm, Merck) và pha đảo (YMC, 30−50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex LH-20, Dianion HP-20 Ngoài ra còn sử dụng sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC silica gel 60 F254, Merck) và pha đảo (RP-18, Merck)

Máy đo phổ khối phân giải cao (HR-EI-MS): MicrOTOF-Q 10187 tại Viện nghiên cứu thuốc tự nhiên, Đại học Toyama, Nhật Bản

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1

H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS

là chất chuẩn nội) tại Viện nghiên cứu thuốc tự nhiên, Đại học Toyama, Nhật Bản

Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, độ chính xác 0,0001 g Micropipette 100, 200, 500 µL (Human), micropipette 50 µL (Excel monopette 8000) Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không

Máy đo độ đục, tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn, tủ sấy vô khuẩn, đĩa petri, dụng

2.2.1.2 Soi bột thân và lá

Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô, nghiền mịn thành bột, rây cho bột có kích thước phù hợp Để bột dược liệu lên lam kính có sẵn giọt nước cất, đậy lamen và quan sát các đặc điểm dưới kính hiển vi Chụp ảnh và mô tả các đặc điểm bột dược liệu [2]

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học [4]

2.2.2.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu

Sơ bộ định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp phân tích sàng lọc các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cây bằng phản ứng hóa học đặc trưng [1], [4] Dự kiến định tính các nhóm chất: alkaloid, anthranoid, acid hữu

cơ, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycosid tim, acid amin, chất béo,

đường khử, steroid

2.2.2.2 Chiết xuất

Chiết xuất: bột dược liệu được chiết bằng phương pháp ngâm với dung môi methanol ở nhiệt độ phòng Chiết 3 lần, mỗi lần chiết trong 1 tuần Gộp dịch chiết thu được rồi bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao toàn phần

Chiết xuất phân đoạn: phân tán cao toàn phần với nước trong bình thủy tinh dung tích 5 lít Tiến hành lắc phân đoạn với các dung môi hữu cơ có độ

phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-butanol trong bình gạn, thu được lần lượt các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-

butanol và phần nước còn lại Bốc hơi dung môi bằng máy cô quay thu được cao cắn tương ứng của từng phân đoạn

2.2.2.3 Phân lập

Quá trình phân lập hợp chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là cột hấp phụ và cột lọc qua gel Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng SKLM

Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu như sau:

- Sắc ký cột hấp phụ

+ Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột

thủy tinh Nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi [4]

+ Chất nhồi cột là silica gel pha thường, silica gel pha đảo

- Sắc ký lọc qua gel

+ Nguyên tắc: Sắc ký lọc qua gel là phương pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel Khoảng kích thước lỗ của gel xác định khoảng kích thước phân tử được phân tách qua quá trình sắc ký [4]

+ Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20 Phương pháp nhồi cột ướt được sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại sắc ký cột [4]

- Phương pháp SKLM

+ Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường và pha đảo + Nguyên tắc: SKLM là phương pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tuỳ theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại những vị trí khác nhau [1]

+ Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng

254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Magic, thuốc thử Dragendoff v.v

2.2.2.4 Xác định cấu trúc

Cấu trúc các hợp chất được xác định dựa trên các thông số vật lý như thể chất, màu sắc, phổ khối lượng phân giải cao và các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [4], [8] Phổ khối lượng phân giải cao (HR-EI-MS) được sử dụng để xác định công thức phân tử của hợp chất Công thức cấu tạo của hợp chất được xác định dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1

H-NMR,

C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC) Kết quả biện luận cấu trúc hóa học được khẳng định sau khi giải phổ và so sánh với số liệu phổ trong các nghiên cứu đã được công bố trước đó

Phổ khối phân giải cao (HR-EI-MS) được đo trên máy micrOTOF-Q

10187 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất nội chuẩn là tetramethyl silane (TMS), dung môi đo

phổ pyridine-d5 Quá trình đo phổ thực hiện tại Viện Nghiên cứu Thuốc Tự nhiên, Trường Đại học Toyama - Nhật Bản

2.2.3 Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn

2.2.3.1 Nguyên tắc

Mẫu thử được cho vào lỗ đục trên đĩa thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch và ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định, tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh mẫu thử Đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá kết quả

2.2.3.2 Chuẩn bị

Quá trình thực nghiệm được thực hiện tại khoa Vi sinh – Bệnh viện

TW Huế

Chuẩn bị chất thử: Hòa mẫu thử và mẫu chuẩn vào dung môi DMSO

được dung dịch gốc Pha loãng dung dịch gốc bằng dung môi DMSO thành các dung dịch có nồng độ thích hợp

Đối với cắn toàn phần và các phân đoạn, dung dịch gốc có nồng độ 100 mg/mL, pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 50 mg/mL,

10 mg/mL

Đối với chất tinh khiết, dung dịch gốc có nồng độ 4 mg/mL, pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 2 mg/mL, 1 mg/mL

Chứng dương: gentamicin 2 mg/mL

Chứng âm: DMSO

Chủng vi sinh vật thử nghiệm

- Vi khuẩn Gram dương

+ Staphylococcus aureus ATCC 1128

+ Bacillus subtilis ACTT 6633

- Vi khuẩn Gram âm

+ Escherichia coli ACTT 25922

+ Pseudomonas aeruginosa VN 201

Chuẩn bị chủng vi sinh vật: Cấy truyền chủng từ ống gốc lên một ống

thạch nghiêng, ủ vào tủ ấm 18 giờ ở 37 oC, dùng que cấy đã tiệt trùng lấy vi khuẩn đã phát triển trên bề mặt môi trường vào nước muối sinh lý sao cho đạt được nồng độ vi khuẩn 108

tế bào/mL

Chuẩn bị môi trường và cấy vi sinh vật kiểm định

- Môi trường Muller Hinton:

+ Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất và hòa tan vào nước cất 2 lần

+ Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch

- Dùng dụng cụ đục lỗ đã tiệt khuẩn đục 6 lỗ trên đĩa thạch dinh dưỡng

đã cấy vi khuẩn kiểm định Các lỗ đục được phân bố như hình 2

- Cho vào mỗi lỗ đục 50 µL dung dịch thử ở các nồng độ pha loãng

- Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng (25 oC) trong 2 giờ để chất thử khuếch tán vào môi trường thạch Sau đó, cho đĩa thạch vào tủ ấm ở nhiệt độ 35 o

C Sau 18 giờ lấy ra đọc kết quả

- Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước Palmer có độ chính xác

SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n : Số thí nghiệm làm song song (n=3)

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây gỗ nhỏ cao 5−6 m Cành có

nhựa mủ trắng, không có lông

Lá đơn, mọc đối hoặc mọc chụm ở

đầu cành Mặt trên màu xanh đậm, mặt

dưới màu xanh nhạt hơn Phiến lá không

có lông Lá thuôn dài, đầu lá nhọn, mép lá

Tên khoa học : Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae

Tên tiếng Việt: Nhục tử gần, Sến nạc nhỏ

Hình 3.1 Ảnh cây Nhục tử gần

Hình 3.2 Ảnh một số đặc điểm hình thái cây Nhục tử gần

cứng (5) và bó sợi (6) nằm xen kẽ tạo thành 1 vòng khép kín bao quanh

libe-gỗ Libe (7) gồm những tế bào nhỏ, hình dạng không xác định, bắt màu đỏ nằm xung quanh gỗ Mạch gỗ (8) bắt màu xanh kéo dài đến gần trung tâm Trong cùng là mô mềm ruột (9) gồm các tế bào thành mỏng to nhỏ không đều nhau Các túi tiết nhựa mủ có màu vàng nằm rải rác trong mô mềm vỏ và mô mềm ruột kích thước 0,09−0,12 mm (hình 3.3, 3.4)

* Đặc điểm bột: Bột có màu vàng nâu, vị đắng Soi dưới kính hiển vi

có các mảnh biểu bì (1) nằm rải rác Nhiều mạch vạch (7), mạch xoắn (8, 9) Tinh thể canxi oxalat (4,5) hình lăng trụ kích thước 0,03−0,04 mm Các tế bào

mô cứng (2) Hạt tinh bột (6) có kích thước 0,02−0,03 mm Có các mảnh mô mềm mang tinh bột (3) (hình 3.5)

Hình 3.3 Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 10)

1 Biểu bì 2 Mô dày 3 Mô mềm vỏ

4 Tế bào hóa mô cứng 5 Mô cứng 6 Sợi

4 Tinh thể canxi oxalat 5 Tế bào hóa mô cứng 6 Mô mềm vỏ

10 Gỗ

bì trên Mô mềm vỏ là những tế bào hình trứng, kích thước không đều, thành mỏng, xếp lộn xộn Mô cứng (4) và sợi (3) gồm những tế bào bắt màu xanh, xếp thành một vòng đều đặn bao quanh libe-gỗ Bó libe-gỗ có cấu trúc gồm 2 phần Phần gần với biểu bì trên có cấu tạo kiểu bó dẫn đồng tâm: libe (7) bên ngoài bao bọc gỗ (5) bên trong Phần gần với biểu bì dưới có cấu tạo kiểu bó dẫn chồng chất hở: các bó gỗ ở phía trên chồng chất lên libe ở phía dưới Mô

mềm ruột gồm những tế bào thành mỏng, không đều, xếp giữa 2 phần của bó libe-gỗ Trong gân lá có các ống tiết (6) nằm rải rác, là các lỗ thủng lớn nằm ngoài libe-gỗ, có kích thước lớn hơn rất nhiều so với tế bào mô mềm xung quanh (hình 3.6, 3.8)

- Vi phẫu phiến lá: Biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (5) là những tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn thành hàng Biểu bì dưới (5) có các lỗ khí (6) nằm rải rác Hạ bì (2) gồm 2 lớp tế bào hình chữ nhật xếp ngay dưới biểu bì trên

Mô dậu (3) gồm những tế bào hình chữ nhật xếp thành 2 hàng vuông góc với lớp hạ bì Mô khuyết (4) hình dạng không xác định nằm rải rác trong phiến lá (hình 3.7)

* Đặc điểm bột: Bột có màu xanh, vị đắng Soi dưới kính hiển vi có các

tế bào biểu bì màu xanh mang lỗ khí Kích thước lỗ khí 0,06−0,07 mm Các tế bào cứng nằm rải rác Mảnh mạch, mạch xoắn, bó sợi (hình 3.9)

Hình 3.6 Các đặc điểm bột lá Nhục tử gần

1 Mảnh phiến lá 2, 3 Tế bào mô cứng 4 Mảnh mạch

5 Mảnh biểu bì mang lỗ khí 6, 8 Lỗ khí 7 Mạch xoắn

9 Bó sợi

Hình 3.7.Vi phẫu gân lá Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 10)

1 Biểu bì trên 2 Mô dày 3 Sợi 4 Mô cứng

5 Gỗ 6 Ống tiết 7 Libe 8 Biểu bì dưới

Hình 3.8.Vi phẫu phiến lá Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 40)

Hình 3.9 Vi phẫu gân lá Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 40)

1 Cutin 2 Biểu bì trên 3,10 Mô dày

4 Ống tiết 5 Mô cứng 6 Sợi