Phần trên mặt đất của cây Nhục tử gần đƣợc rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khơ ở 55 oC, sau đĩ xay thành bột thơ và tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất. Lƣợng bột thơ đem chiết xuất là 3,5 kg.
34
3.2.2.1. Chiết xuất cao tồn phần
Tồn bộ lƣợng bột đƣợc cho vào bình chiết, làm ẩm bằng methanol, đậy kín và để yên cho đến khi thấm ẩm, trƣơng nở hồn tồn. Sau đĩ thêm methanol sao cho lớp dung mơi ngập trên bề mặt dƣợc liệu khoảng 3 cm để ngâm chiết ở nhiệt độ phịng. Tiến hành chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 7 ngày. Gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung mơi dƣới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 oC thu đƣợc 114,6 g cao chiết đậm đặc.
3.2.2.2. Chiết các phân đoạn
Phân tán tồn bộ cao cắn trên vào 2 lít nƣớc trong bình thủy tinh dung tích 5 lít. Thêm 2,5 lít dung mơi n-hexan, lắc đều hỗn hợp trong bình trong thời gian 15 phút. Để yên cho dung mơi phân lớp. Gạn lấy lớp dung mơi n-
hexan. Lớp nƣớc cịn lại trong bình đƣợc thêm tiếp 2,5 lít dung mơi n-hexan. Tiến hành làm lặp lại 5 lần. Gộp dịch chiết n-hexan, cất thu hồi dung mơi dƣới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 o
C thu đƣợc cắn phân đoạn n-hexan (kí hiệu H) khối lƣợng 35,4 g. Tiếp tục làm tƣơng tự lần lƣợt với các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần gồm: chloroform, ethyl acetat và n-butanol thu đƣợc các cắn tƣơng ứng cho các phân đoạn là chloroform (kí hiệu C) khối lƣợng 18,6 g, ethyl acetat (kí hiệu E) khối lƣợng 13,1 g và n-butanol (kí hiệu B) khối lƣợng 20,9 g. Phần dịch nƣớc cịn lại cơ quay dƣới áp suất giảm ở 50 oC cho bay hơi hết các dung mơi hữu cơ, sau đĩ đƣa lên cột Dianion HP-20. Rửa cột nhiều lần bằng nƣớc cất, tiếp theo cho methanol chảy qua cột, thu đƣợc dịch chiết phân đoạn nƣớc (kí hiệu N) khối lƣợng 23,3 g. Sơ đồ quy trình chiết các phân đoạn đƣợc mơ tả ở sơ đồ 3.10.
Dựa vào kết quả thử hoạt tính sinh học của các phân đoạn đã thực hiện, phân đoạn chloroform đƣợc ƣu tiên lựa chọn để phân lập trƣớc.
3.2.2.3. Tiến hành phân lập phân đoạn chloroform (phân đoạn C)
Cắn phân đoạn C (18,6 g) đƣợc phân tán vào lƣợng methanol tối thiểu, sau đĩ tẩm với silica gel pha thƣờng, tỷ lệ khối lƣợng 1:1. Đƣa khối silica gel
35
ẩm này vào bình cơ quay, bốc hơi dung mơi đến bột thể chất tơi mịn. Bột khơ thu đƣợc dùng để phân lập trong bƣớc tiếp theo.
Cột sắc ký đƣờng kính 8 cm đƣợc rửa sạch để khơ tự nhiên. Lĩt bơng ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá. Cho silica gel pha thƣờng lên cột sao cho bề dày lớp silica gel khoảng 1 cm, sau đĩ đƣa lƣợng chất đã tẩm silica gel nĩi trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều.
Triển khai cột với hệ dung mơi rửa giải là n-hexan:aceton lần lƣợt với các tỷ lệ 100:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, aceton 100% (1,5 lít cho mỗi hệ). Hứng các phân đoạn, cơ quay cất thu hồi dung mơi thu đƣợc các cắn tƣơng ứng, khảo sát bằng SKLM và gộp các phân đoạn tƣơng tự nhau thì thu đƣợc 5 phân đoạn ký hiệu lần lƣợt từ C1 đến C5. Các phân đoạn này đƣợc dùng cho việc phân lập hoạt chất tinh khiết trong giai đoạn tiếp theo.