2.2.2.1. Định tính một số nhĩm chất hữu cơ trong dƣợc liệu
Sơ bộ định tính các nhĩm chất hữu cơ theo phƣơng pháp phân tích sàng lọc các nhĩm hợp chất thiên nhiên cĩ trong cây bằng phản ứng hĩa học đặc trƣng [1], [4]. Dự kiến định tính các nhĩm chất: alkaloid, anthranoid, acid hữu cơ, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycosid tim, acid amin, chất béo, đƣờng khử, steroid.
2.2.2.2. Chiết xuất
Chiết xuất: bột dƣợc liệu đƣợc chiết bằng phƣơng pháp ngâm với dung mơi methanol ở nhiệt độ phịng. Chiết 3 lần, mỗi lần chiết trong 1 tuần. Gộp dịch chiết thu đƣợc rồi bốc hơi dung mơi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc cao tồn phần.
Chiết xuất phân đoạn: phân tán cao tồn phần với nƣớc trong bình thủy tinh dung tích 5 lít. Tiến hành lắc phân đoạn với các dung mơi hữu cơ cĩ độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-butanol trong bình gạn, thu đƣợc lần lƣợt các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-
butanol và phần nƣớc cịn lại. Bốc hơi dung mơi bằng máy cơ quay thu đƣợc cao cắn tƣơng ứng của từng phân đoạn.
2.2.2.3. Phân lập
Quá trình phân lập hợp chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là cột hấp phụ và cột lọc qua gel. Các phân đoạn trong quá trình phân lập đƣợc theo dõi bằng SKLM.
Đặc điểm chính của những phƣơng pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu nhƣ sau:
- Sắc ký cột hấp phụ
+ Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp với hai pha khơng trộn lẫn, trong đĩ pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn đƣợc nhồi trong cột
20
thủy tinh. Nhờ vậy mà cĩ thể khai triển dung mơi liên tục với nhiều hệ dung mơi khác nhau cĩ độ phân cực thay đổi [4].
+ Chất nhồi cột là silica gel pha thƣờng, silica gel pha đảo. - Sắc ký lọc qua gel
+ Nguyên tắc: Sắc ký lọc qua gel là phƣơng pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thƣớc của chúng thơng qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung mơi pha động và cùng dung mơi đĩ đƣợc pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thƣớc lỗ của gel xác định khoảng kích thƣớc phân tử đƣợc phân tách qua quá trình sắc ký [4].
+ Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20. Phƣơng pháp nhồi cột ƣớt đƣợc sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại sắc ký cột [4].
- Phƣơng pháp SKLM
+ Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thƣờng và pha đảo. + Nguyên tắc: SKLM là phƣơng pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ trong đĩ dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vơ cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tuỳ theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại những vị trí khác nhau [1].
+ Sắc ký đồ đƣợc quan sát dƣới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sĩng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Magic, thuốc thử Dragendoff v.v..
2.2.2.4. Xác định cấu trúc
Cấu trúc các hợp chất đƣợc xác định dựa trên các thơng số vật lý nhƣ thể chất, màu sắc, phổ khối lƣợng phân giải cao và các dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) [4], [8]. Phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-EI-MS) đƣợc sử dụng để xác định cơng thức phân tử của hợp chất. Cơng thức cấu tạo của hợp chất đƣợc xác định dựa vào phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1
21 13
C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC). Kết quả biện luận cấu trúc hĩa học đƣợc khẳng định sau khi giải phổ và so sánh với số liệu phổ trong các nghiên cứu đã đƣợc cơng bố trƣớc đĩ.
Phổ khối phân giải cao (HR-EI-MS) đƣợc đo trên máy micrOTOF-Q 10187. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC) đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất nội chuẩn là tetramethyl silane (TMS), dung mơi đo phổ pyridine-d5. Quá trình đo phổ thực hiện tại Viện Nghiên cứu Thuốc Tự nhiên, Trƣờng Đại học Toyama - Nhật Bản.