Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tồn phần và các phân đoạn đối với mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm đƣợc mơ tả trong các bảng 3.6, 3.7 và 3.8.
Bảng 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tồn phần và các phân đoạn đối với Staphylococcus aureus
Cao chiết Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn (mm) 100 mg/mL 50 mg/mL 10 mg/mL Methanol 15,3 ± 0,2 13,0 ± 0,2 − n-hexan 11,1 ± 0,1 − − Chloroform 18,4 ± 0,2 16,1 ± 0,2 − Ethyl acetat 18,1 ± 0,2 15,1 ± 0,1 − n-butanol 13,0 ± 0,1 10,1 ± 0,2 − Nƣớc − − − Gentamicin 2 mg/mL 30,1 ± 0,1 DMSO −
50
Bảng 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tồn phần và các phân đoạn đối với Escherichia coli
Cao chiết Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn (mm) 100 mg/mL 50 mg/mL 10 mg/mL Methanol 12,4 ± 0,2 10,1 ± 0,2 − n-hexan − − − Chloroform 17,4 ± 0,1 16,3 ± 0,2 − Ethyl acetat 17,0 ± 0,1 − − n-butanol 12,0 ± 0,1 − − Nƣớc − − − Gentamicin 2 mg/mL 26,1 ± 0,1 DMSO −
Giá trị thể hiện ở các cột là giá trị trung bình ± SD, (−) khơng cĩ khả năng ức chế, n=3
Bảng 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tồn phần và các phân đoạn đối với Pseudomonas aeruginosa
Cao chiết Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn (mm) 100 mg/mL 50 mg/mL 10 mg/mL Methanol 10,1 ± 0,1 − − n-hexan − − − Chloroform 16,9 ± 0,1 14,1 ± 0,1 − Ethyl acetat 15,3 ± 0,1 12,6 ± 0,1 − n-butanol − − − Nƣớc − − − Gentamicin 2 mg/mL 28,4 ± 0,2 DMSO −
51
Cao chiết tồn phần và các phân đoạn khơng thể hiện tác dụng ức chế
Bacilus subtilis ở các nồng độ thử nghiệm: 100 mg/mL, 50 mg/mL, 10 mg/mL.
Nhận xét: Từ các bảng kết quả trên, ta nhận thấy:
Cao chiết tổng methanol ở nồng độ 100mg/ml cĩ hoạt tính mạnh nhất trên vi khuẩn Staphylococcus aureus (15,3 mm), tác dụng yếu hơn đối với
Escherichia coli (12,4 mm), Pseudomonas aeruginosa (10,1 mm), và khơng cĩ hoạt tính đối với Bacilus subtilis (khơng cĩ vịng vơ khuẩn).
Cao chiết methanol và các phân đoạn đều khơng thể hiện hoạt tính ở nồng độ 10 mg/mL (khơng cĩ vịng vơ khuẩn).
Trong các phân đoạn nghiên cứu, nhìn chung phân đoạn chloroform và ethyl acetat cĩ hoạt tính mạnh nhất và mạnh hơn dịch chiết methanol. Trong đĩ hoạt tính của phân đoạn chloroform mạnh hơn phân đoạn ethyl acetat ở nồng độ 100 mg/mL trên vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (đƣờng kính vịng vơ khuẩn lớn hơn gấp 1,18 lần).
Phân đoạn n-hexan chỉ cĩ tác dụng trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ 100 mg/mL với đƣờng kính vịng vơ khuẩn là 11,1 mm. Ở các nồng độ thấp hơn 50 mg/mL và 10 mg/mL, phân đoạn n-hexan khơng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn.
Phân đoạn nƣớc khơng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở tất cả các nồng độ thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn.
3.4.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết phân lập từ cây Nhục tử gần
Các hợp chất tinh khiết sau khi phân lập đƣợc tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn ở các nồng độ 4 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất đƣợc mơ tả trong bảng 3.9, 3.10, 3.11, 3.12.
52
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Staphylococcus aureus
Hợp chất Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn (mm)
4 mg/mL 2 mg/mL 1 mg/mL SAC8 23,3±0,3 23,0±0,1 21,9±0,1 SAC9 − − − SAC18 21,2±0,3 20,8±0,1 19,5±0,1 SAC22 − − − Gentamicin 2 mg/mL 30,0±0,1 DMSO −
Giá trị thể hiện ở các cột là giá trị trung bình ± SD, (−) khơng cĩ khả năng ức chế, n=3
Nhận xét:
SAC9 và SAC22 khơng cĩ khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus ở tất cả các nồng độ thử nghiệm. Hợp chất SAC8 và SAC18 cĩ hoạt tính ở mức độ vừa phải với đƣờng kính vịng vơ khuẩn lần lƣợt bằng 1,3 và 1,44 lần so với chứng dƣơng ở cùng nồng độ.
Bảng 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Bacillus subtilis
Hợp chất Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn (mm)
4 mg/mL 2 mg/mL 1 mg/mL SAC8 27,4±0,1 25,3±0,3 24,0±0,1 SAC9 − − − SAC18 22,0±0,1 21,9±0,1 19,9±0,2 SAC22 − − − Gentamicin 2 mg/mL 30,9±0,1 DMSO −
53
Nhận xét:
Trên chủng Bacillus subtilis, SAC9 và SAC22 khơng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. SAC8 nhìn chung cĩ hoạt tính mạnh hơn SAC18 ở các nồng độ thử nghiệm. Khi so sánh với chứng dƣơng ở cùng nồng độ 2 mg/mL, hợp chất SAC8 cĩ hoạt tính bằng 82% so với chứng dƣơng.
Bảng 3.11. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Escherichia coli
Hợp chất Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn (mm)
4 mg/mL 2 mg/mL 1 mg/mL SAC8 23,4±0,1 23,1±0,1 21,9±0,2 SAC9 − − − SAC18 22,1±0,2 21,7±0,2 19,6±0,1 SAC22 − − − Gentamicin 2 mg/mL 29,9±0,1 Chứng âmb −
Giá trị thể hiện ở các cột là giá trị trung bình ± SD, (−) khơng cĩ khả năng ức chế, n=3
Nhận xét:
Trên chủng Escherichia coli, SAC9 và SAC22 cũng khơng thể hiện hoạt tính. SAC8 và SAC18 cĩ hoạt tính gần tƣơng đƣơng nhau và thấp hơn so với chứng dƣơng 1,29 và 1,38 lần ở cùng nồng độ 2 mg/mL.
Bảng 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Pseudomonas aeruginosa
Hợp chất Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn (mm)
4 mg/mL 2 mg/mL 1 mg/mL
SAC8 19,1±0,1 19,0±0,2 16,0±0,2
SAC9 − − −
SAC18 21,3±0,1 21,2±0,1 19,3±0,1
54
Gentamicin 2 mg/mL 28,4±0,1
DMSO −
Giá trị thể hiện ở các cột là giá trị trung bình ± SD, (−) khơng cĩ khả năng ức chế, n=3
SAC9 và SAC22 khơng cĩ hoạt tính với Pseudomonas aeruginosa ở điều kiện thử nghiệm. Hoạt tính của SAC8 nhìn chung yếu hơn so với SAC18 ở tất cả các nồng độ và thấp hơn so với chứng dƣơng lần lƣợt 1,49 và 1,34 lần.
Nhƣ vậy, từ các kết quả thí nghiệm cĩ thể thấy: SAC9 và SAC22 khơng cĩ hoạt tính trên tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu. SAC8 và SAC18 cĩ khả năng ức chế vi khuẩn ở các mức độ khác nhau. Trong đĩ SAC8 cĩ hoạt tính mạnh hơn so với SAC18 trên các chủng Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli nhƣng yếu hơn trên chủng
Pseudomonas aeruginosa.
Ở nồng độ 4 mg/mL, SAC8 cĩ hoạt tính mạnh nhất trên vi khuẩn
Bacilus subtilis với đƣờng kính vịng vơ khuẩn là 27,4 mm, SAC18 cĩ tác dụng tốt nhất trên 2 chủng Bacilus subtilis và Escherichia coli với đƣờng kính vịng vơ khuẩn tƣơng ứng là 22,0 và 22,1 mm.
55
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
Nhận biết đúng cây thuốc là việc làm quan trọng trong cơng tác thu thập, kiểm nghiệm, nghiên cứu dƣợc liệu. Cùng với nhận biết dƣợc liệu, việc xác định đúng tên khoa học của cây là cần thiết trong khởi đầu nghiên cứu và phát triển thuốc cĩ nguồn gốc từ cây cỏ.
Để nhận biết, kiểm nghiệm dƣợc liệu ngƣời ta thƣờng sử dụng kết hợp nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ cảm quan, phân tích đặc điểm hình thái, sử dụng kính hiển vi để quan sát các đặc điểm vi học, nghiên cứu hố học gồm sử dụng các phƣơng pháp kinh điển kết hợp các phƣơng pháp hiện đại nhƣ phản ứng hĩa học, các phƣơng pháp sắc ký, sắc ký hiệu năng cao v.v..
Ở Việt Nam, chi Sarcosperma thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae) phân bố trên nhiều vùng khác nhau, bao gồm 5 lồi, với các đặc điểm hình thái tƣơng đối giống nhau. Đến nay, các nghiên cứu vi học về các lồi trong chi
Sarcosperma ở Việt Nam và trên thế giới vẫn chƣa đƣợc cơng bố. Qua quá trình nghiên cứu, chúng tơi đã xác định đƣợc các đặc điểm vi học điển hình của dƣợc liệu nhƣ: vi phẫu thân cĩ lớp cutin dày bao bọc biểu bì, tế bào hĩa mơ cứng nằm rải rác trong mơ mềm vỏ, bĩ sợi nằm xen kẽ với mơ cứng, tinh thể canxi oxalat hình lăng trụ, các túi tiết nhựa mủ. Trong bột thân cĩ thể quan sát thấy các tinh thể canxi oxalat cĩ kích thƣớc khoảng 0,03−0,04 mm, hạt tinh bột với vân và rốn rõ, kích thƣớc từ 0,02−0,03 mm. Hoặc vi phẫu gân lá cĩ cấu tạo khá điển hình với cấu trúc bĩ libe-gỗ cĩ phần trên kiểu bĩ dẫn đồng tâm, phần dƣới kiểu bĩ dẫn chồng chất hở, các lỗ tiết với đƣờng kính lớn nằm rải rác trong vi phẫu. Trong bột lá cĩ các lỗ khí nằm riêng lẻ hoặc trong các mảnh biểu bì kích thƣớc 0,06−0,07 mm.
Đây là những đặc điểm đặc trƣng của cây Nhục tử gần cĩ thể sử dụng để sơ bộ nhận biết, phân biệt, kiểm nghiệm dƣợc liệu bằng phƣơng pháp soi bột,
56
vi phẫu. Việc xác định đƣợc các đặc điểm vi học bao gồm đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột lá và cành Nhục tử gần gĩp phần tiêu chuẩn hĩa dƣợc liệu này, tạo cơ sở cho quá trình thu thập mẫu trong các nghiên cứu tiếp theo.
4.2. THÀNH PHẦN HĨA HỌC
Hiện nay, trong lĩnh vực nghiên cứu hĩa thực vật, phƣơng pháp nghiên cứu, phân lập hợp chất tự nhiên theo định hƣớng tác dụng sinh học đƣợc sử dụng khá phổ biến. Phƣơng pháp này cĩ ƣu điểm đem lại xác xuất thành cơng cao hơn trong việc tìm ra các hoạt chất cĩ tác dụng sinh học nhờ định hƣớng ban đầu, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết các phân đoạn, phân đoạn chloroform cĩ hoạt tính tốt hơn đã đƣợc ƣu tiên cho nghiên cứu thành phần hĩa học.
Theo tổng quan tài liệu, cho đến nay vẫn chƣa cĩ cơng bố nào về thành phần hĩa học của lồi Nhục tử gần hay của chi Sarcosperma. Đĩ cũng là khĩ khăn ban đầu cho nhĩm nghiên cứu trong định hƣớng phân lập hoạt chất. Từ phần trên mặt đất của lồi Nhục tử gần thu hái tại Vƣờn Quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế, đề tài đã phân lập đƣợc bốn hợp chất thuộc nhĩm triterpen là acid oleanolic, acid pomolic, acid euscaphic và acid myrianthic. Theo các tài liệu đã cơng bố, acid oleanolic và acid myrianthic là 2 triterpen đã đƣợc phân lập trƣớc đĩ trong một số lồi thuộc họ Sapotaceae [15], [34], [51]. Tuy nhiên đây là cơng bố đầu tiên các hợp chất này cĩ trong cây Nhục tử gần.
Trong bốn hợp chất đã phân lập đƣợc, acid oleanolic là triterpen thuộc nhĩm olean, acid pomolic, acid euscaphic và acid myrianthic là các triterpen thuộc nhĩm ursan. Đây là 2 khung cấu trúc triterpen cĩ hoạt tính sinh học phong phú. Các hợp chất này cĩ đặc điểm chung về các nhĩm chức trong cấu trúc nhƣ nhĩm COOH ở C-17, OH ở C-3 và liên kết π ở C-12, C-13, đây là các nhĩm chức đƣợc đánh giá là cĩ vai trị quan trọng đối với nhiều hoạt tính sinh học nhƣ kháng khuẩn, kháng virus, chống viêm [23].
57
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của acid euscaphic và acid myrianthic cho đến nay vẫn cịn rất hạn chế. Hoạt tính sinh học đƣợc quan tâm nhất đối với acid euscaphic đĩ là tác dụng chống tăng đƣờng huyết. Nghiên cứu đã đƣợc tiến hành trên chuột gây tăng đƣờng huyết bằng alloxan với chất đối chứng là gliclazide. Kết quả cho thấy ở liều 50 mg/kg, nồng độ glucose máu ở chuột gây tăng đƣờng huyết sau khi dùng acid euscaphic và gliclazide 4 giờ lần lƣợt giảm cịn 14,37 và 15,59 mmol/L so với ban đầu là 21,56 mmol/L. Đối với chuột bình thƣờng, ở liều 50 mg/kg, acid euscaphic chỉ gây hạ đƣờng huyết nhẹ trong khi gliclazide gây hạ đƣờng huyết mạnh hơn. Các kết quả này cho thấy, acid euscaphic là một chất cĩ tác dụng hạ đƣờng huyết mạnh và khá an tồn [26]. Với acid myrianthic, hiện chỉ cĩ nghiên cứu in vitro của Jin và cộng sự (2004) [27] cho thấy acid myrianthic cĩ tác dụng chống ngƣng tập tiểu cầu tƣơng đối mạnh. Giá trị IC50 của acid myrianthic và acid acetyl salicylic lần lƣợt là 46,2 và 57 µM trên chuột gây kết tập tiểu cầu bằng epinephrine. Ngồi ra, vẫn chƣa cĩ thêm hoạt tính sinh học nào của acid myrianthic đƣợc phát hiện.
Acid oleanolic và acid pomolic là hai triterpen đã đƣợc nghiên cứu khá nhiều về hoạt tính sinh học nhƣ diệt tế bào ung thƣ, kháng viêm, kháng HIV v.v.. Các nghiên cứu cho thấy acid oleanolic cĩ hoạt tính trên các dịng tế bào ung thƣ A549, SK-OV-3, SK-MEL-3, HONE-1 và KB với giá trị ED50 từ 12,1−18,5 µg/mL và acid pomolic cĩ hoạt tính trên dịng tế bào HL-60, K562, MCF7 với giá trị ED50 10−50 µg/mL [33]. Tuy nhiên, cơ chế tác dụng của hai hợp chất này lại khác nhau. Acid oleanolic diệt các tế bào ung thƣ nhờ vào khả năng chống đột biến gen, ngăn cản sự hình thành mạng lƣới mạch máu ở các tổ chức ung thƣ, đồng thời kích thích giải phĩng yếu tố hoại tử khối u TNF-α nhờ khả năng kích hoạt DNA gắn với phức hợp phiên mã NF- κB. Trong khi đĩ, cơ chế dƣợc lý của acid pomolic là nhờ hoạt hĩa enzyme AMPK, một tác nhân quan trọng trong việc ức chế sự tăng sinh của tế bào
58
ung thƣ và kích hoạt quá trình gây chết tế bào thơng qua con đƣờng phụ thuộc vào ty thể [33].
Acid oleanolic và acid pomolic đều cho thấy tác dụng kháng viêm đáng kể trên mơ hình thử nghiệm gây phù bàn chân chuột bằng carragenan. Cụ thể, acid pomolic làm giảm 60% độ phù bàn chân sau 3h ở liều 125 mg/kg và acid oleanolic làm giảm 93% ở liều 40mg/kg [20], [32]. Acid pomolic cĩ tác dụng chống viêm thơng qua việc ức chế giải phĩng IL-1β nhƣng khơng ức chế TNF-α. Trong khi đĩ, acid oleanolic cĩ tác dụng chống viêm thơng qua nhiều cơ chế khác nhau bao gồm ức chế lipoxygenase và cyclooxygenase, elastase và cĩ thể thơng qua sự ức chế C3-convertase. Hai hợp chất này cịn cĩ tác dụng kháng virus HIV. Acid oleanolic và acid pomolic ức chế quá trình nhân đơi của virus với giá trị IC50 lần lƣợt là 21,8 và 23,3 µg/mL [28].
4.3. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tồn phần và các phân đoạn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đây là phƣơng pháp phổ biến để sàng lọc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cho kết quả nhanh và chính xác. Gentamicin đƣợc sử dụng làm chứng dƣơng đối với cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Gentamicin một kháng sinh trong họ aminosid, cĩ tác dụng diệt khuẩn mạnh với phần lớn các vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm (các chủng vi khuẩn thuần chủng thử nghiệm). Thực nghiệm cho thấy Gentamicin cĩ hoạt tính ức chế trên cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Kết quả này đƣợc dùng để xác định tính đúng của mơ hình nghiên cứu, đồng thời để so sánh với các giá trị vịng vơ khuẩn giữa các dung dịch thử nghiệm và đối chứng. Chứng âm đƣợc sử dụng là DMSO, đây là dung mơi đƣợc sử dụng để pha lỗng cắn các phân đoạn và hợp chất tinh khiết. Yêu cầu đối với dung mơi sử dụng trong thử hoạt tính kháng khuẩn đĩ là cĩ khả năng hịa tan hồn tồn chất thử và khơng cĩ hoạt tính kháng khuẩn. Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, các dung mơi thƣờng đƣợc sử dụng để pha lỗng các dung dịch thử cĩ
59
thể là nƣớc cất, NaCl 0,9% hoặc DMSO. Trong nghiên cứu này nƣớc cất và NaCl 0,9% là các dung mơi phân cực khơng thể hịa tan cắn của các phân đoạn chiết bằng dung mơi hữu cơ nhƣ n-hexan, chloroform, ethyl acetat hay các chất tinh khiết (là các triterpen), do đĩ DMSO đã đƣợc lựa chọn để sử dụng làm dung mơi hịa tan đồng thời là đối chứng âm. Kết quả thử nghiệm cho thấy DMSO cĩ khả năng hịa tan tốt đối với các chất thử và khơng thể hiện hoạt tính ức chế đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm.
Đây là lần đầu tiên, hoạt tính kháng khuẩn của cây Nhục tử gần đƣợc nghiên cứu. Do đĩ, nồng độ thử nghiệm đƣợc lựa chọn là nồng độ thƣờng đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với các đối tƣợng nghiên