2.1.1. Mẫu nghiên cứu
Mẫu cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae) đƣợc thu hái vào tháng 6/2014 tại Vƣờn Quốc gia Bạch Mã – Thừa Thiên Huế.
Mẫu nghiên cứu Nhục tử gần gồm:
- Mẫu cây thu hái mang bộ phận sinh sản để làm giám định tên khoa học và làm tiêu bản khơ.
- Mẫu cây tƣơi bao gồm cành và lá, bột khơ cành, lá để nghiên cứu đặc điểm vi học.
- Cành và lá rửa sạch, thái nhỏ, sấy ở 50 C, sau đĩ xay thành bột thơ và bảo quản ở nơi khơ thống để nghiên cứu thành phần hĩa học và hoạt tính sinh học.
Hình 2.1. Ảnh cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae)
2.1.2. Các chủng vi sinh vật thử nghiệm
Các chủng vi khuẩn kiểm định đƣợc dùng trong thí nghiệm gồm: - Vi khuẩn Gram dƣơng
+ Staphylococcus aureus ATCC 1128
+ Bacillus subtilis ACTT 6633
17 + Escherichia coli ACTT 25922
+ Pseudomonas aeruginosa VN 201
Các chủng vi khuẩn thử nghiệm đƣợc lấy từ khoa Vi sinh, bệnh viện TW Huế.
2.1.3. Thuốc thử, dung mơi, hĩa chất
Dung mơi đƣợc sử dụng bao gồm: methanol, ethanol, n-butanol, ethyl acetat, chloroform, n-hexan, aceton, toluen, acid formic, amoniac, dichloromethan, nƣớc cất, acid acetic v.v..
Thuốc thử đƣợc sử dụng gồm cĩ: dung dịch H2SO4 10% pha trong ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Dragendoff, Mayer, Bouchardat, các thuốc thử định tính...
Các hố chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dƣợc Điển Việt Nam IV.
Mơi trƣờng nuơi cấy vi khuẩn: Muller Hinton.
2.1.4. Máy mĩc - thiết bị
Quan sát các đặc điểm vi phẫu, bột cành và lá, chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi chụp ảnh Nikon E100 tại bộ mơn Thực vật, khoa Dƣợc trƣờng ĐH Y Dƣợc Huế.
Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, cốc cĩ mỏ nhiều thể tích, đũa thủy tinh, ống sinh hàn, bình tam giác, bình gạn, bình chạy sắc ký, pipette các loại,...
Chất nhồi cột sắc ký: silica gel pha thƣờng (silica gel 60, 0,040−0,063 mm, Merck) và pha đảo (YMC, 30−50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex LH-20, Dianion HP-20. Ngồi ra cịn sử dụng sắc ký lớp mỏng pha thƣờng (TLC silica gel 60 F254, Merck) và pha đảo (RP-18, Merck).
Máy đo phổ khối phân giải cao (HR-EI-MS): MicrOTOF-Q 10187 tại Viện nghiên cứu thuốc tự nhiên, Đại học Toyama, Nhật Bản.
Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS
18
là chất chuẩn nội) tại Viện nghiên cứu thuốc tự nhiên, Đại học Toyama, Nhật Bản.
Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, độ chính xác 0,0001 g. Micropipette 100, 200, 500 µL (Human), micropipette 50 µL (Excel monopette 8000). Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cơ quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân khơng.
Máy đo độ đục, tủ ấm nuơi cấy vi khuẩn, tủ sấy vơ khuẩn, đĩa petri, dụng cụ đục lỗ thạch.
Thử hoạt tính kháng khuẩn đƣợc thực hiện tại khoa Vi sinh – bệnh viện TW Huế.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật
2.2.1.1. Vi phẫu thân và lá
Phƣơng pháp làm tiêu bản tạm thời: Dƣợc liệu tƣơi hay khơ đã ngâm mềm cắt ngang thành lát cắt mỏng. Ngâm nƣớc Javen khoảng 30 phút để tẩy các chất trong các tế bào. Rửa nƣớc nhiều lần. Rửa acid acetic. Rửa lại bằng nƣớc. Nhuộm vi phẫu trong xanh methylen khoảng 15−30 giây. Rửa bằng nƣớc. Nhuộm đỏ carmin khoảng 30−60 phút. Rửa nƣớc. Đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên lam kính, đậy lamen. Soi tiêu bản dƣới kính hiển vi, chụp ảnh và mơ tả các đặc điểm của vi phẫu [2].
2.2.1.2. Soi bột thân và lá
Dƣợc liệu sau khi thu hái đƣợc sấy khơ, nghiền mịn thành bột, rây cho bột cĩ kích thƣớc phù hợp. Để bột dƣợc liệu lên lam kính cĩ sẵn giọt nƣớc cất, đậy lamen và quan sát các đặc điểm dƣới kính hiển vi. Chụp ảnh và mơ tả các đặc điểm bột dƣợc liệu [2].
19
2.2.2. Nghiên cứu về hĩa học [4]
2.2.2.1. Định tính một số nhĩm chất hữu cơ trong dƣợc liệu
Sơ bộ định tính các nhĩm chất hữu cơ theo phƣơng pháp phân tích sàng lọc các nhĩm hợp chất thiên nhiên cĩ trong cây bằng phản ứng hĩa học đặc trƣng [1], [4]. Dự kiến định tính các nhĩm chất: alkaloid, anthranoid, acid hữu cơ, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycosid tim, acid amin, chất béo, đƣờng khử, steroid.
2.2.2.2. Chiết xuất
Chiết xuất: bột dƣợc liệu đƣợc chiết bằng phƣơng pháp ngâm với dung mơi methanol ở nhiệt độ phịng. Chiết 3 lần, mỗi lần chiết trong 1 tuần. Gộp dịch chiết thu đƣợc rồi bốc hơi dung mơi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc cao tồn phần.
Chiết xuất phân đoạn: phân tán cao tồn phần với nƣớc trong bình thủy tinh dung tích 5 lít. Tiến hành lắc phân đoạn với các dung mơi hữu cơ cĩ độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-butanol trong bình gạn, thu đƣợc lần lƣợt các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-
butanol và phần nƣớc cịn lại. Bốc hơi dung mơi bằng máy cơ quay thu đƣợc cao cắn tƣơng ứng của từng phân đoạn.
2.2.2.3. Phân lập
Quá trình phân lập hợp chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là cột hấp phụ và cột lọc qua gel. Các phân đoạn trong quá trình phân lập đƣợc theo dõi bằng SKLM.
Đặc điểm chính của những phƣơng pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu nhƣ sau:
- Sắc ký cột hấp phụ
+ Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp với hai pha khơng trộn lẫn, trong đĩ pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn đƣợc nhồi trong cột
20
thủy tinh. Nhờ vậy mà cĩ thể khai triển dung mơi liên tục với nhiều hệ dung mơi khác nhau cĩ độ phân cực thay đổi [4].
+ Chất nhồi cột là silica gel pha thƣờng, silica gel pha đảo. - Sắc ký lọc qua gel
+ Nguyên tắc: Sắc ký lọc qua gel là phƣơng pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thƣớc của chúng thơng qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung mơi pha động và cùng dung mơi đĩ đƣợc pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thƣớc lỗ của gel xác định khoảng kích thƣớc phân tử đƣợc phân tách qua quá trình sắc ký [4].
+ Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20. Phƣơng pháp nhồi cột ƣớt đƣợc sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại sắc ký cột [4].
- Phƣơng pháp SKLM
+ Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thƣờng và pha đảo. + Nguyên tắc: SKLM là phƣơng pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ trong đĩ dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vơ cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tuỳ theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại những vị trí khác nhau [1].
+ Sắc ký đồ đƣợc quan sát dƣới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sĩng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc, thuốc thử Magic, thuốc thử Dragendoff v.v..
2.2.2.4. Xác định cấu trúc
Cấu trúc các hợp chất đƣợc xác định dựa trên các thơng số vật lý nhƣ thể chất, màu sắc, phổ khối lƣợng phân giải cao và các dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) [4], [8]. Phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-EI-MS) đƣợc sử dụng để xác định cơng thức phân tử của hợp chất. Cơng thức cấu tạo của hợp chất đƣợc xác định dựa vào phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1
21 13
C-NMR) và hai chiều (HMBC, HSQC). Kết quả biện luận cấu trúc hĩa học đƣợc khẳng định sau khi giải phổ và so sánh với số liệu phổ trong các nghiên cứu đã đƣợc cơng bố trƣớc đĩ.
Phổ khối phân giải cao (HR-EI-MS) đƣợc đo trên máy micrOTOF-Q 10187. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC) đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất nội chuẩn là tetramethyl silane (TMS), dung mơi đo phổ pyridine-d5. Quá trình đo phổ thực hiện tại Viện Nghiên cứu Thuốc Tự nhiên, Trƣờng Đại học Toyama - Nhật Bản.
2.2.3. Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn 2.2.3.1. Nguyên tắc 2.2.3.1. Nguyên tắc
Mẫu thử đƣợc cho vào lỗ đục trên đĩa thạch dinh dƣỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, trong điều kiện nuơi cấy thích hợp. Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào mơi trƣờng thạch và ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định, tạo thành vịng vơ khuẩn xung quanh mẫu thử. Đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn để đánh giá kết quả.
2.2.3.2. Chuẩn bị
Quá trình thực nghiệm đƣợc thực hiện tại khoa Vi sinh – Bệnh viện TW Huế.
Chuẩn bị chất thử: Hịa mẫu thử và mẫu chuẩn vào dung mơi DMSO đƣợc dung dịch gốc. Pha lỗng dung dịch gốc bằng dung mơi DMSO thành các dung dịch cĩ nồng độ thích hợp.
Đối với cắn tồn phần và các phân đoạn, dung dịch gốc cĩ nồng độ 100 mg/mL, pha lỗng dung dịch gốc thành các dung dịch cĩ nồng độ 50 mg/mL, 10 mg/mL.
Đối với chất tinh khiết, dung dịch gốc cĩ nồng độ 4 mg/mL, pha lỗng thành các dung dịch cĩ nồng độ 2 mg/mL, 1 mg/mL.
22 Chứng âm: DMSO.
Chủng vi sinh vật thử nghiệm
- Vi khuẩn Gram dƣơng
+ Staphylococcus aureus ATCC 1128
+ Bacillus subtilis ACTT 6633
- Vi khuẩn Gram âm
+ Escherichia coli ACTT 25922
+ Pseudomonas aeruginosa VN 201
Chuẩn bị chủng vi sinh vật: Cấy truyền chủng từ ống gốc lên một ống thạch nghiêng, ủ vào tủ ấm 18 giờ ở 37 oC, dùng que cấy đã tiệt trùng lấy vi khuẩn đã phát triển trên bề mặt mơi trƣờng vào nƣớc muối sinh lý sao cho đạt đƣợc nồng độ vi khuẩn 108
tế bào/mL.
Chuẩn bị mơi trường và cấy vi sinh vật kiểm định
- Mơi trƣờng Muller Hinton:
+ Cân thạch một cách chính xác theo hƣớng dẫn của hãng sản xuất và hịa tan vào nƣớc cất 2 lần.
+ Đun sơi để hịa tan hồn tồn thạch. + Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7,2−7,4.
+ Hấp tiệt trùng ở 121 oC/15 phút, để nguội mơi trƣờng tới 50 o
C.
+ Đổ mơi trƣờng vào đĩa petri dày khoảng 5 mm (tƣơng ứng với khoảng 25 mL thạch). Để thạch nguội.
+ Cho 250 µL hỗn dịch vi khuẩn vào mỗi đĩa thạch. Dùng tăm bơng vơ khuẩn phết đều vi khuẩn lên bề mặt đĩa thạch. Để khơ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút.
2.2.3.3. Tiến hành
- Dùng dụng cụ đục lỗ đã tiệt khuẩn đục 6 lỗ trên đĩa thạch dinh dƣỡng đã cấy vi khuẩn kiểm định. Các lỗ đục đƣợc phân bố nhƣ hình 2.
23
- Để đĩa thạch ở nhiệt độ phịng (25 oC) trong 2 giờ để chất thử khuếch tán vào mơi trƣờng thạch. Sau đĩ, cho đĩa thạch vào tủ ấm ở nhiệt độ 35 o
C. Sau 18 giờ lấy ra đọc kết quả.
- Đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn bằng thƣớc Palmer cĩ độ chính xác đến 0,1 mm.
Hình 2.2. Phân bố các mẫu thử trên đĩa thạch dinh dƣỡng
2.2.3.4. Đánh giá kết quả
Đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn. Đánh giá đƣờng kính vịng vơ khuẩn đƣợc xử lí theo cơng thức
̅ ∑ √∑ ̅
Trong đĩ: ̅ : Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn : Đƣờng kính vịng vơ khuẩn
SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn cĩ hiệu chỉnh n : Số thí nghiệm làm song song (n=3)
2.2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc tính tốn, xử lý bằng phần mềm Excel 2007 của Microsoft.
1 2 3 4 5 6
24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 3.1.1. Đặc điểm hình thái 3.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây gỗ nhỏ cao 5−6 m. Cành cĩ nhựa mủ trắng, khơng cĩ lơng.
Lá đơn, mọc đối hoặc mọc chụm ở đầu cành. Mặt trên màu xanh đậm, mặt dƣới màu xanh nhạt hơn. Phiến lá khơng cĩ lơng. Lá thuơn dài, đầu lá nhọn, mép lá nguyên, kích thƣớc 12 × 4 cm. Khơng cĩ lá kèm. Gân lá cĩ nhựa mủ trắng. Hoa nhỏ, mọc thành chùm, mọc ra từ nách lá. Quả hạch, hình trứng. Quả chín cĩ màu đỏ.
Để giám định tên khoa học, mẫu cây đƣợc thu hái với đầy đủ các bộ phận cành, lá, hoa, quả. Dựa vào các đặc điểm quan sát, phân tích về đặc điểm hình thái kết hợp với đối chiếu tài liệu tham khảo và đƣợc sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thế Cƣờng – Phịng Thực vật – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, mẫu nghiên cứu đƣợc xác định:
Tên khoa học : Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae. Tên tiếng Việt: Nhục tử gần, Sến nạc nhỏ.
25
3.1.2. Đặc điểm vi học 3.1.2.1. Cành Nhục tử gần 3.1.2.1. Cành Nhục tử gần
* Đặc điểm vi phẫu
Mặt cắt thân hình trịn. Từ ngồi vào trong cĩ: Biểu bì (1) gồm 1 lớp tế bào xếp sát nhau, màng ngồi cĩ lớp cutin bao bọc. Tiếp đến là mơ dày (2) gồm 3−4 lớp tế bào trịn. Mơ mềm vỏ (3) gồm những tế bào thành mỏng, kích thƣớc khơng đều nhau. Trong mơ mềm vỏ cĩ các tế bào hĩa mơ cứng (4) và tinh thể canxi oxalat hình lăng trụ nằm rải rác. Lớp tiếp theo là các tế bào mơ
26
cứng (5) và bĩ sợi (6) nằm xen kẽ tạo thành 1 vịng khép kín bao quanh libe- gỗ. Libe (7) gồm những tế bào nhỏ, hình dạng khơng xác định, bắt màu đỏ nằm xung quanh gỗ. Mạch gỗ (8) bắt màu xanh kéo dài đến gần trung tâm. Trong cùng là mơ mềm ruột (9) gồm các tế bào thành mỏng to nhỏ khơng đều nhau. Các túi tiết nhựa mủ cĩ màu vàng nằm rải rác trong mơ mềm vỏ và mơ mềm ruột kích thƣớc 0,09−0,12 mm (hình 3.3, 3.4).
* Đặc điểm bột: Bột cĩ màu vàng nâu, vị đắng. Soi dƣới kính hiển vi
cĩ các mảnh biểu bì (1) nằm rải rác. Nhiều mạch vạch (7), mạch xoắn (8, 9). Tinh thể canxi oxalat (4,5) hình lăng trụ kích thƣớc 0,03−0,04 mm. Các tế bào mơ cứng (2). Hạt tinh bột (6) cĩ kích thƣớc 0,02−0,03 mm. Cĩ các mảnh mơ mềm mang tinh bột (3) (hình 3.5).
Hình 3.3. Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 10) 1. Biểu bì 2. Mơ dày 3. Mơ mềm vỏ 4. Tế bào hĩa mơ cứng 5. Mơ cứng 6. Sợi
7. Libe 8. Gỗ 9. Mơ mềm ruột
3 2 1 4 5 6 7 8 9
27 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 3.4. Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 40)
1. Cutin 2. Biểu bì 3. Mơ dày
4. Tinh thể canxi oxalat 5. Tế bào hĩa mơ cứng 6. Mơ mềm vỏ
7. Mơ cứng 8. Sợi 9. Libe
28
3.1.2.2. Lá Nhục tử gần * Đặc điểm vi phẫu
- Vi phẫu gân lá: Gân lá 2 mặt lồi, mặt trên lồi ít, mặt dƣới lồi nhiều. Biểu bì trên (1) và biểu bì dƣới (8) là những tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, cutin dày. Mơ dày (2) gồm 3−4 hàng tế bào nhỏ hình trứng, thành dày, xếp thành lớp đều đặn ở trên biểu bì dƣới và xếp thành một gĩc dày sát dƣới biểu bì trên. Mơ mềm vỏ là những tế bào hình trứng, kích thƣớc khơng đều, thành mỏng, xếp lộn xộn. Mơ cứng (4) và sợi (3) gồm những tế bào bắt màu xanh, xếp thành một vịng đều đặn bao quanh libe-gỗ. Bĩ libe-gỗ cĩ cấu trúc gồm 2 phần. Phần gần với biểu bì trên cĩ cấu tạo kiểu bĩ dẫn đồng tâm: libe (7) bên ngồi bao bọc gỗ (5) bên trong. Phần gần với biểu bì dƣới cĩ cấu tạo kiểu bĩ dẫn chồng chất hở: các bĩ gỗ ở phía trên chồng chất lên libe ở phía dƣới. Mơ
Hình 3.5. Các đặc điểm bột cành Nhục tử gần
1. Biểu bì 2. Mơ cứng
3. Mảnh mơ mềm mang tinh bột 4,5. Tinh thể canxi oxalate
6. Hạt tinh bột 7. Mảnh mạch vạch
29
mềm ruột gồm những tế bào thành mỏng, khơng đều, xếp giữa 2 phần của bĩ libe-gỗ. Trong gân lá cĩ các ống tiết (6) nằm rải rác, là các lỗ thủng lớn nằm