2.2.3.1. Nguyên tắc
Mẫu thử đƣợc cho vào lỗ đục trên đĩa thạch dinh dƣỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, trong điều kiện nuơi cấy thích hợp. Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào mơi trƣờng thạch và ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định, tạo thành vịng vơ khuẩn xung quanh mẫu thử. Đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn để đánh giá kết quả.
2.2.3.2. Chuẩn bị
Quá trình thực nghiệm đƣợc thực hiện tại khoa Vi sinh – Bệnh viện TW Huế.
Chuẩn bị chất thử: Hịa mẫu thử và mẫu chuẩn vào dung mơi DMSO đƣợc dung dịch gốc. Pha lỗng dung dịch gốc bằng dung mơi DMSO thành các dung dịch cĩ nồng độ thích hợp.
Đối với cắn tồn phần và các phân đoạn, dung dịch gốc cĩ nồng độ 100 mg/mL, pha lỗng dung dịch gốc thành các dung dịch cĩ nồng độ 50 mg/mL, 10 mg/mL.
Đối với chất tinh khiết, dung dịch gốc cĩ nồng độ 4 mg/mL, pha lỗng thành các dung dịch cĩ nồng độ 2 mg/mL, 1 mg/mL.
22 Chứng âm: DMSO.
Chủng vi sinh vật thử nghiệm
- Vi khuẩn Gram dƣơng
+ Staphylococcus aureus ATCC 1128
+ Bacillus subtilis ACTT 6633
- Vi khuẩn Gram âm
+ Escherichia coli ACTT 25922
+ Pseudomonas aeruginosa VN 201
Chuẩn bị chủng vi sinh vật: Cấy truyền chủng từ ống gốc lên một ống thạch nghiêng, ủ vào tủ ấm 18 giờ ở 37 oC, dùng que cấy đã tiệt trùng lấy vi khuẩn đã phát triển trên bề mặt mơi trƣờng vào nƣớc muối sinh lý sao cho đạt đƣợc nồng độ vi khuẩn 108
tế bào/mL.
Chuẩn bị mơi trường và cấy vi sinh vật kiểm định
- Mơi trƣờng Muller Hinton:
+ Cân thạch một cách chính xác theo hƣớng dẫn của hãng sản xuất và hịa tan vào nƣớc cất 2 lần.
+ Đun sơi để hịa tan hồn tồn thạch. + Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7,2−7,4.
+ Hấp tiệt trùng ở 121 oC/15 phút, để nguội mơi trƣờng tới 50 o
C.
+ Đổ mơi trƣờng vào đĩa petri dày khoảng 5 mm (tƣơng ứng với khoảng 25 mL thạch). Để thạch nguội.
+ Cho 250 µL hỗn dịch vi khuẩn vào mỗi đĩa thạch. Dùng tăm bơng vơ khuẩn phết đều vi khuẩn lên bề mặt đĩa thạch. Để khơ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút.
2.2.3.3. Tiến hành
- Dùng dụng cụ đục lỗ đã tiệt khuẩn đục 6 lỗ trên đĩa thạch dinh dƣỡng đã cấy vi khuẩn kiểm định. Các lỗ đục đƣợc phân bố nhƣ hình 2.
23
- Để đĩa thạch ở nhiệt độ phịng (25 oC) trong 2 giờ để chất thử khuếch tán vào mơi trƣờng thạch. Sau đĩ, cho đĩa thạch vào tủ ấm ở nhiệt độ 35 o
C. Sau 18 giờ lấy ra đọc kết quả.
- Đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn bằng thƣớc Palmer cĩ độ chính xác đến 0,1 mm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.2. Phân bố các mẫu thử trên đĩa thạch dinh dƣỡng
2.2.3.4. Đánh giá kết quả
Đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn. Đánh giá đƣờng kính vịng vơ khuẩn đƣợc xử lí theo cơng thức
̅ ∑ √∑ ̅
Trong đĩ: ̅ : Đƣờng kính trung bình vịng vơ khuẩn : Đƣờng kính vịng vơ khuẩn
SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn cĩ hiệu chỉnh n : Số thí nghiệm làm song song (n=3)
2.2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc tính tốn, xử lý bằng phần mềm Excel 2007 của Microsoft.
1 2 3 4 5 6
24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU