Nghiên cứu chế tạo chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn

Chitosan khối lượng phân tử thấp thu được có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có thể sử dụng để bảo quản thực phẩm và các mục đích kháng khuẩn khác.. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƯ

Tóm tắt:

Trong nghiên cứu này, chitosan được cắt mạch ở trạng thái trương trong dung dịch hydro peoxit và chiếu xạ bằng tia gamma Co-60 Khối lượng phân tử của chitosan cắt mạch được xác định bằng phương pháp sắc kí gel thấm qua (GPC) Phổ hồng ngoại (FT-IR) và tử ngoại – khả kiến (UV-vis) cũng đã được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc của chitosan cắt mạch Kết quả cho thấy chitosan khối lượng phân tử thấp Mw ~ 30 - 45 kDa được chế tạo rất hiệu quả bằng phương pháp chiếu xạ chitosan trương trong dung dich hydro peoxit ở liều xạ thấp hơn 20 kGy Cấu trúc chính cũng như độ đề axetyl của chitosan cắt mạch hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu Hiệu suất cắt mạch bức xạ (Gs) được gia tăng đáng kể khi có mặt H2O2 Chitosan khối lượng phân tử thấp thu được có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có thể sử dụng để bảo quản thực phẩm và các mục đích kháng khuẩn khác

Abstract:

In this study, degradation of chitosan in swollen state with hydrogen peroxide solution by γ-irradiation was investigated Molecular weight (Mw) of irradiated chitosan was determined by gel permeation chromatography (GPC) Fourier transform infrared (FT-IR) and ultraviolet-visible (UV-vis) spectra were analyzed to study the structure changes of degraded chitosan The results showed that the chitosan of low Mw ~ 30 - 45 kDa was efficiently prepared by γ-irradiation

of chitosan swollen in hydrogen peroxide solution at low dose less than 20 kGy The main structure as well as the degree of deacetylation of the degraded chitosan was almost no significant change Furthermore, the radiation degradation yield (Gs) was remarkably enhanced by the presence of H2O2 The obtained low Mw chitosan

revealed high antimicrobial activity for E coli that can be used for food

preservation and other purposes as well

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CTSM91 Chitosan có khối lượng phân tử 91 kDa

CTSM60 Chitosan có khối lượng phân tử 60 kDa

CTSM45 Chitosan có khối lượng phân tử 45 kDa

CTSM30 Chitosan có khối lượng phân tử 30 kDa

ĐĐA Độ đề axetyl

E coli Vi khuẩn Escherichia coli

FT-IR Phương pháp Phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier (Fourier

transform infrared) GPC Phương pháp sắc kí gel thấm qua (Gel Permeation

Mn Kí hiệu khối lượng phân tử trung bình số lượng

Mw Kí hiệu khối lượng phân tử trung bình khối lượng

UV-vis Phương pháp phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - visible

spectroscopy) XRD Phương pháp nhiễu xạ tia X (X–ray diffraction)

γCo60 Bức xạ gamma Co – 60

w/v Khối lượng/thể tích

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.2 Nồng độ tối thiểu của CTS để ức chế các loài vi khuẩn khác

nhau

11

nhau

25

liều xạ 10 kGy với suất liều khác nhau

32

10,5 kGy

33

nhau đối với E coli

35

Bảng 3.8 Hiệu suất kháng khuẩn E Coli của CTSM60 có nồng độ khác

nhau

36

Bảng 3.9 Hiệu suất kháng khuẩn E Coli của CTS KLPT thấp theo thời

gian khuấy tiếp xúc

37

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

dung dịch H2O2 theo liều xạ

25

mạch ở dạng trương nước theo liều xạ

28

ở dạng trương với H2O2 nồng độ 1% (b), 3% (c), 5% (d) tại liều xạ 10 kGy

29

CTS ở dạng trương với H2O2 nồng độ 1% (b), 3% (c), 5%

(d) tại liều xạ 10 kGy

30

trong dung dịch axit axetic 0,05%

31

H2O2 5% (b) và CTS sau chiếu xạ (c)

32

H2O2 nồng độ 0% (5ml H2O/1g CTS, a); 5% (b); 7,5% (c); 10%

(d) tại liều xạ 10,5 kGy

Hình 3.10 Sự phát triển của E.coli sau 24h cấy vào môi trường

CTSM60 (b) so với môi trường đối chứng (a)

35

Hình 3.11 Sự phát triển của E.Coli sau 24h cấy vào môi trường đối

chứng (a) và môi trường chứa CTSM60 ở nồng độ 25 ppm

(b) và 50 ppm (c)

36

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH VẼ ii

DANH MỤC BẢNG iii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHITIN, CHITOSAN 3

1.1.1 Cấu trúc phân tử 3

1.1.2 Các phản ứng hóa học của chitin, chitosan 5

1.1.3 Một số dẫn xuất của chitin 8

1.1.4 Các ứng dụng của chitosan 8

1.2 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 10

1.2.1 Chitosan khối lượng phân tử thấp 10

1.2.2 Hoạt tính của chitosan khối lượng phân tử thấp 10

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 15

2.2 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 15

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC VÀ THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHITOSAN 16

2.3.1 Đo phổ IR 16

2.3.2 Đo phổ UV-vis 17

2.3.3 Đo XRD 17

2.3.4 Xác định độ đề axetyl 17

2.3.5 Xác định khối lượng phân tử 17

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ BIẾN TÍNH CHITOSAN 20

2.4.1 Phương pháp đề axetyl chitin chế tạo chitosan 20

2.4.2 Phương pháp biến tích cắt mạch chitosan 20

2.5 PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HIỆU ỨNG KHÁNG KHUẨN 20

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 CHẾ TẠO CTS CÓ ĐĐA TỪ 70% ĐẾN 90% 22

3.2 CHẾ TẠO CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 24

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ/ liều xạ đến sự suy giảm khối lượng phân tử 25

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ/ liều xạ đến độ đề axetyl 29

3.3 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 34

3.3.1 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan 34

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan 36

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian khuấy tiếp xúc

KẾT LUẬN

Tài liệu tham khảo

1

MỞ ĐẦU Chitosan là polyme có nguồn gốc tự nhiên được sản xuất từ chitin bằng cách loại các nhóm axetyl Chitosan tự phân hủy sinh học, độc tính thấp, hoạt tính sinh học cao và đa dạng Chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, tăng sinh tế bào, tăng cường miễn dịch của cơ thể với các tác dụng kích thích sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol trong máu, hạn chế sự phát triển của khối u, có tác dụng tốt trên các vết thương, vết bỏng [41] Do có nhiều hoạt tính sinh học độc đáo, chitiosan được ứng dụng khá đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống Chitosan dùng để sản xuất glucosamin; vải; sơn trong công nghiệp, làm chỉ khâu phẫu thuật trong y tế, làm chất bảo vệ hoa quả trong nông nghiệp, chất hấp phụ kim loại nặng trong bảo vệ môi trường [2]

Chitosan thông thường có khối lượng phân tử rất cao, chỉ tan trong môi trường axit Điều này đã làm hạn chế khả năng ứng dụng của loại polyme này trong nhiều trường hợp Các phương pháp cắt mạch chitosan để giảm khối lượng phân tử, nhằm mở rộng khả năng ứng dụng của loại polyme này, vì thế cũng được tập trung nghiên cứu trong vài năm gần đây Trong đó, những phương pháp phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học sử dụng các tác nhân oxy hóa, phương pháp enzym và phương pháp chiếu xạ Phương pháp enzyme cắt mạch chitosan cho hiệu suất cao tuy nhiên giá thành đắt hơn rất nhiều so với phương pháp hóa học Phương pháp chiếu xạ gamma Co – 60 và phương pháp hóa học sử dụng H2O2 được cho là kỹ thuật cắt mạch khá hiệu quả và thân thiện với môi trường ở thời điểm hiện tại

Vấn đề chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn đã được nghiên cứu từ lâu Kết quả cho thấy khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc khá phức tạp vào khối lượng phân tử, độ đề axetyl, sự phân bố khối lượng phân tử và nguồn gốc của chitin Những nghiên cứu gần cho thấy chitosan có khối lượng phân tử trung bình có khả

2

năng kháng khuẩn tốt Tuy vậy, hiệu quả kháng khuẩn còn phụ thuộc vào độ đề axetyl và vấn đề này vẫn chưa được làm rõ

Từ những thông tin trên chúng tôi chọn và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế

tạo chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn”

Trong khuôn khổ của công trình khoa học cấp cơ sở, đề tài này không đi sâu nghiên cứu cấu trúc chi tiết của sản phẩm vì vấn đề này đã được thực hiện một phần trong các đề tài có liên quan trước đó Đề tài này chỉ xem xét chế tạo chitosan

có hoạt tính kháng khuẩn và làm rõ mối quan hệ giữa khối lượng phân tử và độ đề axetyl đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan với các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

a) Nội dung 1: Chế tạo chitosan có độ đề axetyl khoảng 70 – 90 % ở nhiệt độ

phòng

- Khảo sát thời gian phản ứng

- Độ đề axetyl theo thời gian phản ứng

b) Nội dung 2: Chế tạo chitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng cắt mạch sử dụng

H2O2/ tia γ

- Ảnh hưởng của nồng độ/liều xạ đến sự suy giảm khối lượng phân tử

- Ảnh hưởng của nồng độ/liều xạ đến độ đề axetyl

c) Nội dung 3: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan chế tạo được lên vi

khuẩn Ecoli

- Ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan

- Ảnh hưởng của nồng độ chitosan

3

O OH

OH

O

O OH

NHCOCH3

O OH

NHCOCH3

O OH

NHCOCH3

O OH

O OH

NHCOCH3

O OH

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHITIN, CHITOSAN

1.1.1 Cấu trúc phân tử

- Công thức cấu tạo của chitin [32]:

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử chitin

- Công thức cấu tạo của chitosan (CTS) [29], [33]:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của CTS

- Công thức nguyên: (C6H11NO4)n

- Khối lượng phân tử (KLPT) trung bình: Mn = (161,157)n

- Thành phần nguyên tố: %C = 44,72%, %H = 6,88%, %O = 39,71% và

%N = 8,69%

Như vậy, CTS là dẫn xuất của chitin thu được từ phản ứng đề axetyl hoá, tách

gốc axetyl khỏi nhóm amino ở vị trí C2 Đơn vị cấu tạo trong phân tử CTS là

D - glucosamin, các mắt xích được liên kết với nhau bằng những liên kết sau [32]:

4

- Liên kết 1,4-glycosit, mỗi mắt xích nằm lệch nhau một góc 180○ tạo nên mạch xoắn

- Tương tác Van der Waals (d = 0,3  0,6 µm)

- Khi khoảng cách giữa các mắt xích quá nhỏ (< 0,3 µm) giữa chúng xuất hiện liên kết hydro do tương tác giữa nhóm -OH, -NH2 trong phân tử

Cấu trúc chitin, CTS ở trên chỉ là lý thuyết, thực tế mạch phân tử CTS vẫn còn tồn tại nhóm axetyl đan xen do sự đề axetyl hóa chưa hoàn toàn Do đó công thức hóa học chính xác của mạch CTS có thể biểu diễn như sau [4], [37]:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo chính xác của CTS Bảng 1.1 Một số thông số đặc trưng của chitin, CTS [1]

Khối lượng phân tử trung bình 3 - 5×105 1 - 3×105

Mức độ đề axetyl hoá (ĐĐA) 10 - 15% 80 - 90%

5

1.1.2 Các phản ứng hóa học của chitin, chitosan

Hầu hết công việc nghiên cứu tính chất chitin đều quan tâm đến nhóm amino, nhóm này có vai trò quan trọng trong đại phân tử Trong chitin, nhóm amino bị axetyl hóa Vì vậy, chitin là một amit của axit axetic CTS có cấu tạo tương tự chitin và chỉ khác nhóm amino tự do

Phản ứng Van - Wisseleigh

Chitin, CTS phản ứng với dung dịch I2/KI cho màu nâu, màu này chuyển thành đỏ tím khi có mặt axít H2SO4 Đây là phản ứng đặc trưng của chitin, CTS do các liên kết β (1,4) - glycosit gây ra [8] Phản ứng này không xảy ra đối với các polysaccharide có số phân tử đường nhỏ hơn 6 nên được dùng để định tính chitin, CTS và dùng để kiểm tra glucosamin

Phản ứng đề axetyl hóa chuyển chitin thành CTS

Phản ứng đề axetyl hóa chitin là phản ứng tách nhóm axetyl ra khỏi nhóm chức -NHCOCH3, thực hiện trong dung dịch NaOH 40  60% ở nhiệt độ 90 

100○C và trong khoảng thời gian từ 3  5 giờ [37]

Thực chất phản ứng trên là phản ứng thuỷ phân trong môi trường kiềm Các yếu

tố ảnh hưởng đến phản ứng là: nồng độ, nhiệt độ và thời gian

Phản ứng cắt mạch

Phản ứng cắt mạch là quá trình làm đứt liên kết β (1,4) - glycosit [4] gồm các phương pháp cắt mạch chủ yếu sau:

- Cắt mạch bằng enzym như chitosanase, papain

- Cắt mạch bằng tác nhân hóa học: H2O2, các peaxit, HCl và NaNO2/ H+

- Cắt mạch bằng chiếu xạ gamma Co – 60 (γCo60)

6

Giai đoạn đầu của quá trình ngắt mạch là CTS trương nở và hoà tan trong môi

trường axít loãng (pH ~ 6) tạo ra một dung dịch polyme không màu, trong suốt và

nhớt

Chit-NH + CH COOH Chit-NH + CH COO

Tiếp theo là quá trình cắt đứt liên kết 1,4-glycosit

Do đó, dung dịch CTS càng để lâu, độ nhớt và KLPT càng giảm dần CTS có

KLPT khác nhau sẽ cho các hoạt tính sinh học khác nhau

Các phản ứng tạo dẫn xuất

Tùy thuộc tác nhân phản ứng vào nhóm chức -NH2, -OH hay cả 2 nhóm chức,

các dẫn xuất tạo thành là khác nhau [34]:

 Các phản ứng vào nhóm -NH2

Nhóm amin có khả năng nhận proton từ các axít loãng:

Chit-NH + CH COOH Chit-NH + CH COO

Nhóm amin tự do của CTS tham gia phản ứng với axit Đây là phản ứng thế

vào nguyên tử oxy của nhóm cacbonyl, ví dụ với axit glycolic:

Các nhóm chức -OH trong mỗi mắt xích cũng thể hiện khả năng phản ứng

khác nhau Ở vị trí C3 là nhóm -OH bậc 2, còn ở vị trí C5 là nhóm -OH bậc 1 Nói

chung, phản ứng thế dễ dàng xảy ra hơn ở nhóm -OH bậc 1

Đối với chitin, phản ứng thường xảy ra với các nhóm -OH vì nhóm -NHCOCH3 tương đối kém hoạt động:

Nhóm -OH tham gia phản ứng thế với axit monoclo axetic:

Chit-NH2 + Cl-CH2-COOH Chit-NH-CH2COOH + HCl

Tiến hành phản ứng đề axetyl cho O - Carboxylmetyl CTS

 Phản ứng vào cả hai nhóm -OH và -NH2

Phản ứng thế với axit monoclo axetic:

8

Phản ứng thế với ankyl halogen và tạo ra dẫn xuất bậc 4:

Ngoài ra, CTS còn là một polyamin, nó được xem như một polyme cationit có khả năng bám dính vào các bề mặt tích điện âm và có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại [53]

1.1.3 Một số dẫn xuất của chitin

Chitin có cấu trúc bền vững, không tan trong các dung môi thông thường, ít có ứng dụng trong thực tế Chính vì thế, chitin được xem như nguyên liệu đầu để điều chế các dẫn xuất của nó [1] Có nhiều cách để phân loại các dẫn xuất của chitin Thông thường có thể chia dẫn xuất của chitin thành 2 loại [33]: dẫn xuất tan trong nước và dẫn xuất tan trong dung môi

Khi đề cập đến các dẫn xuất tan, chitin tan thường được kể đến đầu tiên Điều đặc biệt ở sản phẩm này là chitin với ĐĐA khoảng 45  50% lại tan tốt trong nước Chitin tan trong nước thường được chế tạo bằng cách axetyl hóa CTS từ ĐĐA cao

 90% xuống còn  50% Ngoài ra, một số dẫn xuất tan trong nước có nhiều ứng dụng có thể kể đến bao gồm: O-Carboxymetyl CTS, O-Carboxymetyl Chitin, Quartanize và N-Carboxymetyl CTS [30]

Dẫn xuất tan trong dung môi quan trọng của chitin là CTS CTS có hoạt tính sinh học cao hơn hẳn chitin do có hai nhóm chức hoạt động mạnh là -OH và -NH2 Nhóm -NH2 thường bị proton hóa vì vậy CTS tan được trong môi trường axit Điều này khác hẳn với chitin

1.1.4 Các ứng dụng của CTS

Trong ngành dược, CTS dùng làm chất phụ gia tốt cho kỹ thuật bào chế dược phẩm (keo kết dính viên, chất tạo màng ) CTS dùng làm chất mang sinh học để gắn các thuốc bằng liên kết cơ học hoặc hoá học nhằm tạo ra thuốc polyme có

9

nhiều tác dụng mới CTS được xem như là một hệ thống vận tải thuốc khá lý tưởng [25] Ngoài ra, CTS và các dẫn xuất của nó còn được dùng làm thuốc chữa bệnh: thuốc hạ lipit trong máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, thuốc chống đông tụ máu, thuốc kháng nấm, kháng khuẩn, tác dụng tăng cường miễn dịch cơ thể… CTS có tác dụng tốt trong điều trị vết thương bỏng: làm mau lành vết thương, giảm đau, kích thích hệ thống dịch da và không làm biến dạng bề mặt da [49]

Trong mỹ phẩm, CTS được dùng làm chất phụ gia để tăng độ bám dính, làm kem bôi mặt, thuốc làm mềm da, làm tăng khả năng hoà hợp sinh học giữa kem thuốc và da, chống tia cực tím [33]

Trong công nghiệp giấy, CTS là một thành phần phụ gia rất tốt trong quy trình sản xuất giấy cao cấp

Trong công nghiệp gia dụng, CTS dùng làm mực in cao cấp, làm chất gia tăng

độ bền của gỗ, làm màng bọc lót các linh kiện điện tử [29]

Trong công nghệ hoá học, CTS dùng để xử lý nước thải công nghiệp do có khả

năng tạo phức với những ion kim loại nặng độc hại [32], làm chất mang trong sắc

ký chọn lọc [29]

Trong công nghiệp thực phẩm, CTS chống lại các vi khuẩn gây bệnh trong

môi trường để bảo vệ thực vật, hoa quả và sữa Ngoài ra, CTS còn là thành phần trong các sản phẩm chế biến từ sữa và hoa quả Hơn nữa, CTS còn được dùng như

là chất lọc trong các loại nước ép hoa quả, bia, rượu và nước ngọt [17]

Trong nông nghiệp, CTS được dùng như một thành phần chính trong thuốc phòng trừ nấm bệnh (đạo ôn, khô vằn ) và dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng thực vật, tăng khả năng miễn dịch cho động vật [18]

10

1.2 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

1.2.1 Chitosan khối lượng phân tử thấp

Về cơ bản chitosan khối lượng phân tử thấp có cấu tạo như CTS nhưng KLPT nhỏ hơn 100 kDa CTS KLPT thấp được chế tạo bằng cách cắt mạch CTS ban đầu theo những phương pháp khác nhau [28]

1.2.2 Hoạt tính của chitosan khối lượng phân tử thấp

Hoạt tính sinh học của CTS KLPT thấp khá đa dạng, bao gồm: tính kháng nấm [19], kháng khuẩn [26], [27], chống khối u [23], hiệu ứng tăng cường miễn dịch [42], và các hiệu ứng bảo vệ chống lại nhiễm trùng [22] Các tính chất của CTS như ĐĐA, sự phân bố điện tích và tính chất hoá học… chi phối mạnh mẽ các hoạt tính sinh học của nó [16] Không giống như CTS KLPT cao, CTS KLPT thấp

dễ hấp thu qua ruột, nhanh chóng đi vào máu và gây các hiệu ứng sinh học có hệ thống Trong công nghiệp thực phẩm, CTS KLPT thấp thu hút sự quan tâm trong nghiên cứu ứng dụng nhờ khả năng kháng khuẩn và chống oxi hoá Từ các tính chất này, CTS KLPT thấp được xem như là chất nâng cao chất lượng dinh dưỡng của thực phẩm [24] KLPT thấp của CTS được coi là một đặc tính quan trọng liên quan nhiều đến hoạt tính sinh học của nó

Hoạt tính kháng khuẩn của CTS và các dẫn xuất đối với một số loài vi khuẩn

đã được công nhận và được xem là một trong những tính chất quan trọng nhất liên quan trực tiếp đến các ứng dụng sinh học có thể có của chúng [31] Hoạt tính kháng vi khuẩn của các hợp chất này chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như KLPT trung bình (Mw) [21], ĐĐA [11], [9], loại vi sinh vật [17], [33], [44] và một số tính chất hoá lý khác (bảng 1.2)

11

Bảng 1.2 Nồng độ tối thiểu của CTS để ức chế các loài vi khuẩn khác nhau

Bacterial strain ĐĐA (%) Mw (kDa) MIC (%)a Ref

Vi khuẩn Gram âm

 Các cơ chế kháng khuẩn của CTS KLPT thấp

Không giống nhƣ chitin, CTS KLPT thấp sở hữu các nhóm amino tự do trong cấu trúc của nó Số nhóm amino này thể hiện vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng khuẩn và một số cơ chế đã đƣợc đề nghị để mô tả hoạt tính này [9] Cơ

12

chế được cho là phù hợp nhất giải thích là CTS KLPT thấp có thể làm thay đổi các đặc tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và ngăn cản sự tiếp nhận khoáng chất hoặc gây rò rỉ các thành phần tế bào mà cuối cùng dẫn đến cái chết của vi khuẩn [43] Một cơ chế khác được đề nghị để giải thích về hoạt tính kháng khuẩn của CTS KLPT thấp là sự ngăn chặn việc sao chép RNA do sự hấp phụ của CTS KLPT thấp thâm nhập vào DNA của vi khuẩn [29] Để thỏa mãn cơ chế này, KLPT của CTS phải nhỏ hơn một giá trị giới hạn, cho phép các phân tử xâm nhập vào trong tế bào

vi khuẩn Tuy nhiên, các chứng cứ thu thập được chưa đủ cập nhật củng cố giả thuyết này Ngoài ra, hoạt tính tạo chelat của CTS KLPT thấp cũng đã tước đoạt các kim loại, yếu tố vi lượng hoặc các chất dinh dưỡng cần thiết cũng được đề xuất như một yếu tố giới hạn sự tăng trưởng của vi khuẩn [55]

 Hiệu ứng tích điện dương và KLPT của CTS lên hoạt tính kháng khuẩn

Bản chất tích điện dương của CTS KLPT thấp đã tạo điều kiện cho chúng liên kết với tế bào vi khuẩn dẫn tới ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Nhóm tích điện dương ở vị trí C-2 của monome glucosamine tương tác với nhóm axit cacboxylic tích điện âm của các đại phân tử trên bề mặt tế bào vi khuẩn tạo ra các phức polyelectrolyte [10], [29] Các phức polyelectrolyte có thể hoạt động như lớp không thấm xung quanh tế bào và cản trở các hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn bằng cách ngăn chặn các chất dinh dưỡng thấm qua thành tế bào Khi tạo phức polyelectrolyte, CTS có số nhóm amino cao hơn sẽ tương tác mạnh hơn với các tế bào vi khuẩn [46] Số lượng nhóm amin phụ thuộc vào ĐĐA của CTS và người ta

đã quan sát thấy tỷ lệ tử vong của tế bào vi khuẩn có chiều hướng tăng khi ĐĐA của CTS tăng [46] Nhiều nghiên cứu cho thấy, CTS có ĐĐA khoảng 85 – 95% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất [11] Xu hướng tăng hoạt tính kháng khuẩn của CTS cùng với sự gia tăng KLPT cũng đã được công bố [35] Trong nghiên cứu gần đây, Ueno, Yamaguchi, Shakairi, Nishi, và Tukora [48] đã xác nhận CTS có KLPT nhỏ hơn 2,2 kDa không có khả năng ngăn chặn sự phát triển vi khuẩn Khi tăng

13

KLPT lên khoảng 5,5 kDa, CTS đã thể hiện hoạt tính ngăn chặn sự phát triển của

vi khuẩn và hiệu quả kháng khuẩn tùy thuộc vào liều áp dụng Một công bố khác cũng cho thấy CTS có KLPT từ 5 - 27 kDa cho khả năng ngăn chặn sự phát triển vi khuẩn khá hiệu quả[17]

Do điện tích dương tạo thuận lợi cho hoạt động kháng khuẩn của CTS, nên

sự thay đổi các nhóm amin ở vị trí C-2 của glucosamine bằng các nhóm tích điện dương mạnh hơn nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của CTS đã được nghiên cứu Jeon và cộng sự [26] đã cố gắng cải thiện điện tích dương của CTS bằng cách đưa asparagine vào ở vị trí C-2 của glucosamine thông qua liên kết –N Asparagine được dự kiến sẽ tăng cường điện tích dương do sự hiện diện của hai nhóm chức amin vào xương sống và chuỗi bên Các dẫn xuất CTS kết hợp với asparagines (Asn-CTS) đã cải thiện hoạt tính diệt khuẩn của CTS Nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) của Asn-CTS trên E.coli là thấp hơn nhiều so với CTS Asn-CTS với 0,01% hoặc cao hơn MIC hoàn toàn ức chế sự tăng trưởng của E.coli sau 3 ngày Kim và

cộng sự [29] tổng hợp được một dẫn xuất CTS với chức năng amoni bậc bốn bằng cách nối CTS với clorua trimethylammonium glycidyl (GTMAC), hoạt tính kháng

khuẩn được đánh giá trên vi khuẩn Streptococcus mutans Kết quả cho thấy CTS

với chức năng amoni bậc bốn (CTS-GTMAC) ức chế đáng kể sự tăng trưởng của

S.mutans so với CTS Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn được gia tăng đáng

kể khi CTS được gia tăng tích điện dương Những quan sát này là phù hợp với sự hiểu biết chung về hoạt động kháng khuẩn của CTS và dẫn xuất của chúng Vì vậy, trên thực tế sự thay đổi cấu trúc của CTS bằng cách đưa vào các nhóm tích điện dương để cải thiện hoạt tính kháng khuẩn, đảm bảo sự tương tác tốt hơn với các nhóm tích điện âm ở thành tế bào vi khuẩn là một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng [36]

14

 Các tính chất tích điện của thành tế bào vi khuẩn

Ngoài đặc điểm tích điện dương của CTS, sự phân bố điện tích của thành tế bào vi khuẩn đóng một vai trò đáng kể đối với các hoạt động kháng khuẩn của CTS và dẫn xuất của chúng Chung và cộng sự [11] nghiên cứu các đặc điểm bề mặt tế bào của một số loài vi khuẩn gram dương và gram âm đã xác nhận có một mối quan hệ chặt chẽ giữa tính ưa nước và sự phân bố điện tích âm của bề mặt thành tế bào vi khuẩn Sự phân bố điện tích âm ở bề mặt tế bào vi khuẩn gram âm

là cao hơn so với vi khuẩn gram dương, tính không ưa nước của vi khuẩn gram âm theo đó cũng cao hơn so với vi khuẩn gram dương Hơn nữa, sự phân phối điện tích âm trên bề mặt tế bào cũng thay đổi giữa các vi khuẩn gram âm và gram dương Vì vậy, sự hấp phụ của CTS trên bề mặt tế bào là bình thường theo thứ tự

vi khuẩn Gram âm tích điện tích âm cao hơn đến vi khuẩn gram dương tích điện

âm ít hơn Điều này giải thích lý do hầu hết vi khuẩn Gram âm nhạy cảm với CTS

và sự phân bố điện tích trên bề mặt tế bào dường như là yếu tố quyết định hoạt tính kháng khuẩn của CTS [20]

15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

- Chitin được sản xuất theo quy trình ở Trung tâm VINAGAMMA Tp HCM

- H2O2 dạng tinh khiết của Merck, Đức

- NaOH dạng tinh khiết của Trung Quốc

- NH3 dạng tinh khiết của Trung Quốc

- HCl dạng tinh khiết của Trung Quốc

- Axit lactic dạng tinh khiết của Trung Quốc

- CH3COOH dạng tinh khiết của Trung Quốc

- CH3COONa dạng tinh khiết của Trung Quốc

- Etanol tuyệt đối của công ty Trường Thịnh, Việt Nam

- Nước cất tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp HCM

- Máy nghiền bi Fritsch, Đức, tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp HCM

- Tủ sấy quạt gió, DNF 410, Yamaro, Nhật, tại Trung tâm VINAGAMMA,

Tp HCM

16

- Tủ sấy Memmert, Đức, tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp HCM

- Một số trang thiết bị khác dùng cho thí nghiệm như: máy li tâm, cân phân tích, tại Phòng thí nghiệm Hóa học, Trường Đại học Sài Gòn

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC VÀ THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHITOSAN

CTS và dẫn xuất của nó được đặc trưng phổ biến bằng phương pháp phổ IR, UV-vis và nhiễu xạ tia X (XRD) [28] Trước khi ghi phổ, CTS được tinh chế theo quy trình sau:

1(g) mẫu CTS được ngâm trương trong nước 2 giờ, thêm axit lactic 3% tỉ lệ 20/1 (ml/g), khuấy tan trong 5 giờ Tủa dung dịch bằng etanol tuyệt đối với tỉ lệ 1/5 (20 ml dung dịch/100 ml etanol tuyệt đối), trợ kết tủa bằng NH4OH 2,5% Lọc và rửa kết tủa 3 lần bằng etanol tuyệt đối cùng tỉ lệ trên [5] Mẫu được sấy khô ở 60°C trong tủ sấy quạt gió DNF 410, Yamaro, Nhật, sau đó được nghiền mịn bằng máy nghiền bi Fritsch, Đức Mẫu sau khi tinh chế ở dạng bột mịn được bảo quản trong túi PE để ghi phổ

17

2.3.2 Đo phổ UV-vis

Phổ UV-vis được đo trên máy UV-vis V630, Jasco, Nhật Bước sóng hấp thụ từ 200 - 600 nm, nồng độ dung dịch đo là CTS 0,1%, dung dịch so sánh là axit axetic 0,05% [6]

2.3.3 Đo XRD

Giản đồ XRD của các mẫu CTS được đo trên máy XRD Siemens D5000, Đức,

sử dụng ống phát tia CuKα (1,54 Å), điện áp 40 kV, cường độ dòng ống phát 40

mA, góc quét 2θ thay đổi từ 0-70 độ, tốc độ quét 0,2 độ/phút

Lập đường chuẩn thời gian lưu và KLPT của mẫu chuẩn Pullulan

Hòa tan 0,03 gam các mẫu chuẩn Pullulan có KLPT là 380000, 100000,

48000, 23700, 12200 và 738 Da vào trong 1ml dung môi CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M Xác định thời gian lưu của các mẫu dung dịch pullulan trên máy LC-20AB, Shimadzu, detector RID-10A, sử dụng cột Ultrahydrogel 250

và 500 của hãng Waters, nhiệt độ cột là 40○C, pha động là dung môi CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M với tốc độ chảy là 1ml/phút Thể tích mẫu tiêm vào cột khoảng 50 μl Xác định thời gian lưu từ phổ đồ GPC (bảng 2,2) Thiết lập đường chuẩn về mối tương quan KLPT và thời gian lưu (hình 2.3)

19

Hình 2.4 Phổ đồ GPC thời gian lưu của mẫu chuẩn Pullulan với KLPT

a) 380.000, b) 23.700 và c) 738 Xác định KLPT của mẫu CTS

Hòa tan CTS trong axit CH3COOH 0,25M với nồng độ 0,3% cho đến khi tan hoàn toàn, thêm muối CH3COONa 0,25M, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m (Millipore filters) Tiến hành tiêm mẫu dung dịch CTS với thể tích khoảng 50 μl vào cột sắc ký Các điều kiện khác tương tự như đã mô tả đối với mẫu chuẩn

a

b

c

20

pullulan Xác định thời gian lưu và so sánh với đường chuẩn để xác định KLPT của mẫu CTS cần đo

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ BIẾN TÍNH CHITOSAN

2.4.1 Phương pháp đề axetyl chitin chế tạo chitosan

Cân 100g chitin đưa vào cốc thủy tinh loại 2 lít, thêm vào 1 lít dung dịch kiềm 50% Trộn đều và lấy mẫu theo thời gian 24, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ Mẫu rửa sạch bằng nước cất đến pH =7 và sấy khô trong tủ quạt gió ở nhiệt độ 60°C trong 2 giờ Nghiền mịn các mẫu để xác định ĐĐA và KLPT

2.4.2 Phương pháp biến tính cắt mạch chitosan

Cho 2 g CTS dạng bột (Mw0 = 91,7 kDa; ĐĐA ~ 91,3%; PI = 2,26) trương trong 10 ml dung dịch H2O2 với các nồng độ khác nhau là 0% (trương trong 10 ml nước), 1%, 3% và 5% (w/v) trong 30 phút Các mẫu sau đó được chiếu xạ γCo60trên thiết bị Gamma Chamber 500, khoảng liều từ 0 - 20 kGy ở nhiệt độ phòng Các mẫu sau khi chiếu xạ được sấy ở nhiệt độ 60°C bằng tủ sấy quạt gió trong 2 giờ sau đó được nghiền thành bột mịn để đo GPC, FT-IR, XRD và UV-Vis

Mẫu chiếu xạ CTS trương trong H2O2 5% ở 10 kGy được tiến hành với các suất liều khác nhau từ 0,45 – 3,6 kGy/h để khảo sát ảnh hưởng của suất liều đến độ suy giảm KLPT

2.5 PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HIỆU ỨNG KHÁNG KHUẨN

0,1 ml dung dịch CTS có Mw khác nhau 30, 45, 60, và 91,7 kDa được thêm nước tiệt trùng đến 10 ml có nồng độ của CTS là 100 mg/l Một thể tích tương tự chứa axit axetic 0,5% được sử dụng làm mẫu đối chứng Các mẫu này được cấy 1

ml huyền phù E coli 108 CFU/ml lắc và khuấy trộn trong 5 phút Những tế bào

E coli còn sống trong mỗi mẫu được xác định tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn

21

đo lường chất lượng 3 – Tp HCM theo phương pháp ISO 16649-2:2001 Hiệu suất kháng khuẩn được tính theo công thức:

, % = 100 × (N 0 – N i )/N 0 (2.8)

Với N 0 và N i là đơn vị hình thành tế bào trên 1 ml (CFU/ml) của E coli trong

mẫu đối chứng và mẫu CTS

Số liệu thí nghiệm được xử lý sơ bộ bằng Microsoft Excel và dữ liệu thống

kê được phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 Sự khác biệt được coi là đáng kể ở mức p < 0,05 Kết quả thí nghiệm được trình bày trong các bảng số liệu là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

22

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 CHẾ TẠO CTS CÓ ĐĐA TỪ 70% ĐẾN 90% Ở NHIỆT ĐỘ PHÕNG

CTS nguồn chế tạo theo quy trình ở mục 2.4.1 được ghi phổ FT- IR trong khoảng số sóng từ 400 đến 4000 cm-1 Dựa trên phổ FT - IR (phụ lục 1), ĐĐA của CTS được tính theo phương trình ở mục 2.3.4 cho kết quả ở bảng 3.1 (với N = 3, α

= 0,05) Mối quan hệ giữa ĐĐA và thời gian đề axetyl được trình bày trên hình 3.1 Kết quả cho thấy CTS có ĐĐA khoảng 70%, dễ dàng thu được sau 72 giờ phản ứng trong điều kiện NaOH 50%, CTS: NaOH 50% = 1:10 (w/v)

Bảng 3.1 Sự thay đổi ĐĐA của CTS theo thời gian phản ứng

ĐĐA, % 7,6 ± 0,3 59,2 ± 0,2 67,2 ± 0,8 69,± 0,7 72,4 ± 0.9 76,3 ± 0,8

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian đề axetyl đến ĐĐA của CTS

Quá trình đề axetyl luôn đi kèm với sự cắt mạch CTS [45] Ở nhiệt độ không đổi, ĐĐA và KLPT CTS phụ thuộc vào thời gian đề axetyl hóa Hình 3.1 cho thấy

23

tốc độ đề axetyl xảy ra khá nhanh ở khoảng 24 đầu giờ đầu của phản ứng Sau 24 giờ, tốc độ đề axetyl xảy ra chậm Sau 48 giờ, ĐĐA của CTS thay đổi hầu nhƣ không đáng kể Nguyên nhân là do nồng độ NaOH giảm sau giai đoạn đầu của quá trình đề axetyl hóa Một nguyên nhân khác là giai đoạn đầu quá trình đề axetyl xảy

ra đối với các nhóm axetyl trên bề mặt của chitin ở dạng vảy, tiếp xúc trực tiếp với NaOH nên tốc độ đề axetyl xảy ra khá nhanh Sau đó, phản ứng đề axetyl xảy ra đối với các nhóm axetyl bên trong vảy chitin rất khó tiếp xúc, đòi hỏi thời gian khuếch tán lâu hơn của NaOH vào lớp bên trong Vì vậy, tốc độ phản ứng đề axetyl hóa xảy ra rất chậm Ngoài ra, do chitin có mạch polyme dài, đan xen, cuộn xoắn che lấp các nhóm chức nên rất khó loại bỏ hoàn toàn nhóm axetyl chỉ sau một lần đề axetyl hóa Tác giả Lê Thị Hải Yến và cộng sự (2003) [7] đã nghiên cứu động học của quá trình đề axetyl chitin Kết quả cho thấy ở nồng độ NaOH 60%, với CTS đã qua xử lý kỹ thuật, phải mất 48 giờ phản ứng ở nhiệt độ phòng mới thu đƣợc CTS có ĐĐA ~ 83% Nếu sử dụng NaOH 40% cho phản ứng đề axetyl hóa thì phải lặp lại quá trình xử lý kỹ thuật nhiều lần và kéo dài thời gian phản ứng lên đến 144 giờ mới thu đƣợc CTS có ĐĐA ~ 97% Trong nghiên cứu của chúng tôi, với nồng độ NaOH 50% sau khoảng 72 giờ phản ứng đã thu đƣợc CTS có ĐĐA ~ 70%

Hình 3.2 CTS có ĐĐA ~ 67% (a); 91% (b) chế tạo từ chitin

24

Để thu được CTS có ĐĐA ≥ 70% cho nghiên cứu, qua tham khảo các tài liệu [7], [45] và tiến hành các phản ứng thử nghiệm chúng tôi đã chế tạo được CTS có ĐĐA khoảng 91% (hình 3.2b) bằng cách thực hiện phản ứng đề axetyl hóa lần 2, điều kiện phản ứng như lần 1, với CTS có ĐĐA ~ 67% (thu được sau 48 giờ phản

ứng ở lần 1 – hình 3.2a) thời gian phản ứng là 2 giờ

3.2 CHẾ TẠO CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

Phương pháp cắt mạch CTS sử dụng đồng thời H2O2 và tia γCo60 là phương pháp thân thiện với môi trường và tỏ ra khá hiệu quả Phương pháp này đã nhận sự quan tâm nghiên cứu và công bố của nhiều tác giả trong thời gian gần đây [12], [13], [15] Bằng phương pháp tiếp cận các phương pháp nghiên cứu hiện đại, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành cắt mạch chitosan bằng kết hợp đồng thời H2O2

và tia γCo60 ở dạng trương nước và khảo sát một số yếu tố có liên quan đến quá trình cắt mạch như nồng độ H2O2 và suất liều bức xạ

Mẫu CTS ban đầu có Mw0 = 91,7 kDa; ĐĐA ~ 91,3%; PI = 2,26 được chúng tôi chế tạo theo quy trình ở mục 3.1, sau khi thu được CTS ĐĐA ~ 67% chúng tôi tiến hành đề axetyl lần 2 với thời gian là 2 giờ FT-IR và sắc kí đồ GPC của CTS ban đầu trình bày ở phụ lục 2

Mẫu CTS (2 g) dạng bột sau khi để trương 30 phút trong 10 ml dung dịch H2O2 với các nồng độ khác nhau là 0% (trương trong 10 ml nước), 1%, 3% và 5% (w/v) được chiếu xạ γCo60

trên thiết bị Gamma Chamber 500, tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt, khoảng liều từ 0 - 20 kGy (3,6 kGy/giờ) ở nhiệt độ phòng Các mẫu sau chiếu xạ được sấy ở nhiệt độ 60°C bằng tủ sấy quạt gió trong 2 giờ, sau đó được phân tích bằng các phương pháp FT-IR, XRD, GPC và UV-vis để xác định KLPT, ĐĐA, cấu trúc và độ kết tinh của CTS cắt mạch