Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ sargassum tại nha trang khánh hòa bằng phương pháp hóa học (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ XUÂN SƠN NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP TỪ RONG MƠ SARGASSUM TẠI NHA TRANG - KHÁNH HỊA BẰNG PHƢƠNG PHÁP HĨA HỌC TĨM TĂT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 KHÁNH HÒA - 2018 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Vũ Ngọc Bội TS Nguyễn Duy Nhứt Phản biện 1: GS.TS Trần Thị Luyến Phản biện 2: TS Khổng Trung Thắng Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Hữu Đại Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp Trường Đại học Nha Trang vào hồi ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Nha Trang TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Sargassum Nha Trang - Khánh Hịa phương pháp hóa học Chun ngành: Cơng nghệ Chế biến thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: ThS Lê Xuân Sơn Khóa: 2011 Ngƣời hƣớng dẫn: 1) PGS TS Vũ Ngọc Bội Đại học Nha Trang 2) TS Nguyễn Duy Nhứt Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án thu số kết bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất fucoidan fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ: 1) Luận án khảo sát hàm lượng fucoidan từ loài rong mơ Sargassum thu mẫu vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy rong mơ S polycystum có hàm lượng fucoidan (so với hàm lượng chất khô) cao đạt mức 3,54 ± 0,02%, thứ tự hàm lượng fucoidan giảm dần loài rong: S oligocystum với hàm lượng 3,23 ± 0,02%, S swartzii với hàm lượng 2,94 ± 0,01%, S deticarpum với hàm lượng: 2,04 ± 0,00%, S mcclurei với hàm lượng 1,34 ± 0,06% 2) Luận án xác định điều kiện tối ưu hóa cho q trình chiết fucoidan từ rong S polycystum: chiết dung dịch HCl 2M tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 16/1, pH tối ưu dung môi chiết 3,4, nhiệt độ chiết tối ưu 770C, thời gian chiết tối ưu 48 phút phương thức chiết sử dụng xay - chiết với hiệu suất chiết đạt 84,17% 3) Luận án xác định điều kiện thích hợp cho q trình phân cắt fucoidan tự nhiên từ rong S polycystum tạo thành fucoidan khối lượng phân tử thấp (Khối lượng phân tử ≤100kDa) có hoạt tính làm giảm lipid máu: phân cắt hỗn hợp H2O2/ascorbic acid với nồng độ tối ưu 37,5/37,5 (mmol/mmol, nhiệt độ tối ưu 680, thời gian cắt mạch tối ưu 96 phút hiệu suất cắt mạch đạt 85,18% 4) Luận án đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn sản phẩm FKLPTT từ rong S polycystum cho thấy liều dùng F-KLPTT 2580 mg/kg/ngày sử dụng liên tục ngày sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp khơng gây độc với chuột thí nghiệm, liều dùng 1.400mg/kg khối lượng/ngày thời gian 90 ngày không gây ảnh hưởng tới trạng thái sinh lý chuột lang thí nghiệm 5) Luận án đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu fucoidan khối lượng phân tử thấp từ 05 loài rong mơ (S polycystum, S oligocystum, S mcclurei, S denticarpum, S swartzii) phân đoạn có khối lượng phân tử 10÷100kDa phân đoạn có khối lượng phân tử nhỏ 10kDa cho thấy fucoidan khối lượng phân tử thấp 10÷100kDa từ 03 lồi S polycystum, S oligocystum, S mcclurei có hoạt tính làm giảm lipid máu chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm 6) Luận án xác định cấu trúc fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S polycystum sinh trưởng vịnh Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy cấu trúc mảnh đại diện phân đoạn là: fuc-uro-hexSO3H-hex 7) Luận án nghiên cứu sản xuất thử nghiệm sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S polycystum sinh trưởng vịnh Nha Trang - Khánh Hòa Kết đánh giá sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp sản xuất theo quy trình luận án đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm tiêu kim loại nặng vi sinh vật CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS TS Vũ Ngọc Bội NGHIÊN CỨU SINH TS Nguyễn Duy Nhứt Lê Xuân Sơn MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Rong mơ có chứa nhiều hợp chất sinh học có giá trị dược dụng cao Trong số đó, fucoidan polysaccharid có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị hoạt tính chống đơng máu, kháng khuẩn, kháng vi rút, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, miễn dịch có hoạt tính làm giảm lipid máu Nhiều kết nghiên cứu chứng minh fucoidan khối lượng phân tử thấp (F- KLPTT) có hoạt tính sinh học đặc biệt hoạt tính làm giảm lipid máu cao so với fucoidan phân tử lượng lớn Từ fucoidan tự nhiên, người ta phân cắt thành (F- KLPTT) Q trình phân cắt fucoidan thực số phương pháp khác phương pháp enzyme, phương pháp hóa học Trong đó, phương pháp phân cắt fucoidan phương pháp hóa học sử dụng tác nhân H2O2 kết hợp với axit ascorbic chứng minh không ảnh hưởng đến cấu trúc tự nhiên fucoidan Vùng biển Nha Trang coi vùng biển ấm có nguồn lợi rong mơ Sargassum đa dạng thành phần loài với trữ lượng lớn có chứa fucoidan với hàm lượng cao Hiện có số cơng trình cơng bố nghiên cứu fucoidan từ rong mơ thu mẫu vùng biển Nha Trang Tuy vậy, chưa có cơng trình cơng bố fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Nha Trang - Khánh Hòa Do việc tiến hành nghiên cứu fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Khánh Hòa làm sở cho việc phát triển thương mại hóa sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức hướng nghiên cứu cần thiết có triển vọng Chính thế, luận án thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Sargassum Nha Trang - Khánh Hòa phương pháp hóa học” Mục đích luận án Xây dựng qui trình sản xuất fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu phương pháp hóa học từ nguyên liệu rong mơ Khánh Hòa Nguyên vật liệu phạm vi nghiên cứu 3.1 Nguyên vật liệu + Nguyên liệu rong: 05 loài rong mơ S polycystum, S oligocystum, S mcclurei, S denticarpum, S swartzii thu mẫu vùng biển Nha Trang - Khánh Hịa + Chuột thí nghiệm: Chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300 ÷ 350g/con sử dụng để đánh giá độc tính hoạt tính làm giảm lipid máu sản phẩm FKLPT Chuột lang Viện Vaccine Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp 3.2 Phạm vi nghiên cứu 1) Đánh giá hàm lượng fucoidan 05 loài rong mơ: S polycystum, S mcclurei, S oligocystum, S swartzii, S denticarpum thu mẫu vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa 2) Nghiên cứu điều kiện tối ưu tách chiết fucoidan tự nhiên từ lồi rong mơ Sargassum có hàm lượng fucoidan cao 05 loài đánh giá 3) Nghiên cứu điều kiện tối ưu cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu tác nhân hỗn hợp hydrogen peroxide axit ascorbic 4) Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn fucoidan khối lượng phân tử thấp thu nhận chuột thí nghiệm 5) Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu phân đoạn fucoidan khối lượng phân tử thấp chuột thí nghiệm 6) Phân tích đặc trưng cấu trúc fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu 7) Đề xuất quy trình sản xuất thử sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp phân tích đại Việt Nam giới: Xác định hàm lượng fucoidan phương pháp so màu Dische Shettles thiết bị ELISA MR96A (Mindray); Xác định thành phần đường đơn fucoidan phương pháp sắc ký khí thơng qua phản ứng axetyl hóa sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật Nguyễn Duy Nhứt cộng máy GC17A Shimadzu FID; Các phương pháp định cấu trúc fucoidan: Phổ 1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) fucoidan đo máy Bruker AVANCE 500, Phổ hồng ngoại IR đo máy IMPACT 410 hãng NICOLET (Mỹ), Phổ ESI-MS đo thiết bị LC/MSD ion trap 1100 Viện Hố Học Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn hoạt tính làm giảm lipid máu (FKLPTT) chuột thí nghiệm Đồng thời, luận án sử dụng phương pháp tốn học tối ưu hóa q trình thí nghiệm nhằm đảm bảo kết thí nghiệm có độ tin cậy cao Các kết thí nghiệm xử lý thống kê, kiểm định so sánh giá trị trung bình nhóm phần mềm MS Excel 2010, SPSS 18 Phân tích liệu tiên đoán bề mặt đáp ứng phần mềm Modde 5.0 Kết cấu luận án Luận án bao gồm 170 trang, đó: mở đầu: trang, tổng quan: 36 trang, phương pháp nghiên cứu: 23 trang, kết nghiên cứu: 84 trang, kết luận kiến nghị: trang, danh mục cơng trình cơng bố luận án: trang, tài liệu tham khảo 21 trang Luận án có 35 bảng, 86 hình, 164 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 13 tài liệu, tiếng Anh: 151 tài liệu) phụ lục CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RONG MƠ 1.1.1 Phân loại rong mơ Ở Việt Nam, có khoảng 147 lồi rong nâu, lồi rong thuộc chi Sargassum (rong mơ) có trữ lượng lớn với khoảng 68 loài phân bố phổ biến vùng ven biển đảo Riêng Khánh Hòa, sản lượng khai thác rong mơ tự nhiên ước tính khoảng 7.300 khơ/năm diện tích phân bố 1.167 Rong mơ Sargassum phân loại: Ngành Phaeophyta; Lớp: Phaeophyceae; Bộ: Fucales; Họ: Sargassaceae; Chi: Sargassum 1.1.2 Cấu trúc thành tế bào rong nâu Thành phần thành tế bào rong nâu chủ yếu cellulose cấu tạo từ phân tử glucose liên kết với nhờ liên kết β-(1-4)-glucoside Fucoidan tồn cấu trúc thành tế bào rong nâu trạng thái tự tạo cầu nối phân tử cellulose alginate liên kết hydro 1.2 GIỚI THIỆU VỀ FUCOIDAN 1.2.1 Fucoidan hoạt tính sinh học Fucoidan thuật ngữ gọi tên cho sulfate polysaccharid có cấu tạo bao gồm 02 thành phần L-fucose gốc sulfate tồn thành tế bào rong nâu Trong cấu trúc phân tử fucoidan cịn có gốc đường đơn khác galactose, glucose, manose, xylose,… axit uronic Hàm lượng fucoidan khoảng từ ÷ 10% so với khối lượng rong khơ, tồn cấu trúc thành tế bào không bào rong nâu, khối lượng trung bình khoảng kDa đến 22.000 kDa tùy thuộc vào loài, điều kiện môi địa lý, thời gian thu hoạch rong Hoạt tính sinh học tiềm ứng dụng fucoidan đa dạng, tùy thuộc vào loài rong nâu, đặc tính cấu trúc, KLPT,… Fucoidan có khả hỗ trợ điều trị nhiều chứng bệnh kháng rối loạn lipid máu bệnh vữa xơ động mạch, chống béo phì, kháng ung thư, điều trị gan, tăng cường hệ miễn dịch, chữa bệnh dày, kháng viêm, chống đơng máu, kiểm sốt đường huyết, 1.2.2 Tình hình nghiên cứu fucoidan Việt Nam Ở Việt Nam, fucoidan nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nghiên cứu khoảng 10 năm trở lại Nhìn chung, tình hình nghiên cứu fucoidan từ rong nâu Việt Nam chưa nhiều, cơng bố hoạt tính sinh học thử nghiệm với hoạt tính gây độc tế bào, số đặc tính cấu trúc fucoidan số lồi rong cơng bố Đặc biệt, việc nghiên điều F- KLPTT từ loài rong mơ thu mẫu Nha Trang Khánh Hòa hoạt tính F- KLPTT chưa nghiên cứu công bố CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU * Rong mơ nguyên liệu: sử dụng loài rong mơ S polycystum, S oligocystum, S mcclurei, S denticarpum, S swartzii thu mẫu vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa * Động vật thử nghiệm: chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300÷350g/con sử dụng để đánh giá độc tính hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu sản phẩm F- KLPTT đề tài nghiên cứu 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Các phƣơng pháp phân tích - Định lƣợng fucoidan: phương pháp Dische Shettles (1948), fucose sử dụng làm chất chuẩn - Phƣơng pháp xác định thành phần đƣờng đơn fucoidan: phương pháp sắc ký khí thơng qua phản ứng axetyl hóa sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật Nguyễn Duy Nhứt cộng (2007) - Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sulfat axít uronic: Hàm lượng sulfate axit uronic phân tử fucoidan xác định theo phương pháp Scott - Phƣơng pháp phân tích đặc tính cấu trúc fucoidan: + Phổ hồng ngoại (IR) + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) + Phổ khối lượng MS 2.2.2 Định lƣợng vi sinh vật - Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (KL/ g) theo TCVN 4884: 2005 - Xác định Coliforms theo TCVN 6846: 2007 - Xác định E coli theo TCVN 6848: 2007 - Xác định S aureus theo TCVN 4830-1: 2005 - Xác định C perfringens theo TCVN 4991: 2005 - Xác định Salmonella theo TCVN 8342: 2010 - Xác định V parahaemolyticus theo TCVN 7905-1: 2008 - Xác định tổng số bào tử NM - NM (BT/g) theo TCVN 5166: 1990 2.2.3 Định lƣợng số thành phần khác - Xác định độ ẩm theo TCVN 3700: 1990 - Xác định thủy ngân (Hg) theo TCVN 7604: 2007 - Xác định Cadmi (Cd) theo TCVN 7603: 2007 - Xác định chì (Pb) theo TCVN 7602: 2007 - Xác định Arsen (As) theo TCVN 7601: 2007 - Xác định thiết (Sn) theo TCVN 7788: 2007 - Xác định Methyl thủy ngân theo AOAC 988.11 2.2.4 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát thể hình 2.1 Rong nguyên liệu Đánh giá: Hàm lượng fucoidan Xử lý Cắt nhỏ Sấy khơ Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện tách chiết fucoidan Lựa chọn loại rong Chiết Lọc lần Bã rong Dd CaCl2 bão hòa Kết tủa aginate canxi (pH=6,5) Lọc lần Tạp chất Lọc lần Ethanol 96% Kết tủa fucoidan thô Ly tâm Sấy Đánh giá: Thành phần hóa học Fucoidan tự nhiên Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPT thấp Cắt mạch Phân đoạn Đánh giá chất lượng: - Thành phần hóa học - Độc tính sản phẩm - Hoạt tính làm giảm lipid máu - Đặc tính cấu trúc Fucoidan KLPT thấp Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Trên sở sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát tiến hành nghiên cứu xác định thông số phù hợp cho công đoạn CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG FUCOIDAN CĨ TRONG 05 LỒI RONG MƠ SARGASSUM THU MẪU TẠI KHÁNH HÕA Kết nghiên cứu Luận án cho thấy hàm lượng fucoidan thu nhận từ loài S polycystum tương ứng 3,54±0,02%, cao 05 loài rong mơ Sargassum khảo sát, thấp loài rong S mcclurei (1,34±0,01%) Do vậy, loài rong S polycystum luận án lựa chọn làm nguyên liệu cho trình nghiên cứu thu nhận F-KLPTT ứng dụng hỗ trợ điều trị làm giảm lipid máu 3.2 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT FUCOIDAN TỰ NHIÊN TỪ RONG MƠ S POLYCYSTUM 3.2.1 Xác định phƣơng thức chiết fucoidan Nghiên cứu Luận án cho thấy sử dụng phương thức xay - chiết với tốc độ quay dao 750 vòng/phút suốt trình chiết cho phép thu fucoidan từ rong S polycystum với hiệu suất chiết 25,84±0,03% cao gấp 1,53 lần so với sử dụng phương thức ngâm chiết cho phép thu fucoidan từ rong S polycystum với hiệu suất 16,85±0,07% Do vậy, phương thức xay – chieetss Luận án lựa chọn để nghiên cứu tối ưu hóa q trình chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum 3.2.2 Xác định tỉ lệ dung môi: nguyên liệu rong (DM/NL) Kết nghiên cứu Luận án cho thấy hiệu suất chiết fucoidan từ rong S polycystum tăng tỉ lệ DM/NL tăng khoảng từ 8/1 (v/w) đến 16/1 (v/w) đạt giá trị cao tỉ lệ DM/NL 16/1(v/w), tương ứng với hiệu suất chiết 29,10±0,29% Với tỷ lệ DM/NL lớn giá trị 16/1, hiệu suất chiết fucoidan tăng khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Do vậy, Luận án lựa chọn tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu rong 16/1 (v/w) làm thông số cố định cho trình nghiên cứu chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum 3.2.3 Xác định pH dung môi chiết Nghiên cứu Luận án cho thấy khoảng khảo sát pH có giá trị từ ÷ 9, hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum đạt giá trị cao 42,94±1,86% pH giá trị thấp pH Do vậy, pH luận án lựa chọn làm thông số cố định cho nghiên cứu chọn khoảng pH ÷ làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa q trình chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum 3.2.4 Xác định nhiệt độ chiết Nghiên cứu Luận án cho thấy khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C, nhiệt độ thích hợp cho q trình chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum 800C Vì vậy, luận án lựa chọn nhiệt độ 800C thông số cố định cho trình nghiên cứu chiết chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum chọn khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C làm thơng số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa q trình chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum 3.2.5 Xác định thời gian chiết Kết nghiên cứu Luận án cho thấy khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 phút, hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum đạt giá trị cao 82,67% thời gian gian chiết 50 phút Vì vậy, luận án lựa chọn khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 làm thơng số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa q trình chiết fucoidan từ rong mơ S polycystum 3.7 TỐI ƢU HĨA CƠNG ĐOẠN CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN THÀNH FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP Từ kết nghiên cứu xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình cắt mạch fucoidan, Luận án lựa chọn thông số biên cho q trình nghiên cứu tối ưu cơng đoạn cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT nhiệt độ (U1): 50 ÷ 90 (0C); thời gian (U2): 75 ÷ 105 (phút); nồng độ H2O2/ascorbic acid (U3): 30/30 ÷ 40/40(mmol/mmol) Hàm mục tiêu - Hiệu suất cắt mạch fucoidan tạo thành F-KLPTT, kết thực nghiệm trình bày bảng 3.2 Giải toán quy hoạch thực nghiệm phần mềm Modde 5.0 thu phương trình hồi quy thể hiệu suất cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT sau: Y = 82,16 – 0,67X1 + 0,93X2 + 11,36X3 – 2,59X12 – 1,62X22 – 11,41X32 Bảng 3.2 Hiệu suất cắt mạch fucoidan điều kiện khác Số TN U1 U2 U3 X1 X2 X3 50 75 30 -1 -1 -1 Y 55,08 90 75 30 -1 -1 53,98 50 105 30 -1 -1 56,99 90 105 30 1 -1 54,63 50 75 40 -1 -1 77,94 90 75 40 -1 75,84 50 105 40 -1 1 79,88 90 105 40 1 77,78 50 90 35 -1 0 79,17 10 90 90 35 0 80,11 11 70 75 35 -1 79,21 12 70 105 35 82,02 13 70 90 30 0 -1 59,39 14 70 90 40 0 82,25 15 70 90 35 0 81,75 16 70 90 35 0 81,58 17 Investigation: Thuy phan (MLR) 90 35 70 Response Surface Plot Hieu s uat Investigation: Thuy phan (MLR) Response Surface Plot Hieu s uat Nhietdo = 70 82,83 Investigation: Thuy phan (MLR) Response Surface Plot Hieu sThoigian uat = 90 Hình 3.3 Mặt đáp tối ƣu thực nghiệm yếu tố tới hiệu suất cắt mạch fucoidan tụ nhiên tạo F- KLPTT 12 Kết tối ưu điều kiện cắt mạch fucoidan tạo thành fucoidan KLPTT: Nhiệt độ 680C, thời gian 96 phút nồng độ H2O2/ascorbic acid 37,5/37,5 (mmol/mmol) 3.8 ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI CỦA SẢN PHẨM FUCOIDAN KLPTT TỪ RONG MƠ S POLYCYSTUM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN Kết phân tích HPLC sản phẩm F-KLPTT bảo quản nhiệt độ 40C biến đổi thời gian 24 tháng thể hình 3.4 hình 3.5 Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT sau thời điểm ban đầu 24 tháng bảo quản nhiệt độ 40C Kết phân tích HPLC sản phẩm F-KLPTT bảo quản điều kiện bình thường nhiệt độ phịng thể hình 3.6 ÷ 3.19 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 11 Hình 3.11 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 13 Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC Hình 3.13 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 15 F-KLPTT tháng thứ 17 Hình 3.14 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 19 13 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 20 Hình 3.16 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTTtại tháng thứ 21 Hình 3.18 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 23 Hình 3.17 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 22 Hình 3.19 Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT tháng thứ 24 Fucoidan KLPTT bảo quản nhiệt độ 40C khơng có biến đổi thời gian 24 tháng, fucoidan KLPTT bảo quản điều kiện bình thường thời điểm tháng thứ 19, sắc ký đồ xuất peak mới, chứng tỏ xảy phân rã 3.9 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN TẠO THÀNH F- KLPTT Quy trình cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT trình bày hình 3.20 Thuyết minh quy trình: * Chuẩn bị dung dịch fucoidan 1%: Hịa tan fucoidan tự nhiên thu từ quy trình thu nhận fucoidan từ rong mơ Sargassum nước cất lần, đạt nồng độ dung dịch fucoidan 1% * Cắt mạch: sử dụng thiết bị khuấy từ có gia nhiệt để cắt mạch fucodidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT Quá trình cắt mạch thực điều kiện tối: nhiệt độ 680C, nồng độ H2O2/ascorbic acid 37,5/37,5 (mmol/mmol) thời gian cắt mạch 96 phút * Bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid: bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid dung dịch tiến hành điều chỉnh pH hỗn hợp 6,5 dd NaOH 30% * Lọc rây phân tử kích thƣớc 100kDa: phân đoạn phân tử fucoidan hệ thống lọc rây phân tử có kích thước rây 100kDa, dung dịch fucoidan KLPT chia làm phần Phần dung dịch chứa fucoidan có KTPT lớn 100kDa cho quay lại công đoạn cắt mạch điều kiện nồng độ H2O2/ascorbic 37,5mmol/37,5mmol, nhiệt độ: 680C thời gian 96 phút Phần dung dịch fucoidan có KTPT nhỏ 100kDa tiếp tục qua hệ thống lọc rây phân tử kích thước lọc 10kDa * Lọc rây phân tử kích thƣớc 10kDa: dung dịch fucoidan KLPTT có KTPT nhỏ 100kDa qua hệ thống lọc rây phân tử có kích thước 10kDa 14 * Kết tủa ly tâm fucoidan KLPTT: kết tủa fucoidan KLPTT phân đoạn ethanol 96% Tiến hành ly tâm thu kết tủa fucoidan KLPTT gồm 02 phân đoạn: fucoidan KLPTT có KLPT khoảng (10 ÷ 100kDa] fucoidan KLPTT có KLPT nhỏ 10kDa * Sấy: Tiến hành sấy fucoidan KLPTT điều kiện nhiệt độ sấy 650C thời gian sấy 12 giờ, thu nhận 02 sản phẩm fucoidan KLPTT: fucoidan KLPTT có KLPT lớn 10kDa fucoidan có KLPT nhỏ 10kDa Dd fucoidan 1% + H2O2/ascorbic:37,5mmol/37,5mmol + Nhiệt độ:680C + Thời gian:96 phút Cắt mạch Bất hoạt H2O2/ axit ascorbic Lọc rây phân tử kích thước100kDa Dd fucoidan KLPT≤100kDa Dd fucoidan KLPT>100kDa Lọc rây phân tử kích thước10kDa Dd fucoidan KLPT≤10kDa Dd fucoidan KLPT>10kDa Kết tủa ly tâm fucoidan KLPT thấp Fucoidan KLPT≤10kDa Fucoidan KLPT>10kDa + Nhiệt độ:650C + Thời gian:12 Sấy Fucoidan KLPT≤10kDa Fucoidan KLPT>10kDa Hình 3.20 Quy trình phân cắt fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT 3.10 CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SẢN PHẨM FUCOIDAN KHỐI LƢƠNG PHÂN TỬ THẤP 3.10.1 Thử nghiệm sản xuất fucoidan khối lƣợng phân tử thấp Kết nghiên cứu Luận án cho thấy sản phẩm fucoidan KLPTT sản xuất từ fucoidan tự nhiên thu nhận từ 05 loài rong mơ Sargassum có khối lượng phân tử trung bình nằm khoảng 10kDa